Summary
Den polysackarid kapseln är primära virulens faktorn i Cryptococcus neoformans, och dess storlek korrelerar med stam virulens. Kapselns diameter mätningar används i fenotypiska test och att mäta terapeutisk effekt. En standardmetod för kapsel induktion presenteras här, och två metoder för färgning och mäta diameter jämförs.
Abstract
Den polysackarid kapseln av Cryptococcus neoformans är primära virulens faktor och en av mest studerade vanligaste aspekter av denna patogena jäst. Kapselns storlek kan variera kraftigt mellan stammar, har förmågan att växa snabbt när introducerade stressande eller låg näringsrika förhållanden och har varit positivt korrelerad med stam virulens. Av dessa skäl är storleken på kapseln av stort intresse för C. neoformans forskare. Tillväxten av C. neoformans kapseln induceras under fenotypiska test för att förstå effekterna av olika behandlingar på jäst eller storlek skillnader mellan stammar. Här beskriver vi en av standardmetoderna för kapsel induktion och jämför två godkända metoder för färgning och mäta kapsel diameter: (i) Indien bläck, en negativ fläcken, används i samband med konventionella ljusmikroskopi och (ii) Co färgning med fluorescerande färgerna av både cellväggen och kapsel följt av konfokalmikroskopi. Slutligen visar vi hur mätning av kapsel diameter från Indien färgfläckade prover kan vara automatiserad använder computational bildanalys.
Introduction
Som drabbar en kvarts miljon människor varje år och leder till mer än 180 000 dödsfall årligen, är Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulära jäst och vilka smittämnen av kryptokockos1,2, 3. hårdast är HIV-positiva patienter i fattiga länder som inte har tillgång till antiretroviral behandling, vilket gör dem mycket mottagliga för den sjukdom4,5,6. Data från CDC visar att i subsahariska Afrika, C. neoformans dödar fler människor än tuberkulos årligen och mer varje månad än någon ebolautbrottet på posten1. Vanligaste exponeringsvägen uppstår från att andas in desiccated sporer som är vardagsmat i den miljö7. Ovanför inlåtande lungorna, finns det flera virulensfaktorer som bidrar till framgång för C. neoformans inom infekterade individer. Polysackarid kapseln anses mikrobs primära virulens faktor, som acapsular stammar inte är virulent8.
Cryptococcal kapseln består av tre principen komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), och mannoproteins (MPs)9. MPs är en relativt liten cellväggen-associerade komponent i kapseln, de är immunogena och kan främja en mestadels pro-inflammatoriska svar9,10. Däremot GXM och GalXM utgör huvuddelen av kapseln (> 90% av vikten) och har immunsuppressiva effekter11. Förutom dess immunmodulerande effekter skapar den snabba utvidgningen av kapsel i vivo en mekanisk barriär ingestion av värd Fagocytos celler (dvs, neutrofiler och makrofager)12. C. neoformans kapseln och dess syntes är komplexa, men sammantaget ökade kapsel diameter är korrelerad med ökad virulens6,13,14. Mot denna bakgrund är det viktigt för C. neoformans forskare att kunna snabbt och exakt kvantifiera kapsel mätningar.
Både C. neoformans cellen och dess polysackarid kapsel är dynamiska strukturer och visa förändringar över tid15. Kapseln kan ändra i densitet, storlek och montering som svar på förändringar i den mottagande miljö16,17,18. Lågt järn eller näringsnivå, exponering för serum, människans fysiologiska pH och ökade CO2 är kända för att initiera kapsel tillväxt16,18,19,20. Dessutom har forskarna visat strukturförändringar som resulterar i betydande skillnader i immunoreaktivitet under en infektion, utlåning en fördel till C. neoformans över dess värd21,22. Detta är känt eftersom arkitekturen av C. neoformans kapseln har analyserats i en mängd olika sätt. Elektronmikroskopi, exempelvis har avslöjat att kapseln har en heterogen matris med ett inre elektron-täta lager under en yttre, mer genomsläppliga lager23. Ljusspridning och användning av optisk pincett låtit forskare att ytterligare klarlägga dess makromolekylära boenden24. Analysera resultaten från både statiska och dynamiska ljusspridning mätningar, vet vi att den polysackarid kapseln har en komplex förgrenade struktur23. Optisk pincett har använts för att testa styvhet struktur samt utvärdera dess antikropp reaktivitet24. Särklass mest ofta sysselsatta analys av C. neoformans kapseln är dock mätningen av dess storlek.
För att kvantifiera kapsel storlek, forskare använder vad som borde vara en enkel mätning: linjär diametern på kapseln. Digitala Mikroskop används för att fånga bilder av flera C. neoformans celler (allmänt hundratals) färgas med tusch eller fluorescerande färgämnen. Varje cell kropp och omgivande kapsel storlek mäts. Uppgifterna sammanställs, och den genomsnittliga diametern av kapseln beräknas genom att subtrahera cellkroppen diameter från hela cellen diameter (cell kropp + kapsel). Fram till denna punkt, har dessa mätningar gjorts manuellt. Medan generellt korrekt, har denna metod nackdelar för forskare. Stora datamängder kan ta dagar eller veckor att analysera för hand. Och eftersom dessa mätningar sker manuellt, subjektivitet och mänskliga misstag kan påverka resultatet.
Automatiserad computational bildanalys har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare inom många områden i molekylär cellbiologi, möjliggör snabbare och mer tillförlitlig analys av biologiska bilder 25,26,27. Exakt bild analystekniker är nödvändiga att gruvan kvantitativ information från vad är ofta komplexa och enorma datamängder. Vissa mätningar, särskilt mätning av C. neoformans kapsel, har dock svårt att automatisera. Att korrekt identifiera gränssnittet mellan cellväggen och kapsel, som allmänt visas som en mörk ring när fotograferad av faskontrast mikroskopi, kan vara besvärligt att lösa med hjälp av ett enkelt tröskelvärde. Ytterligare, C. neoformans celler i kultur tenderar att klumpa ihop och korrekt segmentering av cellerna är nödvändigt för noggranna mätningar.
Syftet med detta projekt var att a illustrera en av standardprotokollen för kapsel induktion i C. neoformans, (ii) jämför och kontrast India färgpulver och fluorescens färgning som de tillhör för att kapsel diameter mätningar, (iii) utveckla enkla, kalkylmässiga metoder att mäta kapsel diameter använder bilder av India färgpulver färgade celler med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys, och, (iv) bedöma fördelar och begränsningar för att mäta kapsel diameter manuellt och använda programvara automation. Vi finner att av de två färgning metoderna, fluorescerande märkning av cellväggen och kapsel, medan mer tidskrävande, gav de mest konsekventa resultat mellan experiment. Men båda metoderna aktiverat oss att framgångsrikt skilja mellan lab och kliniska C. neoformans kapsel stammar uppvisar olika storlekar. Vidare kunde vi automatisera mätning av kapsel diameter från India färgpulver målat bilder och fann att detta var ett lönsamt alternativ till manuell mätning av kapsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: C. neoformans är en patogen som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) och forskare som arbetar med det måste vidta lämpliga försiktighetsåtgärder. Detaljerade förfaranden på hur att säkert arbete med BSL-2 patogener kan hittas på Center for Disease Control (CDC) webbplats, men det är viktigt att notera att alla personer som kommer i kontakt med C. neoformans ordentligt bör utbildas i hanteringen patogena agens och bör alltid bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), allmänt latex eller nitrilhandskar. Rotorerna på centrifuger bör dessutom förseglas för att förhindra aerosolization av prover och eventuella spill som rensade upp omedelbart med en 10% blekmedel lösning28.
1. kapsel induktion
Obs: Alla åtgärder ska utföras vid rumstemperatur om inget annat anges.
- Kultur C. neoformans i jäst pepton dextros (YPD) buljong (pH 6.5 +/-0,2) och inkubera vid 37 ° C under skakning tills de är i loggen fas (ca 18-36 h).
- Centrifugera celler på 870 x g för 5 min vid 21 ° C och tvätta tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Använd en hemocytometer (eller en automatiserad cell counter) för att räkna cellerna och resuspendera på 2 x 105 celler/2 mL i Dulbecco's minimal väsentliga media (DMEM).
- För att inducera kapseln, inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 18 h.
Obs: Kombinationen av avsaknad av näringsämnen i media och förekomsten av CO2 stimulerar C. neoformans kapsel tillväxt. - Efter inkubation, skörda cellerna genom centrifugering (som ovan) och ta bort alla utom 5 – 10 µL supernatant. Samtidigt, skörda ett motsvarande un-inducerad cell prov för varje stam skall mätas. Använd dessa som negativa kontroller.
Obs: Cell pellets kommer att vara mycket små och kan vara svåra att se. Var försiktig när Aspirera supernatanten. - Fläcken med tusch (avsnitt 2.1) eller fluorescerande färgämnen (avsnitt 2.2).
2. färgning
-
Färgning med bara tusch
- För att färga jästen med tusch, återsuspendera pelleten i återstående supernatanten och lägga till 4μL (ungefär hälften) av cellsuspensionen och 4μL av Indien bläck på ett glas objektglas. Blanda försiktigt och undvika skumbildning.
- Applicera ett 13-mm täckglas (nr 1.5 tjocklek) och försegla kanterna med en giftfri tätningsmedel (genomskinligt nagellack) till förhindrar uttorkning av provet.
-
Färgning med endast fluorescerande färgämnen
- För att färga jästen med ett fluorescerande färgämne, Återsuspendera cellpelleten i 50 µL PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA).
- Inkubera kulturen med en lika stor volym av Calcofluor vit (CFW) (1 µg/mL) och kapsel mAb 18B7 (se Tabell för material) konjugerat till AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) under 30 minuter vid 37 ° C.
- Centrifugera celler på 870 x g för 5 min vid 21 ° C efter inkubation och sug ut supernatant.
- Återsuspendera cellpelleten i 10 µL PBS med 1% bovint serumalbumin (BSA).
- Pipettera 8 µL cellsuspension på ett glas objektglas.
- Applicera ett 13-mm täckglas (nr 1.5 tjocklek) och försegla kanterna med en giftfri tätningsmedel (genomskinligt nagellack) till förhindrar uttorkning av provet.
-
Färgning med både tusch och fluorescerande färgämnen
- Att mer direkt jämföra effekten av India färgpulver färgning med fluorescerande färgämnen, Co fläcken samma cell befolkningen med båda typerna av fläcken. Gör först Inkubera cellerna med både en fluorescerande kapsel och cellväggen fläcken, enligt steg 2.2.1 - 2.2.3.
- Nästa, pipett lika volymer (4 µL) av fluorescently betsad cellsuspension och Indien bläck på en glasskiva. Blanda försiktigt.
- Applicera ett 13-mm täckglas (nr 1.5 tjocklek) och försegla kanterna med en giftfri tätningsmedel (genomskinligt nagellack) till förhindrar uttorkning av provet.
3. bild förvärv/mikroskopi
-
Imaging cellerna färgas med tusch.
- Skaffa bilder med hjälp av en standard ljusmikroskop (100 X förstoring).
- Bilden minst 50 celler per tillstånd.
Anmärkning: Antalet celler per fält kommer att variera, och detta är acceptabelt. Det är viktigt, men att överlappande celler hållas på ett minimum, eftersom dessa är svåra att mäta (både manuellt och med automatiserad programvara). För dessa experiment förvärvades bilder på ett djup av 16 bitar med exponering gånger optimerad för att maximera bildens kontrast och minimera oskärpa orsakad av små rörelser av cellerna.
-
Imaging cellerna färgas med fluorescerande färgämnen
- För att bild cellerna av fluorescensmikroskopi, öppna mikroskopet bildhanteringsprogram och välj lämplig excitation och utsläpp våglängder för den fluorophores som används (CFW och AF488 är glada med 405nm och 488 nm ljus, respektive). Hämta bilder med fluorescens Mikroskop.
- Bilden minst 50 celler per tillstånd.
Anmärkning: Antalet celler per fält kommer att variera, och detta är acceptabelt. Det är viktigt, men att överlappande celler hållas på ett minimum eftersom dessa är svåra att mäta (både manuellt och med automatiserad programvara). - Förvärva en z-stack bilden serie av cellerna för att säkerställa att den maximala kapslarna diametern för varje cell inom ett visst område erhålls.
- I mikroskopet kontroll mjukvaran, klicka på fältet ”z-stack” att öppna ”z-stack” Kontrollpanelen och sedan välja alternativet ”första/sista” i det övre vänstra hörnet av panelen.
- Använd kontrollen böter-fokus på mikroskopet att fokusera på en nivå som understiger den bredaste punkten av en enda jästcellen och kapslarna för alla inom nuvarande synfältet och klicka på ”Ställ in första”.
- Använd kontrollen böter-fokus att fokusera ovanför den bredaste punkten på cellkroppen av samma cell och kapseln för alla celler inom nuvarande synfältet och klicka ”ange sista”.
- Klicka på ”Starta Experiment” på fliken ”förvärv” att förvärva z-stacken för den aktuella positionen. Upprepa processen på flera positioner tills z-stack bilder av minst 50 celler har förvärvats.
Obs: För dessa experiment, confocal pinhole var satt till 1.0 AU och en överlappande z-serie av 10-20 skivor som täcker 0,7 µM varje förvärvades på markerade positioner. AU = luftiga enhet.
- Nästa, konvertera varje z-stack serie till maximal intensitet prognoser (MIP) med lämplig bild analys programvara.
Obs: MIPs projektet största intensiteten på varje planet av staplade bild29. Att skapa MIPs gör att man kan producera en 2D representation av bilder som motsvarar den maximala cellen och kapsel diameter inom fångade 3D-stacken.
-
Imaging celler fläckade både tusch och fluorescerande färgämnen
- Förvärva bilder med hjälp av antingen en widefield (40 X förstoring) eller confocal Mikroskop (63 X eller 100 X förstoring). För celler fläckade både tusch och fluorescerande färgämnen, fånga bilder med widefield Mikroskop utrustat med en datorstyrd scen och oljeimmersionsobjektivet.
Obs: Mikroskopet används bör styras med ett bildprogram CFW. fluorescens som är upphetsad genom en 340-380 nm excitationsfilter och utsänt ljus bör upptäckas genom ett 435-485 nm barriär filter reflekteras från en 400-nm dichroic spegel. AF488 fluorescens kan vara upphetsad genom en 465-495 nm excitationsfilter och utsända ljus kan upptäckas genom en 515-555 nm barriär filtret reflekteras från en 505-nm dichroic spegel. - Bilden minst 50 celler per villkor för varje färgningsmetod.
- Förvärva bilder med hjälp av antingen en widefield (40 X förstoring) eller confocal Mikroskop (63 X eller 100 X förstoring). För celler fläckade både tusch och fluorescerande färgämnen, fånga bilder med widefield Mikroskop utrustat med en datorstyrd scen och oljeimmersionsobjektivet.
4. manuell mätning av kapsel
- För cellerna färgas med tusch eller fluorescerande fläckar, Använd en cell mätning programvara till manuellt åtgärd kapsel och cell diameter (se Tabell för material). För att göra detta, gå till ”Arkiv” > ”Öppna bild” > ”åtgärd” och använda markören för att rita en rak linje genom den bredaste punkten av hela cellen (totala diameter).
- Nästa, klicka på ”åtgärd” igen och rita en rak linje genom cell kroppen (cell Diameter verktygskropp).
Obs: Måtten är sparas automatiskt på cellerna. - Upprepa denna process för alla celler (minst 50/grupp).
- Spara bilder när de mäts, klicka på ”Arkiv” > ”Spara som” och namnge bilderna på lämpligt sätt.
- Markera de nyligen uppmätt filerna och exportera data till ett kalkylprogram.
- Beräkna den genomsnittliga kapslarna diametern med hjälp av ekvation: ([totala diameter] - [cellkroppen diameter]).
5. automatisk mätning av kapsel
Obs: För framgångsrika automatiserad mätning, använda 16-bitars bilder med hög kontrast och som är korrekt inriktade tillsammans med en lämplig bild analys programvara (se Tabell för material). När imaging C. neoformans för kapsel mätning, är det viktigt att fokusera på den mörka ringen vid gränsen mellan cellväggen och kapsel. Detta gör att programvaran att korrekt avgränsa cellen och kapsel.
- Invertera och skapa en kopia av all India färgpulver färgade cellen bilder med hjälp av en lämplig bildredigering programvara (se Tabell för material). För att göra detta, klicka på ”Arkiv” > ”Öppna” att öppna India färgpulver målat bilder och sedan ”styra” + ”I” för att invertera bilden. Klicka på ”Arkiv” > ”Spara som” för att spara den inverterade bilden.
- För att importera både den ursprungliga och inverterad bilder i programvaran klickar du på ”Arkiv” > ”Importera Sequence” > ”laddar bild” > ”definiera sekvens (manuellt)” > ”dimensioner (kanal)” > ”Importera” > ”Apply”.
Obs: De C. neoformans cell organ och kapslar kan identifieras och maskerat med hjälp av särskilda algoritmer - kallad 'recept' - ingår i programvaran. - Använd 'Kolonin Analyzer (fluorescens)' receptet på inverterade bilden att upptäcka och maskera cellkroppen och sedan på ”apply”. I inverterade bilden blir mörka ringen definiera den C. neoformans cellgränsen ljusare än den omgivande kapseln.
- Använd 'Kolonin Analyzer (fluorescens)' receptet på inverterade bilden att segmentera de C. neoformans cell organ från deras kapslar, klicka på ”apply”. Detta skapar en greve mask. Byt namn på denna räkna mask ”Cell kropp” genom att högerklicka på den flik som heter ”greve mask”.
Obs: Receptet består av flera bildbehandling steg: bakgrund borttagning, objektdetektering, objektet separation och filtrering av delmängd. - Därefter använder 'Cellproliferation' receptet på den ursprungliga bilden att upptäcka och maskera kapseln, och klicka på ”apply”. Detta skapar en greve mask. Byt namn på denna räkna mask ”kapsel” genom att högerklicka på den flik som heter ”greve mask”.
- Med receptet, 'Kapsel Partition', skapa en ny mask på den ursprungliga bilden att partitionera intilliggande kapslar från varandra. För att göra detta, klicka på ”Capsule Partition” från menyn recept. I rutan kapsel Partition Välj nu omdöpt till greve masken ”kapsel” (5.5) för kapsel Region. Välj nu omdöpt till greve masken ”Cell kropp” för Crypto celler (5.4). Välja ”Original” för ingångskanal och ”skapa Mask för Partitioned kapsel. Klicka på ”tillämpa
Obs: Receptet genererar cell och kapsel diameter, definieras som medelvärdet av de längsta och kortaste axlarna passerar mitten av cellen och kapsel, och området mätningar från upptäckt masker. Hitta de utdata som ligger under fliken kalkylblad i denna programvara. Upprepa denna process för alla bilder (minst 50 celler/grupp). Receptets parametrar kunde vara inställda för att optimera upptäckt av enskilda bilder eller optimerad för batch detektion av flera bilder. Ytterligare mätningar kan beräknas genom receptet för omfattande karakterisering av cellen och kapsels morfologi. - Exportera data till ett kalkylprogram för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera kapsel induktion, cell färgning, bildbehandling och mätteknik, vi använde tre stammar av C. neoformans: det gemensamma, välkarakteriserad laboratoriet stam, H99S30, och två kliniskt isolerade stammar av tidigare okänd kapsel diameter, B18 och B5231.
Arbetsflödet för kapsel induktion, färgning och bild förvärv med tusch visas i figur 1A. Bilder tagna från alla tre stammar visas i figur 1B både före och efter induktion. Forskaren vet om kapsel induktionen var en framgång genom att jämföra de celler som har genomgått kapsel induktion till dem från samma kultur som inte har. En tydlig storleksanpassaförhöjning framgår generellt i de flesta stammar efter induktion, även om vissa stammar kommer att ställa ut naturligt små kapslar även efter induktion (se bilder av B18 i figur 1B). Det bör noteras att kapsel induktion kommer att misslyckas om kvarvarande rika medier inte är bort före induktion eller CO2 inte är närvarande. I dessa fall kommer att observeras endast blygsamma (om någon) ökar i storlek. Diametrar från alla tre stammar mättes manuellt och resultaten visas i figur 1 c. I två av de tre experimenten fanns det ingen skillnad i storlek mellan H99S och B18. Emellertid observerades konsekvent en signifikant skillnad i storlek mellan största stam, B52, och H99S och B18 (p < 0,001 och p < 0,001, respektive standard minst torg testa med enkel kontraster, urvalets storlek = 50 celler/stam ).
Figur 2A visar arbetsflödet för kapsel induktion, färgning och bild förvärv med två fluorescerande färger, en för kapseln (18B7-AF488) och en för cellväggen (Calcofluor White). Bilder var tagna som z-stackar för alla tre stammar efter induktion, att säkerställa att största kapsel och cellkroppen diameter fångades för varje cell ska mätas (figur 2B). Varje z-stack bearbetades för att producera maximal intensitet projektioner, komprimera den 3-dimensionella stacken in en 2D-bild före analys (figur 2 c). Dessa mättes sedan manuellt (figur 2D). Till skillnad från mätningarna för India färgpulver färgade celler, upprepar den fluorescerande färgning aktiverade oss att diskriminera mellan alla tre stammar på grundval av deras kapsel diameter i alla tre av experimentet. Här, Vi hittade att B18 hade minsta kapsel diameter och B52 den största (p < 0.001 för alla jämförelser, standard minstakvadratmetoden test med enkla effekter, prova storlek = 50 celler/stam).
För att ytterligare bedöma de två metoderna för C. neoformans kapsel färgning, jämfördes mätningar från alla tre stammar. Det var ingen signifikant skillnad mellan kapsel storlek fastställs med hjälp av de två metoderna för färgning (figur 3A) (multivariat ANOVA med enkla effekter, prova storlek = 50 celler/stam). Denna slutsats var överensstämmer med resultaten i ett separat experiment där lab stam, H99S, Co betsad med tusch och fluorescerande färgämnen (figur 3B-C). Dock fanns det större variation mellan experiment med tusch, vilket framgår av det faktum att endast en av tre experiment visade en signifikant skillnad i storlek mellan H99S och B18, jämfört med den betydande skillnaden mellan dessa stammar i alla tre fluorescerande experiment (figur3D-E) (multivariat ANOVA med enkla effekter, prova storlek = 50 celler/stam).
India färgpulver målat bilder som uppfyller de kriterier som anges i protokollet (avsnitt 5) kan mätas med hjälp av ett automatiserat system. Arbetsflödet visas i figur 4A guider användaren genom stegen nödvändigt att använda recepten utformat för att mäta C. neoformans kapseln. Efter att utveckla arbetsflödet, validerades det genom att mäta en cache av befintliga avbildningar av C. neoformans celler av tre forskare som använder både manuella och automatiserade metoder. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan forskarens mätningar när gjort manuellt, och detta var också sant när mätningarna gjordes med hjälp av automatiserad bild analys programvara (figur 4B) (ANOVA, urvalets storlek = 50 celler/forskare). Det fanns en liten men signifikant skillnad i kapsel storlek rapporterade mellan de två metoderna (figur 4 c) ANOVA, urvalets storlek = 150 celler/grupp. Kapselns diameter var genomgående något mindre mätt via automatisering än manuella mätningar (0.3 µm, p < 0,001). Dessutom, när man jämför mellan kapsel storlek mätningar gjorda av separata forskare från samma bild uppsättningar, var medelfel mindre när bild analys programvara användes för kvantifiering i stället för manuella metoder, som är suggestiv av mer exakta och reproducerbara mätningar med den automatiserade metoden. För framgångsrik mätning av automatiserade, celler måste vara i fokus, har ett medium till stor kapsel och inte vara alltför klustrade (figur 4 d). Vi hittade att dåligt fokuserade bilder av klustrade celler med små kapslar inte kunde mätas automatiskt i programvaran. Vi hävdar dock att dessa kan även vara svårt att mäta exakt med manuella metoder.
Figur 1 : India färgpulver färgning för att mäta C. neoformans kapsel. (A) Schematisk bild av C. neoformans kapsel mätning av India färgpulver färgning. I korthet kapsel uttryck induceras med näringsämnen deprivation och exponering för CO2, cellerna är resuspended i India färgpulver och monterade på glasskivor. Bilder av färgade celler förvärvas av ljusmikroskop, med fält antingen valts av användaren eller av kakel-scanning med en datorstyrd stage. Bilder kan antingen analyseras manuellt eller bearbetas för automatiserad bild segmentering och analys. (B) bilder av den gemensamma lab-stammen, H99S och två kliniska stammar, B18 och B52, både före och efter kapsel induktion. Skala staplarna representerar 10 µm (C) grafen av en representant experimentera visar kapsel diameter alla tre stammar färgas med tusch och mätt manuellt (fel representeras medelfel (SE)). Statistisk signifikans indikeras enligt följande: *, p < 0,05; **, p < 0,01; och ***, p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fluorescerande färgning för att mäta C. neoformans kapsel. (A) Schematisk bild av C. neoformans kapsel mätning av Calcofluor vit (CFW) och 18B7-AF488 Co färgning. Efter kapsel induktion och färgning, är cellerna monterad och fotograferad av laserscanning konfokalmikroskopi. Eftersom celler kan vara i olika focal plan, förvärvas z-stackar på varje position. Dessa bearbetas för att producera maximal intensitet prognoser som kan användas för att noggrant mäta maximal kapsel diametern för varje cell. (B) Bilder av den gemensamma lab-stammen, H99S och två kliniska stammar, B18 och B52, kapsel efter induktion. Obs: Skala staplarna representerar 10 µm för alla bilder. (C) maximalt intensitet projektioner av fluorescently märkt C. neoformans celler. (D) Grafen av en representativ experiment som visar manuellt mätt kapsel diameter alla tre stammar fläckade CFW och 18B7-AF488 (fel representeras medelfel (SE)). Statistisk signifikans indikeras enligt följande: *, p < 0,05; **, p < 0,01; och ***, p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Jämförelse av resultat mellan tusch och fluorescerande färgning. (A) analys av tre C. neoformans stammar färgas med tusch eller fluorescerande färgämnen, n = 3 (fel representeras medelfel (SE)). (B) bilder av en enda C. neoformans cellen färgas med tusch och båda fluorescerande färgämnen (skalstapeln representerar 13 µm). Horisontella linjer avgränsa kanterna på kapseln och vertikala linjer avgränsa kanterna på cellkroppen. (C) kvantifiering av en representativ experiment av H99S färgas tillsammans med både tusch och fluorescerande färgämnen (fel representeras medelfel (SE)). (D, E) Skildring av kapsel diameter variabiliteten mellan tusch experiment (D) och fluorescerande experiment (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tillämpad analys av C. neoformans kapsel diameter från bilder av India färgpulver färgade celler. (A) schematisk representation av bild segmentering och C. neoformans kapsel mätning med hjälp av en automatiserad mätteknik (se Tabell för material). (B) jämförelse av kapsel mätningar utförs av 3 separata utredare använder manual (manuell 1-3) och automatiserade metoder (automatiserad 1-3). Varje utredare används en identisk cache av C. neoformans bilder av båda metoderna (fel representeras STDAV). (C) kombinerat genomsnitt av manuella mätningar och automatiserade mätningar (fel representeras medelfel (SE)). Exempel på båda (D) ideal och (E) icke-ideala bilder av C. neoformans. Icke-ideala bilder kan inte mätas framgångsrikt i programvaran. Statistisk signifikans indikeras enligt följande: *, p < 0,05; **, p < 0,01; och ***, p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Decennier, har kapseln varit ett stort fokus på forskning för både mykologer och kliniker intresserad C. neoformans och kryptokockos beror på dess roll som en större virulens faktor för patogen. Med mikroskopi att mäta skillnader i storlek mellan stammar och under olika tillväxt villkor kan ge viktig information om patogenen och dess svar på olika stimuli (dvs, det olika miljöförhållanden, potentiella läkemedelsbehandlingar, etc.) här har vi sammanställt en metod för att framkalla tillväxten av kapseln i C. neoformans, och jämfört två olika kapsel färgprotokollen. Slutligen visade vi hur bild analys programvara kan användas för att automatisera mätning av kapsel diameter från bilder av India färgpulver färgade celler, producerar resultat som var jämförbara med manuell mätmetoder.
I vårt experiment jämförde vi två kliniska stammar, B18 och B52, med H99S, en standard lab stammen av kända kapsel storlek18. Både färgning metoder visade att kliniska stam, B52, hade den största kapslarna diametern av de tre stammar som testas. Resultat från fluorescerande mätningar var dock kunna urskilja en skillnad mellan de två stammarna med mindre kapsel storlek inte var i India färgpulver mätningar. Resultaten från båda metoderna för färgning överensstämde, vilket tyder på att båda är giltiga men att använda bilder av fluorescently målat C. neoformans kan tillåta för ökad känslighet i mäta stammar med liten kapsel. Färgade celler använder maximal prognoser genereras från z-stack bilder av fluorescently och tillåter forskare att säkerställa att korrekta kapsel diameter mätningar kan göras även när avbildad cellerna är i olika focal plan. Dessa mätningar är svårare för C. neoformans avbildas med tusch och standard ljusmikroskopi. I en viss bild, kan intilliggande celler sitta i något olika focal plan, vilket gör det svårt att korrekt lösa cellkroppen-kapsel gränsen för alla celler. Detta kan möjligen blanda ihop utredare förmåga att upptäcka små förändringar i storlek eller små skillnader mellan stammar.
Varje metod har sina inneboende fördelar. India färgpulver används oftast av forskare på grund av sitt överkomliga priser, användarvänlighet, och stabilitet (det inte försämras med tiden som vissa fluorescerande fläckar kan). Eftersom Indien färgpulver är en enkel, negativa fläck det kan användas tillsammans med standard ljus Mikroskop, som är mer lättillgängliga än fluorescerande Mikroskop. Men om inte används i rätt proportioner (Indien bläck: buffert), kan fläcken skapa en ”fjäderlätt” bakgrund när avbildade, vilket kan komplicera automatiserad bildanalys. Samtidigt dyra och mer tidsödande att använda, fluorescerande färger kan vara fördelaktiga för deras flexibilitet, och vi visar, deras känslighet. De är särskilt användbara för mätning av kapsel storlek och cell börda i experiment med C. neoformans som har varit fagocyteras av immunceller och som krävs för Histologisk undersökning av C. neoformans kapsel i vävnadsprover (en teknik som inte beskrivs i denna artikel)32. Om färgningen med fluorescerande färgämnen, såsom calcofluor vit eller fluorescently märkta anti-GXM antikroppar, är problematisk (t.ex.otillräcklig färgning), detta kan vanligtvis lösas genom att optimera färgning protokollet (ökar/minskar den koncentration eller inkubation tid med färgämnet).
Oavsett färgning metodik, finner vi att både kapsel induktion och ordentlig Bildinsamling är kritiska steg i protokollet. Protokollet beskrivs i detta dokument är en av flera standardmetoder för kapsel induktion i C. neoformans och har använts framgångsrikt i jäst labs för många år23. C. neoformans kapsel induktion är CO2-beroende och uppstår endast under påfrestande förhållanden23,33. Därför är det viktigt att det sker i en 5% CO2 inkubator med hjälp av en lämplig näringsämnen bristfällig odlingsmedium. Om det misstänks att kapsel inte har varit inducerad efter en standard inkubation (allmänhet 18-24 h), bör cellerna vara jämfört med en uninduced kontroll-kultur som inte utsätts för påfrestande förhållanden. Jämföra två kommer att avgöra om induktionen var effektiv. En framgångsrik induktion är en där majoriteten av celler gör en större kapsel, jämfört med uninduced kontroll. Eftersom inte alla celler kommer att framkalla, bör cellerna som ska mätas en heterogen representation av de tillgängliga cellerna.
Betydelsen av konsekvent bild förvärv kan inte överskattas, särskilt om automatiserad mätning är målet. Fokus, kontrast, bakgrunden fluorescens, samt den bitdjup och bildkomprimering filer är alla viktiga överväganden. När det är möjligt, stora kluster av celler som inte sitter i en enda fokalplan bör undvikas, även om vissa spirande och röra celler är acceptabla och kan vara oundvikliga (denna regel bör följas för både manuell och automatiserad mätning). Detta problem kan kringgås till viss del när du använder confocal avbildning av fluorescently färgade celler. Användning av z-stackar att producera maximal intensitet projektioner kan aktivera exakt mätning av celler i olika focal plan från en enda bild29. Dessutom bör bilder förvärvas snabbt efter att förbereda provet. Detta kan vara särskilt viktigt för India färgpulver målat prover som när de börja torka, kontrasten mellan bakgrunden och förgrunden element (cellerna) kan minska och oönskad bakgrund funktioner kan förbättras, vilket leder till minskad automatiserade segmentering noggrannhet.
Även om kapsel diameter mätningar är vardagsmat i C. neoformans gemenskapen, fram till denna punkt har de vanligtvis utförts manuellt, vilket kräver betydande tid och arbetskraft. Men manuella mätningar accepteras i fältet och resultat kan erhållas vid liten kostnad. Framsteg i bild analys programvara har gjort det möjligt att ta de första stegen mot att automatisera dessa mätningar. Enkel art C. neoformans cellkroppen och kapsel - visas som en cirkel i en cirkel - i 2D-bilder gör mätning av deras storlekar relativt enkelt för automatiserad bild segmentering programvarupaket, utan att behöva utveckla roman algoritmer. I stället genom att länka befintliga algoritmer, kan C. neoformans celler och kapslar upptäckas, segmenterad, och mätt. Använder denna metod, har vi automatiserat mätningar av C. neoformans kapsel diametern för cellerna färgas med de vanligast använda kapsel dye, tusch, och har jämfört dessa till manuella mätningar för samma datauppsättningar. Denna metod erbjuder fördelen att reproducerbarhet och ta bort mycket av den mänskliga fel i samband med manuell mätning samtidigt spara forskare tiden. Dessutom kan ytterligare mätningar införlivas med minimal ansträngning i automatiserad analys arbetsflödet. Vi anser att automatiserad bildanalys är en lovande metod som tillåter forskare att mäta stort antal C. neoformans kapsel med en hög grad av noggrannhet och effektivitet.
Sammantaget har vi visat hur man framgångsrikt inducera kapsel tillväxt i C. neoformans, fläcken proverna med tusch eller fluorescerande färgämnen och mäta kapsel diameter med både manuell och automatiserad mätningar i en bildanalys programvara. Våra resultat tyder på att båda metoderna för färgning är livskraftiga och allmänhet producera konsekventa resultat (även om det finns mer variabilitet med tusch mätningar). Ytterligare, både manuella och automatiserade mätmetoder har förmågan att urskilja varierande kapsel storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren, Hoyin Lai, är product manager på DRVision som publicerar automatiserad analys bildbehandlingsprogram, Aivia.
Acknowledgments
Vi tackar Doktorsprogrammet molekylära biovetenskaper (MOBI) och avdelningen för biologi vid Middle Tennessee State University (MTSU) för att tillhandahålla finansiering för denna studie. Projektet var också delvis finansierad av ett specialprojekt bidrag till D.E.N. av stiftelsen MTSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsule Induction | |||
| C. neoformans cells | The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University). The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania). | ||
| Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD) | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O) | ||
| DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate | GE Life Sciences | SH30022.01 | |
| 6-well plates | Falcon | CL5335-5EA | |
| Shaking incubator | Thermo Scientific | MaxQ6000 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | Isotemp | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend XTR | |
| Staining | |||
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Legend Micro 21R | |
| India ink | Fisher Scientific | 14-910-56 | |
| Calcofluor white | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| 18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488 | A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University) | ||
| PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA) | PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized. | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Glass coverslips | Corning | 2855-18 | #1.5 thickness |
| Clear nail polish or other non-toxic sealant | |||
| Image Acquisition | |||
| Immersion oil | Cargille | 16484 | |
| Light microscope with immersion oil objective | Zeiss | Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective | |
| Light microscope camera | Zeiss | Zeiss Axiocam ErCD camera | |
| Confocal microscope with oil immersion objective | Zeiss | LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective. | |
| Confocal microscope software | Zen 2009 | ||
| Confocal microscope camera | Nikon | Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer. | |
| Widefield imaging software | Nikon Elements (Nikon) | ||
| Capsule Measurement | |||
| Image editing software | Photoshop (Adobe) | ||
| Microscope software for manual measurement | Axiovision (Carl Zeiss) | ||
| Image analysis software for automated meesurement | Aivia (DRVision Technologies) | ||
| Spreadsheet software | Excel (Microsoft) |
References
- Park, B. J., et al. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The intracellular life of Cryptococcus neoformans. Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).
- Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S.
- Casadevall, A. Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later. Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).
- McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, Ch 6. New Insights in Medical Mycology. , Springer. Netherlands. 131-157 (2007).
- Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. Jr Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections. Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).
- Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).
- Vecchiarelli, A., et al. Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule. Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).
- Murphy, J. W. Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity. Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).
- Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis. Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).
- Collins, H. L., Bancroft, G. J. Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses. Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).
- Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis. Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).
- O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield. Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).
- McClelland, E. E., Smith, J. M. Gender specific differences in the immune response to infection. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).
- McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines. Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2). Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).
- Vartivarian, S. E., et al. Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron. J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).
- McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).
- Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection. Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).
- Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule. Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).
- Pontes, B., Frases, S. The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools. Front Microbiol. 6, 640 (2015).
- Shen, H., et al. Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments. J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).
- Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data. Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).
- Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities. Methods. , 65-79 (2017).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Centers for Disease Control and Prevention, Government Printing Office. Atlanta, GA. 33-38 (2015).
- Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping. J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).
- Janbon, G., et al. Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation. PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).
- Bisson, G. P., et al. The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana. J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).
- van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study. Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).
