Summary
Interaktion og sedimentation af ler og bakterieceller inden for marine realm, observeret i naturlige miljøer kan undersøges bedst i et kontrolleret laboratoriemiljø. Her beskriver vi en detaljeret protokol, som skitserer en roman metode til måling af blodsænkning af ler og cyanobakteriel floccules.
Abstract
Mekanismerne bag aflejring af finkornet, drøftes økologisk-rige sedimenter stadig i vid udstrækning. Specifikt, undersøgt virkningen af samspillet mellem ler partikler og reaktiv, planktoniske cyanobakteriel celler til den sedimentære post under. Denne interaktion er en potentielt stor bidragyder til skifer depositional modeller. I et laboratorium indstilling, kan flokkulering og sedimentation satserne for disse materialer undersøges og målt i et kontrolleret miljø. Vi detalje her, en protokol til måling af blodsænkning cyanobakteriel/ler blandinger. Denne metode er påvist gennem beskrivelsen af to prøve eksperimenter: først bruger kaolin (en dehydreret form af kaolinit) og Synechococcus sp. PCC 7002 (en marine coccoid cyanobakterier), og andet bruger kaolin og Synechocystis sp. PCC 6803 (en ferskvands coccoid cyanobakterier). Cyanobakteriel kulturer blandes med varierende mængder af ler i en specialdesignet tank apparater optimeret til at give mulighed for kontinuerlig, real-time video og fotografiske optagelse. Prøveudtagningsprocedurer er detaljeret samt en post samling protokol til præcis måling af klorofyl en hvorfra koncentrationen af cyanobakteriel celler i suspension kan bestemmes. Gennem eksperimentelle replikering opbygges en profil der viser sænkningsreaktion.
Introduction
Ved hjælp af nuværende miljømæssige forhold og processer til at udlede forbi depositional mekanismer har længe været en understøttelse af sedimentology. Mens moderne depositional analoger, såsom Sortehavet, har været brugt til at forstå aflejring af økologisk-rige, finkornet indskud, har laboratorieforsøg potentiale til at kaste yderligere lys over oprindelsen af skifer indskud. En er undersøgelse i tilblivelsen af sort skifer deposition sats og mekanisme af oprindelige dannelse. Traditionelt, det har været en hypotese at sort skifer dannet i miljøer hvor blodsænkning, primære produktivitet og organisk stof respiration satser fremme bevarelsen af organisk stof i sediment1,2 ,3. Men rollen som cyanobakteriel og ler flokkulering er stort set forblevet uovervejet. Denne mekanisme af flokkulering giver mulighed for hurtig aflejring af økologisk-rige, finkornet sedimenter at forekomme, og kræver ikke lav-oxygen. I betragtning af denne præmis, denne protokol har to mål: 1) måle cyanobakteriel/ler floccules blodsænkning, og 2) visualisere sedimentering proces i realtid. Denne metode, ud over geokemiske analyser, er blevet brugt til at påvise, at cyanobakteriel/ler flokkulering kan faktisk være en vigtig mekanisme til skifer dannelse1. Mens oprindeligt tiltænkt modellering skifer deposition, kan denne metode anvendes til andre discipliner som biologi og miljøskader hvor ler input indflydelse på bakteriel metabolisme og befolkningen skal måles.
Talrige undersøgelser har været udført for at observere flokkulering cyanobakterier og ler, til afbøde skadelige algeopblomstringer2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. mens måling celle koncentration over tid, disse undersøgelser har ikke anvendes dog cyanobakterier/ler flokkulering modellering aflejring af posten rock. Som sådan, mangler disse undersøgelser en visuel komponent, som kan være kritisk, når modellering forbi sedimentological processer. Derudover flertal af undersøgelser udnytte celle-optælling (fx Pan mfl. 11), som kan være besværligt. Vores metode, med de seneste fremskridt i måling cyanobakteriel flokkulering, bestemmer ændringerne i cyanobakteriel celle koncentrationen ved at måle klorofyl en (Chl en) på diskret tidsintervaller. Parring Chl en måling med visuelle data er en ny tilgang, som kan bruges til at udlede depositional betingelser. Billederne genereres kan også bruges til at beregne blodsænkning efter arbejde fra Du mfl. 13. en kombination af visuelle og numeriske data styrker pålideligheden af resultaterne. Desuden skitsere vi tillægsprotokoller giver mulighed for sedimentation af døde biomasse og ler skal også overholdes. Dette er vigtigt, når man overvejer forbi sedimentological miljøer, hvor levende og døde biomasse kan være co opstået. Forskelle i opførsel af døde biomasse under flokkulering (eksempelvis fald i flokkulering sats) ville potentielt har sedimentological konsekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse cyanobakteriel kulturer
-
Forberede podning kulturer ved hjælp af solid media
- Få axenic cyanobakteriel celler fra amerikansk Type kultursamling eller Pasteur kultursamling. For eksempel, den encellede, marine Synechococcus sp. PCC 7002 stammer fra samlingen Pasteur kultur, det vil blive omtalt i det følgende benævnt som Synechococcus.
- Opretholde Synechococcus celler på plader med solid media (en + flydende medier14 og 1,5% agar15). Disse vil blive benævnt podning kulturer.
- Inkuber plader på 32 ± 2 ° C med kontinuerlig lys, på 30-50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18.
- Gentag trin 1.1-1.3 og erstatte en + medier med BG-1116 i trin 1.1.2 for cyanobakteriel ferskvandsfisk, såsom Synechocystis sp. PCC 680316,17, omhandlede herefter som Synechocystis. Henvises til tabel 1 – 4 for sammensætningen af A + og BG-11 medier.
-
Forberede flydende kulturer: hver tank eksperiment kræver en 400 mL cyanobakteriel kultur.
- Indsamle en 250 mL og to 1 L varmebestandige erlenmeyerkolben.
- Skyl hver kolbe med en 4 M saltsyre (HCl) løsning (30 mL HCl-opløsning for hver kolbe), efterfulgt af destilleret vand.
Forsigtig: saltsyre er ætsende og giftige. Sikre, at en laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og syrefast handsker er slidte mens du bruger 4 M HCl løsning. Udføre dette trin i et laboratorium vask og følg lokale regler for bortkastning af 4 M HCl løsning - Fylde en 250 mL kolbe med 50 mL af flydende medier (A + eller BG-11). Udfylde en 1 L målekolbe med 400 mL flydende medier (A + eller BG-11) og de andre 1 L målekolbe med 600 mL af medier (A + eller BG-11).
- Forsegle hver kolbe med en gas-gennemtrængelige skum prop og dække skum prop og kolbens hals med stanniol.
- Etiket og autoklave kolberne ved 121 ° C og 100 kPa i 25 min. tillade kolber afkøle til stuetemperatur.
- Forberede en laminar flow hætte af sterilisering overfladen med 70% alkohol.
- Indsamle en podning teleslynge, en bunsenbrænder, afkølede 50 mL flydende medier kolbe (fra trin 1.2.5) og podning kultur (fra trin 1.1). Placere elementerne i steriliseret flow hætte.
- Sterilisere podning teleslynge kort ved hjælp af flammen på en bunsenbrænder og lad det køle.
- Træk cool løkken langs overfladen af podning kultur at indsamle cyanobakteriel celler.
- Fjern skum prop og folie cap fra 250 mL kolbe (uden at røre skum prop) og sterilisere Erlenmeyerkolben rand ved at passere det kortvarigt gennem flammen.
- Vippe kolben, så medierne er i nærheden af kolbens hals og indsætte podning løkken belagt med celler i kolben. Når løkken er nedsænket i medierne, rør podning løkke for at fjerne cellerne.
- Fjerne podning loop og re sterilisere læbe af kolben med bunsenbrænder flamme.
- Erstatte skum prop og folie cap på Erlenmeyerkolben (uden at røre skum prop).
- Sterilisere podning løkken kort inden for bunsenbrænder flamme.
- Forberede en vækst værelse (benævnt vækst kammer) hvor temperaturen holdes på 30 ° C15,18 og lysintensiteten er 30 – 50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18 . Luftfugtigheden styres ikke aktivt.
- Tillad den podede 50 mL kultur at udruge ved omrystning ved 150 rpm i vækst-salen med en vedligeholdt temperatur på 30 ° C. Holde mund kolbens dækket under ophidselse til at styre fordampningstabet og forebygge forurening.
- Giver mulighed for cyanobakteriel kultur at vokse til 96 timer. En vellykket kultur bør vises lysegrønt og har en optisk densitet (OD) ved 750 nm på 0,4-0,6.
- Når kulturen er vokset tilstrækkeligt, placere 50 mL kultur og 1 L målekolbe indeholdende 400 mL flydende medier (fra trin 1.2.5) i laminar flow hood. Sikre flow hood er steriliseret følgende trin 1.2.6.
- Gentag trin 1.2.10 for begge flasker i en laminar flow hætte.
- Hæld 50 mL kultur i medierne i 1 L målekolbe 400 mL og re sterilisere læbe af 1 L målekolbe med bunsenbrænder flamme.
- Stedet for skum prop og folie cap, fastgør et sterilt boblende apparater bestående af en skum prop, pipette, plastik slange, indbygget filter og folie cover til mundingen af kolben.
- Agitere 1 L målekolbe på 150 rpm ved 30 ° C med Bobleflasken apparatet knyttet til en luftpumpe, der cirkulerer en befugtet luftblandingen gennem løsning15,18 på 300 mL/min.
- Tillad kultur at vokse inden for vækst kammer ved 30 ° C i 120-168 timer. En vellykket kultur bør vises lysegrønt og har en OD750 nm på 0,4-0,6.
- Gentag trin 1.2 til at producere en kontrol kultur, som ikke vil være blandet med ler.
- Eksperimenter ved hjælp af dead biomasse kræver et ekstra trin. Autoklave 1 L målekolbe kultur for 60 min ved 121 ° C og lad det køle til stuetemperatur.
2. eksperimentelt sæt op
- Placer en rektangulær akryl tank (længde 20 cm), 5,1 cm bredde og højde på 30 cm foran en bank af fluorescerende lys (ni T8 pærer, mindst 2.600 lumen; Figur 1) 19.
- Placer en gennemskinnelig, hvid plastfolie mellem bank af lys og tank til diffuse lys, der skinner igennem i tanken. Dette set-up var tilpasset fra Sutherland et al. 19
- Mark akryl tanken på en højde på 10 cm, målt lodret fra basen. Alle målinger bør ske på denne højde i kolonnen vand for at sikre sammenhæng i alle stikprøver.
- Placer en kameraet på et stativ, 1 m foran på kampvognen at registrere hvert eksperiment. Et videokamera anbefales, da billeder kan udvindes fra video filer, og ved hjælp af matematisk modellering software, video filer kan bruges til at modellere bilægge dynamics19.
- Placere et sort klæde over lys bank, tank og kamera til at beskytte eksperiment fra eksterne lyskilder (figur 1).
3. flokkulering forsøgsplan
- Indsamle 400 mL kultur (trin 1.2), en stor måleglas og 600 mL ekstra vækst medier i en 1 L målekolbe (trin 1.2.5).
- Fortyndes 400 mL kultur (første celle koncentration af 4-6 mg/mL) med yderligere vækst medier (A + eller BG-11) til endelige mængden af 1 L ved hjælp af den måleglas. Tilføj denne løsning til akryl tanken.
- Forberede 2 mL mikrofuge rør ved mærkning og placere dem i en bekvem beliggenhed i nærheden af akryl tanken. Mål 50 g af ler til eksperimentet.
- Starte videooptagelse. I tilfælde af flere eksperimenter, kan et tegn med eksperiment-id holdes midlertidigt før kameraet.
- Ved hjælp af en pipette, tage en 1 mL prøve og placere den i en mærket mikrofuge tube. Bruge dette eksempel til at bestemme den oprindelige cyanobakteriel celletal ved måling af OD750 nm værdier. Tage alle prøver i tre eksemplarer til at sikre præcise resultater.
- Hæld hurtigt ler (50 g) i tanken med energisk agitation ved hjælp af en omrøring stick for 10-15 s.
- Start timeren og tage den første 1 mL prøve til Chl en bestemmelse ved hjælp af en P1000 pipette (prøve tid0).
- Tage yderligere prøver på passende tidspunkter (f.eks.1 min, 2 min, 3 min, 4 min., 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min. og 240 min).
- Når eksperimentet er færdig, gemme videofilen, slukke videokameraet og behandle alle prøver til Chl en bestemmelse (trin 4).
- Autoklave den resterende ler/cyanobakteriel løsning. Afhængigt af cyanobakteriel arter, lokale regler og lab politik, bortskaffe løsning ved hjælp af egnede metoder. Tank med sæbe og vand, skyl ren det med destilleret vand og luft tørre det.
- Forberede et kontrol-eksperiment med ingen ler tilføjet. Udtage prøver på de samme tidspunkter. Disse data kan sammenlignes med andre eksperimentelle data til at bekræfte, at bilægge satser er forbedret på grund af flokkulering med ler, ikke et resultat af naturlig afvikling.
- Hvis døde biomasse bruges under eksperimentet, bruge den samme eksperimentelle procedure. Proceduren bortskaffelse af løsningen kræver dog ikke autoklavering.
4. prøve behandling og evaluering
- Bestemme Chl en koncentration i hver celle prøve ved hjælp af en procedure, der er modificeret fra Owttrim16. Når indsamlet, pellet celler fra hver prøve for 3 min på 13.000 x g ved hjælp af en microcentrifuge ved stuetemperatur.
- Fjern overskydende medie ved hjælp af en P1000 pipette og tilsættes 1 mL 100% methanol (20 ° C). Vortex prøve ved fuld hastighed i 1 minut til resuspenderes celle.
Forsigtig: Methanol er giftige og brandfarlige. Bære handsker og sikkerhedsbriller, og holde methanol væk fra antændelseskilder. - Inkuber prøver ved-20 ° C i 24 timer til at lette ekstraktion af Chl en.
- Efter inkubation, pellet den celleaffald som beskrevet i 4.1, overføre den grønne supernatanten til en kuvette ved hjælp af en pipette og placere kuvette i spektrofotometret. Tillad prøven til hvile i spektrofotometrets for 1 min til at sikre, at eventuelle resterende ler inden prøven afregner og ikke forstyrre målingen.
- Bestemme Chl en koncentration spektrofotometrisk ved måling af absorbans ved 665 nm og 652 nm, og OD ved 750 nm. Chl en -koncentrationen bestemmes ved hjælp af den formel Chl en = 16.29 x (en665 - OD750) - 8,54 x (en652 - OD750) 20. CHL en koncentration bruges som en proxy for celle koncentration. Derudover en omregningsfaktor på 7.4 x 1010 celler/L = 10 g/L21 kan bruges til at beregne koncentrationen af celle i gram af nogle cyanobakteriel arter.
- Plot beregnet Chl en værdier kontra tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de udsættes for ler, er cyanobakteriel celler bragt ud af suspension22. Dette er påvist i de repræsentative resultater her. At bestemme virkningen af ler på cyanobakteriel befolkninger og observere sedimentation satser, to eksperimenter blev udført under som Synechococcus og Synechocystis blev udsat for 50 g/L kaolin clay (tabel 5-6, Figur 2–3). Cyanobakteriel kulturer blev dyrket som beskrevet i trin 1. Efterfølgende, efter opsætning tank (trin 2), blev den fortyndede Synechococcus kultur hældt i tanken og blandet med 50 g af kaolin clay efter trin 3. Dette blev gentaget for Synechocystis kultur. Alle prøver blev indsamlet fra den tilsvarende position i tanken. Prøverne blev behandlet og målinger af OD652 og OD665 samt den beregnede Chl en værdi er angivet for Synechococcus (tabel 5) og Synechocystis (tabel 6). Disse resultater blev afbildet grafisk i linje parceller og i forhold til resultaterne af standarder til at bestemme, hvis den bilægge cyanobakteriel/ler blandinger var højere end de naturlige bilæggelse af cyanobakterier kun. Disse resultater viser, at de cyanobakteriel befolkninger blev bragt ud af suspension inden for 10 min af ler eksponering (figur 2–3). Den marine Synechococcus viste en hurtigere blodsænkning end ferskvand Synechocystis, som er i overensstemmelse med hypotesen at trivalent kationer (udbredt i vækstmediet, som efterligner saltholdighed af saltvand) fungere som bro agenten mellem ler partikler og bakterieceller, lette flokkulering og derfor sedimentering1.
Det er vigtigt at bemærke, at i figur 3, er nogle anomalously høj resultater, specielt på data punkt 2. Dette er et eksempel på prøve behandling under hvilke skridt 4.4 ikke var tilstrækkeligt fulgt og prøven blev grumset under målingen. Dette giver en kunstigt høj resultat (figur 2, data punkt 2). Et eksempel på billeder i tidsserier, udvundet fra en video leveres i figur 4, tilpasset fra Playter mfl. 22. det er vigtigt at bemærke, at kaolinit (ikke kaolin) blev brugt i Playter mfl. 22.
Figur 1 : Forklarende diagram illustrerer opsætningen af eksperimenterende. En video kamera er sat op på mindst 1 m fra apparatet tank. Tanken er fyldt med 1 L af cyanobakterier og flydende medier. Lyser kampvognen bagfra og lyset er spredt af en gennemsigtig film. Denne hele sættet er draperet med en sort klud til at fjerne yderligere lyskilder. Dette tal er blevet ændret fra Sutherland mfl. 19. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Chl en koncentrationer beregnes ud fra OD-værdierne i tabel 1. Disse værdier er fra en Synechococcus /kaolin blanding (gul). Sammenligning med Chl en koncentrationer for Synechococcus kun (blå) viser en øget blodsænkning for cyanobakteriel/ler blandingen. Dette tal er blevet ændret fra Playter et al. 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Chl en koncentrationer beregnes ud fra OD-værdierne i tabel 2. Disse værdier er fra Synechocystis /kaolin blanding (gul). Sammenligning med Chl en koncentrationer for Synechocystis kun (blå) viser en øget blodsænkning for cyanobakteriel/ler blandingen. Dette tal er blevet ændret fra Playter et al. 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant tidsforløb på Synechococcus-kaolinit deposition. Disse snapshots er udvundet fra den optaget video på diskret tidsintervaller (1 min). Dette tal er blevet ændret fra Playter et al. 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| For 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8,2 |
| 1 mL P1 metaller materiel * |
Tabel 1: opskrift på en + media 14 . Henvises til tabel 2 for sammensætningen af P1 metaller lager. Denne opskrift giver 1 L af medier.
| For 1 L P1 metal lager |
| 34.26 g H3BO3 |
| 4.32 g frihedsbevægelse2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (85%) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabel 2: Opskrift på P1 metaller lager kræves for en + medier.
| For 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL citronsyre H2O |
| 1 mL Ferric Ammonium citrat |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 mikroelementer * |
Tabel 3: opskrift på BG-11 media 16 . Henvises til tabel 4 for sammensætningen af A5 mikroelementer. Denne opskrift giver 1 L af medier.
| For 1 L af stamopløsningen |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1,81 g frihedsbevægelse2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g Na2MoO4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6 H2O |
Tabel 4: Opskrift på A5 Microelement lager kræves til BG-11 medier.
| Prøven tid (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0,036 | 0.084 |
| 15 | 0,027 | 0,025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
Tabel 5: OD 665 og OD 652 målinger til Synechococcus i nærværelse af 50 g/L kaolin clay. CHL en værdier beregnes med formlen i trin 4.4. Bemærk at prøver t6 og t7 der mangler. Dette er et eksempel på ikke at holde en konsekvent prøveintervallet pr celle prøvetagningsprotokol. Data til standarden, der er taget fra Playter, mfl. (2017) 2.
| Prøven tid (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0,384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0,64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0,934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0,048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0,005 | 0.136 |
Tabel 6: OD 665 og OD 652 målinger til Synechocystis i nærværelse af 50 g/L kaolin clay. CHL en værdier beregnes ud fra formlen i trin 4.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flokkulering katalyseret af cyanobakteriel celle-ler interaktion har tiltrukket sig stor interesse inden for økologi og engineering2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, dog undersøgelsen af disse interaktioner med hensigten af modellering aflejring af sedimentære indskud (f.eks skifer) er relativt nyt. Visualisering af denne proces, er i dette tilfælde til sedimentological applikationer, ikke blevet rapporteret. I tidligere undersøgelser, flokkulering, er disse interaktioner blevet undersøgt ved at blande ler og cyanobakterier i krukker, reagensglas, eller bægre og prøveudtagning i diskret tid mellemrum9,11,12, 26 at fastslå ændringer i celle koncentration gennem tiden. Disse undersøgelser har målt koncentrationen af cyanobakteriel celler på forskellige måder. For eksempel, er at stikprøven cyanobakteriel cellepopulationer blevet målt ved at tælle ved hjælp af et mikroskop9,11,12,26. I forhold til den første celle koncentration, kan fjernelse effektivitet være beregnede9,11,12,26. I en separat undersøgelse, efter at tillade ler/celle blanding til at bosætte sig, var væske tilbage over udlignede celle/ler sediment udtages og analyseres for fluorescens at anslå antallet af resterende celler i suspension3. Målinger af Chl en direkte fra kolonnen vandprøver har også været brugt til at beregne celle koncentration8,10.
I modsætning hertil måler vores metode celler i suspension over tid, bygger på metoden af Sengco, et al. 4 ved at tage målinger på udvalgte tidspunkter under hele processen, og parring disse tidsintervaller med real-time video billeddannelse. Sammenlignet med andre eksperimentelle protokoller vedrørende afregning af ler i overværelse af anioniske flokkulater, afviger ved hjælp af enten biologiske (alger eller cyanobakterier) eller ikke-biologiske (syntetisk flocculent agenter) flokkulater, vores analyse på mange tæller. For det første indebærer vores undersøgelse brug af en marine coccoid arter af cyanobakterier, mens mange andre undersøgelser inddrage ferskvandsarter eller arter, der producerer ekstracellulære polysaccharid stoffer5,23,24 , 25. Desuden vores undersøgelse indebærer brug af en standard tank, inden for hvilken løsningen er statisk. Dette er i kontrast med undersøgelser udført ved hjælp af reagensglas eller cylindre3,12,14 eller målekanal tanke, hvor den flydende flow er en variabel af interesse6,7. Den statiske karakter af vores eksperimentelle metode giver mulighed for måling af baseline sedimentering satser, hvor floccules ikke holdes i suspension ved turbulent strømning. Desuden, ved hjælp af en tank i stedet for et reagensglas, krukke eller bægerglas, giver mulighed for bedre visualisering af de deraf følgende indskud på grund af de flade tank sider; de video billeder viser ingen forvrængning på grund af buede og lyset er jævnt spredt. For det tredje metoden beskrevet heri foranstaltninger flokkulering satser på både korte (2 min mellemrum) og lange (timers intervaller) sigt; Derudover kan billeder kompileres på skalaer på sekunder til minutter, giver mulighed for både visualisering af processen, og en yderligere måling af den bilægge sats. De fleste undersøgelser foranstaltning flokkulering satser over halvdelen til fuld timers intervaller5,6,23,25 eller blot foranstaltning det endelige antal celler venstre i suspension efter en enkelt gang punkt (2- 2.5 h)9,24, selvom nogle undersøgelser9 har målt ændringer i celle eller Chl en koncentration over 2 minutters intervaller. Prøveintervallet valgt er kritisk, da flokkulering kan opstå hurtigt (inden for 5-10 min)22. Endelig, en stor styrke af vores metode er at den producerer real-time billeder af flokkulering proces, ikke blot af de producerede aggregater (fx., Avnimelech mfl., 1982)24. At have to linjer af data, celle koncentration fra prøveudtagning og visuelle beviser, styrker de resultaternes pålidelighed og støtter robust konklusioner.
Mens velegnet til måling af flokkulering satser af ler og cyanobakterier, vores protokollen kræver omhu med hensyn til prøveudtagning placering inden for tanken. Samme område af tank (x, y, z) udtages hver gang eller prøveresultater kan blive skæv. Pleje skal også tages til at tillade alle partikler til at bilægge før OD målingerne er foretaget. Kritiske trin omfatter: i) ved hjælp af en passende stikprøver interval, som forbliver konsistent for alle eksperimenter, og ii) sikre, at ler/cyanobakteriel pelleten er tilstrækkeligt brudt efter tilsætning af methanol til at sikre passende udvinding af klorofyl fra cellerne.
Den teknik beskrevet her er også begrænset til modellering flokkulering fuldt iltet betingelser. Eksperimentelle apparater og procedure vil skulle ændres for at modellere en stratificeret vandsøjlen med anoxiske bunden farvande.
I forbindelse med sedimentological har denne metode potentiale til at blive anvendt til modellering aflejringer af forskellige ler nøgletal eller biologiske materialer for at forstå aspekter såsom ændringer i organisk materiale og saltholdighed fra floder input. Derudover kan de sedimenter, der er fremstillet ved hjælp af denne metode bruges til at undersøge virkningen af potentielle storm omarbejde på fnug-sammenhæng ved remixing eller ophidselse. Ved parring direkte måling af cyanobakteriel celle koncentration med visuelle billeder, denne protokol overskrider de traditionelle anvendelser af cyanobakterier/ler flokkulering processer og giver mulighed for disse processer skal anvendes til sedimentological modellering af posten rock.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt støtte fra Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada (05448, 165831 og 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
