Summary
Das Zusammenspiel und die Sedimentation von Ton und Bakterienzellen im marinen Bereich, beobachtet in natürlichen Umgebungen, können am besten in einer kontrollierten Laborumgebung untersucht werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das eine neuartige Methode zur Messung der Sedimentation Rate von Lehm und Cyanobakterien Stapelfaser skizziert.
Abstract
Die Mechanismen für die Ablagerung von feinkörnigen, sind reich an organischen Sedimente noch weitgehend umstritten. Insbesondere wird die Auswirkungen der Interaktion von tonteilchen mit reaktiven, planktonischen Cyanobakterien Zellen in den sedimentären Datensatz unter untersucht. Diese Interaktion ist potenziell maßgeblich an Schiefer Ablagerungsbedingungen Modelle. In einer Laborumgebung können die Flockung und Sedimentation Preise dieser Materialien geprüft und in einer kontrollierten Umgebung gemessen werden. Hier zeigen wir ein Protokoll zur Messung der Sedimentation Rate von Cyanobakterien/Ton-Gemischen. Diese Methode wird durch die Beschreibung von zwei Probe-Experimenten demonstriert: die erste verwendet vorkommenden SP. PCC 7002 (ein marine kokkoiden Cyanobakterien) und Kaolin (eine trockene Form von Kaolinit) und die zweite Kaolin und Synechocystis SP. PCC 6803 (ein Süßwasser kokkoiden Cyanobakterien). Cyanobakterielle Kulturen werden mit unterschiedlichen Mengen Lehm in einen speziell entwickelten Panzer Apparat so optimiert, dass kontinuierliche, Echtzeit-Video und fotografische Aufzeichnung können gemischt. Die Stichprobenverfahren sind sowie ein Post-Sammlung-Protokoll zur präzisen Messung von Chlorophyll eine detaillierte aus denen die Konzentration von Cyanobakterien Zellen bleiben in der Schwebe bestimmt werden kann. Durch experimentelle Replikation ein Profil erstellt, die Sedimentation Rate zeigt.
Introduction
Mit heutigen Umweltbedingungen und Prozesse, vorbei an Erosionsprozesse Mechanismen abzuleiten ist seit langem eine Untermauerung der Sedimentologie. Während moderne Ablagerungsbedingungen Analoga, wie das Schwarze Meer verwendet wurden, um die Ablagerung von organischen reichen, feinkörnige Ablagerungen zu verstehen, haben Labor-Experimente das Potenzial, zusätzlichen Aufschluss über die Herkunft der Schiefer-Lagerstätten. Eine ist Anfrage bei der Entstehung der schwarzen Schiefer die Abscheiderate und Mechanismus der ursprünglichen Formation. Traditionell hat theoretisiert, daß schwarze Schiefer Umgebungen gebildet wo die Sedimentation Rate, PRIMÄRPRODUKTIVITÄT und organischer Substanz Atmung Preise die Erhaltung der organischen Substanz im Sediment1,2 fördern ,3. Jedoch die Rolle der Cyanobakterien und Ton Flockung ist weitgehend unberücksichtigt geblieben. Dieser Mechanismus der Flockung würde es ermöglichen schnelle Ablagerung von organischen reichen, feinkörnige Sedimente auftreten, und ist nicht erforderlich, sauerstoffarmen. In Anbetracht dieser Prämisse dieses Protokolls hat zwei Ziele: (1) messen die Sedimentation Rate der Cyanobakterien/Ton Stapelfaser, und (2) den Sedimentationsprozess in Echtzeit zu visualisieren. Diese Methodik, neben geochemische Analyse wurde verwendet, zu zeigen, dass Cyanobakterien/Ton Flockung in der Tat ein wichtiger Mechanismus für Shale Formation1sein kann. Während ursprünglich für die Modellierung von Schiefer Ablagerung, gilt diese Methode zu anderen Disziplinen wie Biologie und Umweltsanierung wo der Einfluss der Ton-Eingang auf bakteriellen Stoffwechsel und Bevölkerung gemessen werden muss.
Zahlreiche Studien wurden durchgeführt, um die Flockung von Cyanobakterien und Lehm, zur Abschwächung der schädlichen Algenblüten2,3,4,5,6,7 beobachten , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. jedoch während der Messung Zellkonzentration im Laufe der Zeit, diese Studien haben nicht angewendet Cyanobakterien/Ton Flockung zur Modellierung der Ablagerung von der Rock-Datensatz. So fehlt diese Studien eine visuelle Komponente, die entscheidend sein kann, wenn Vergangenheit sedimentologische Prozesse zu modellieren. Zusätzlich zu die Mehrzahl der Studien nutzen Zellzählung (z. B. Pan Et Al. 11), die mühsam sein kann. Unsere Methode, mit der jüngsten Fortschritte in der Messtechnik Cyanobakterien Flockung, bestimmt die Änderungen in Cyanobakterien Zellkonzentration durch Messung Chlorophyll ein (Chl eine) in diskreten Zeitintervallen. Paarung Chl eine Messung mit visuellen Daten ist ein neuer Ansatz, die Erosionsprozesse Bedingungen abzuleiten verwendet werden können. Erzeugten Bilder können auch zur Sedimentation Rate nach der Arbeit von Du Et al.zu berechnen. 13. die Kombination von visuellen und numerischen Daten stärkt die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Darüber hinaus erläutern wir weitere Protokolle für die Sedimentation der Toten Biomasse und Ton ermöglichen auch beobachtet werden. Dies ist wichtig, wenn man vorbei an sedimentologische Umgebungen, wo Leben und tot Biomasse Co aufgetreten. Unterschiede im Verhalten der Toten Biomasse während der Flockung (z. B. Rückgang der Flockung Tarif) hätte möglicherweise sedimentologische folgen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Cyanobakterielle Kulturen
-
Vorbereitung der Inokulation Kulturen mit festen Medien
- Erhalten Sie axenic Zellen Zellen von der American Type Culture Collection oder Pasteur Culture Collection. Zum Beispiel die einzelligen, marine vorkommenden SP. PCC 7002 wurde von Pasteur Culture Collection erhalten, es wird im folgenden vorkommendenbezeichnet werden.
- Vorkommenden Zellen auf Tellern mit festen Medien (A + flüssige Medien14 und 1,5 % Agar15) zu erhalten. Diese werden im folgenden als Impfung Kulturen bezeichnet.
- Inkubieren Sie die Platten bei 32 ± 2 ° C mit Dauerlicht zur Verfügung gestellt um 30 – 50 µmol Photonen m-2 s-1,15,18.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.3 und ersetzen A + Medien mit BG-11-16 im Schritt 1.1.2 für Cyanobakterien Süßwasserarten wie Synechocystis SP. PCC 680316,17, im folgenden genannten Synechocystis. Die Zusammensetzung des A + und BG-11 Medien finden Sie unter Tabellen 1 – 4 .
-
Flüssige Kulturen vorbereiten: jeder Tank Experiment erfordert eine 400 mL Cyanobakterien Kultur.
- Sammeln Sie ein 250 mL und zwei 1 L hitzebeständige Erlenmeyerkolben.
- Spülen Sie jede Flasche mit einer 4 M Salzsäure (HCl)-Lösung (30 mL HCl-Lösung für jede Flasche), gefolgt von destilliertem Wasser.
Achtung: Salzsäure ist ätzend und giftig. Stellen Sie sicher, dass ein Laborkittel, Schutzbrille und säureresistente Handschuhe getragen werden, wobei die 4 M HCl-Lösung. Führen Sie diesen Schritt in einem Labor-Waschbecken und befolgen Sie die örtliche Vorschriften bei der Entsorgung von 4 M HCl-Lösung - Füllen Sie die 250 mL Flasche mit 50 mL flüssiger Medien (A + oder BG-11). Füllen Sie eine 1 L Flasche mit 400 mL flüssiger Medien (A + oder BG-11) und der andere 1 L Flasche mit 600 mL Medien (A + oder BG-11).
- Jede Flasche mit einem Gas durchlässige Schaum stopfen verschließen und den Schaum Stopper und Kolben Hals mit Alufolie abdecken.
- Label und Autoklaven ermöglichen die Fläschchen bei 121 ° C und 100 kPa für 25 min. der Kolben auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Bereiten Sie eine laminare Strömung Kapuze durch Sterilisierung der Oberfläche mit 70 % Alkohol.
- Sammeln Sie eine Drahtschlinge Inokulation, ein Bunsenbrenner, gekühlten 50 mL flüssige Medien Kolben (aus Schritt 1.2.5) und die Impfung-Kultur (ab Schritt 1.1). Legen Sie diese Elemente in die sterilisierten Fluss-Haube.
- Sterilisieren Sie die Drahtschlinge Impfung kurz mit der Flamme einen Bunsenbrenner zu und lassen Sie es abkühlen.
- Ziehen Sie die coole Schleife entlang der Oberfläche der Inokulation Kultur um Cyanobakterien Zellen zu sammeln.
- Entfernen Sie die Schaumstoff-Stöpsel und Folie Kappe aus der 250 mL-Flasche (ohne Berührung den Schaum-Stopper) und Sterilisieren Sie den Rand der Erlenmeyerkolben zu, indem man es kurz durch die Flamme.
- Kippen Sie die Flasche zu, so dass das Medium in der Nähe von den Hals der Flasche ist, und legen Sie die Impfschlinge beschichtet mit Zellen in den Kolben. Sobald die Schleife in den Medien eingetaucht ist, rühren Sie die Impfschlinge um die Zellen zu entfernen.
- Entfernen Sie die Impfschlinge und resterilisieren Sie die Lippe des Kolbens mit dem Bunsenbrenner Flamme.
- Ersetzen Sie den Schaumstoff-Stöpsel und Folie Kappe auf dem Erlenmeyerkolben (ohne Berührung den Schaum-Stopper).
- Die Impfschlinge innerhalb der Bunsenbrenner-Flamme zu sterilisieren.
- Bereiten Sie ein Wachstum Zimmer (das Wachstum Kammer genannt) wo die Temperatur bleibt bei 30 ° C15,18 und Lichtintensität ist 30 – 50 µmol Photonen m-2 s-1,15,18 . Feuchtigkeit wird nicht aktiv gesteuert.
- Ermöglichen Sie die beimpften 50 mL Kultur auszubrüten durch Schütteln bei 150 u/min in der Wachstums-Kammer mit einer gepflegten Temperatur von 30 ° C. Halten Sie den Mund des Kolbens bedeckt, während die Erregung zu kontrollieren Verdunstungsverluste und Verunreinigung zu verhindern.
- Lassen Sie die Cyanobakterien Kultur(en) für 96 h wachsen. Eine erfolgreiche Kultur sollte erscheinen leuchtend grün und haben eine optische Dichte (OD) bei 750 nm von 0,4 – 0,6.
- Die Kultur genug geworden ist, legen Sie die 50 mL-Kultur und die 1 L Flasche mit 400 mL flüssiger Medien (aus Schritt 1.2.5) in der Laminar-Flow-Haube. Sicherstellen Sie, dass die Strömung Haube sterilisierte Folgeschritt 1.2.6 ist.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.10 für beide Flaschen innerhalb einer Laminar-Flow-Haube.
- Die 50 mL-Kultur in der 400 mL der Medien in der 1 L Flasche Gießen und die Lippe der 1 L Flasche mit dem Bunsenbrenner Flamme resterilisieren.
- An die Stelle der Schaum stopfen und Folie Kappe befestigen Sie einen sterilen sprudelnden Apparat, bestehend aus einem Schaumstoff-stopfen, Pipette, Kunststoffrohre, Inline-Filter und vereiteln Sie Abdeckung bis zur Mündung des Kolbens zu.
- Schütteln Sie die 1 L Flasche mit 150 u/min bei 30 ° C mit dem Wäscher Apparat angebracht zu einer Luftpumpe, die eine befeuchtete Luft-Gemisch durch die Lösung15,18 bei 300 mL/min zirkuliert.
- Lassen Sie Kultur(en) innerhalb der Kammer Wachstum bei 30 ° C für 120-168 h wachsen. Eine erfolgreiche Kultur sollte erscheinen leuchtend grün und haben ein OD750 nm von 0,4 – 0,6.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2 zu einer Kontrollkultur zu produzieren, die nicht mit dem Ton gemischt werden.
- Experimente mit Toten Biomasse erfordern einen zusätzlichen Schritt. Autoklaven die 1 L Flasche Kultur für 60 min bei 121 ° C und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
(2) experimentelle einrichten
- Platzieren Sie einen rechteckige Acryl Tank (Länge 20 cm), Breite 5,1 cm und Höhe von 30 cm vor einer Bank von Leuchtstoffröhren (neun T8 Lampen, mindestens 2.600 Lumen; Abbildung 1) 19.
- Legen Sie eine durchscheinende, weiße Plastikfolie zwischen der Bank von Lichtern und den Tank, das Licht zu verbreiten, der den Tank durchscheint. Diese Einrichtung wurde von Sutherland Et al. 19
- Mark Acryl Tank in einer Höhe von 10 cm, gemessen senkrecht von der Basis. Alle Messungen sollten in dieser Höhe in der Wassersäule, die Kohärenz der alle Probenahme erfolgen.
- Legen Sie eine Kamera auf einem Stativ, 1 m vor dem Tank, jedes Experiment aufzunehmen. Eine Videokamera wird empfohlen, da Bilder aus video-Dateien extrahiert werden können, und mithilfe mathematischer Modellierungssoftware Videodateien können zur Beilegung Dynamik19modelliert.
- Platzieren Sie ein schwarzes Tuch über die leichte Bank, Tank und Kamera, das Experiment von externen Lichtquellen (Abbildung 1) zu schützen.
(3) Flockung experimentelles Protokoll
- Sammeln Sie die 400 mL Kultur (Schritt 1.2), einen großen Messzylinder und 600 mL zusätzliche Wachstum Medien in eine 1 L Flasche (Schritt 1.2.5).
- Verdünnen Sie die 400 mL-Kultur (erste Zellkonzentration von 4 – 6 mg/mL) mit zusätzlichen Wachstumsmedien (A + oder BG-11) zu Endvolumen von 1 L mit den Messzylinder. Fügen Sie diese Lösung mit dem Acryl Tank.
- Bereiten Sie 2 mL Microfuge Röhren durch Kennzeichnung und legte sie in einer günstigen Lage in der Nähe von Acryl Tank. 50 g aus Ton für das Experiment zu messen.
- Beginnen Sie video-Aufzeichnung. Im Falle mehrerer Experimente können ein Zeichen mit dem Experiment Bezeichner vorübergehend vor der Kamera statt.
- Mit einer Pipette, nehmen Sie eine 1 mL Probe und platzieren Sie es in einem beschrifteten Microfuge Rohr. Verwenden Sie dieses Beispiel, um die ersten Cyanobakterien Zellzahl bestimmen durch die Messung der OD750 nm Werte. Nehmen Sie alle Proben in dreifacher Ausfertigung, um exakte Ergebnisse zu gewährleisten.
- Gießen Sie schnell den Ton (50 g) in den Tank unter kräftigen rühren mit einem mitreißenden Stick für 10 – 15 s.
- Der Timer gestartet und die ersten 1 mL Probe Chl eine Bestimmung mit einer Pipette P1000 (Probe Zeit0).
- Nehmen Sie zusätzliche Proben in angemessenen Zeitabständen (z.B., 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min und 240 min.).
- Wenn das Experiment beendet ist, speichern Sie die Videodatei, schalten Sie die Video-Kamera und verarbeiten Sie alle Proben für Chl eine Bestimmung (Schritt 4).
- Autoklaven der restliche Lehm/Cyanobakterien Lösung. Abhängig von Cyanobakterien Arten, lokaler Gesetzgebung und Politik Lab entsorgen Sie die Lösung mit geeigneten Methoden. Reinigen der Tank mit Wasser und Seife, spülen Sie ihn mit destilliertem Wasser und Luft trocknen.
- Bereiten Sie ein kontrollexperiment mit kein Ton hinzugefügt. Nehmen Sie Proben zu den gleichen Zeitpunkten. Diese Daten können verglichen werden, an die anderen experimentellen Daten zu bestätigen, dass die Einschwingzeit Preise aufgrund der Flockung mit Ton, kein Ergebnis einer natürlichen Abrechnung verbessert werden.
- Wenn Tote Biomasse während des Experiments verwendet wird, verwenden Sie die gleichen experimentelle Verfahren. Jedoch erfordert die Beseitigung Verfahren der Lösung nicht autoklavieren.
4. Probieren Sie Verarbeitung und Auswertung
- Chl eine Konzentration in jeder Zelle Probe mittels eines Verfahrens von Owttrim16geändert zu bestimmen. Einmal gesammelt, pellet-Zellen von jeder Probe für 3 min bei 13.000 X g mit einem Microcentrifuge bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie überschüssiges Medium mit einer Pipette P1000 und 1 mL 100 % Methanol (20 ° C). Wirbel der Probe auf Hochtouren für 1 min um die Zelle Pellet aufzuwirbeln.
Achtung: Methanol ist giftig und brennbar. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille und fernhalten Sie Methanol von Zündquellen. - Inkubieren Sie die Proben bei-20 ° C für 24 h zur Gewinnung von Chl eineErleichterung.
- Nach der Inkubation pellet die zelltrümmer wie unter 4.1 beschrieben, die grüne überstand an eine Küvette mit einer Pipette übertragen und legen Sie die Küvette in das Spektrophotometer. Die Probe zur Ruhe im Spektralphotometer für 1 min um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Ton innerhalb der Stichprobe setzt sich und nicht bei der Messung stört zu ermöglichen.
- Spektralphotometrisch Chl eine Konzentration zu bestimmen, durch Messung der Extinktion bei 665 nm und 652 nm und OD bei 750 nm. Die Chl eine Konzentration wird bestimmt mit der Formel Chl eine = 16,29 x (ein665 - OD750) - 8.54 x (eine652 - OD750) 20. CHL Konzentration dient als Proxy Zellkonzentration. Darüber hinaus ein Umrechnungsfaktor von 7,4 x 1010 Zellen/L = 10 g/L21 kann verwendet werden, um die Zellkonzentration in Gramm einige Cyanobakterien Arten berechnen.
- Grundstück berechnet Chl Werte im Vergleich zur Zeit .
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Representative Results
Wenn Sie Ton ausgesetzt, werden Zellen Zellen aus Aussetzung22gebracht. Dies zeigt sich in die repräsentativen Ergebnisse hier gegeben. Preise, die Wirkung des Tones auf die Cyanobakterien Bevölkerung bestimmen und die Sedimentation zu beobachten, wurden zwei Experimente durchgeführt, bei denen vorkommenden und Synechocystis 50 g/L-Kaolin-Tonerde (Tabelle 5 – 6, ausgesetzt waren Abbildung 2-3). Cyanobakterielle Kulturen wurden angebaut, wie in Schritt 1 beschrieben. Anschließend nach dem Einrichten des Tanks (Schritt 2), war verdünnte vorkommenden Kultur in den Tank geschüttet und mit 50 g Kaolin-Tonerde nach Schritt 3 gemischt. Dies wurde für die Synechocystis Kultur wiederholt. Alle Proben wurden von der gleichen Position im Tank gesammelt. Die Proben wurden verarbeitet und Messungen der OD652 und OD665 sowie die berechneten Chl einen Wert für vorkommenden (Tabelle 5) und Synechocystis (Tabelle 6) erhalten. Diese Ergebnisse waren auf Liniendiagramme grafisch dargestellt und im Vergleich zu den Ergebnissen der Standards zu bestimmen, ob die Sinkgeschwindigkeit von Cyanobakterien/Ton-Gemischen höher als die natürliche Sinkgeschwindigkeit von Cyanobakterien nur war. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cyanobakterien Populationen aus Aussetzung innerhalb von 10 min Ton Exposition (Abbildung 2, -3) gebracht wurden. Die marine vorkommenden zeigte mehr rapide Sedimentation als Süßwasser Synechocystis, die im Einklang mit der Hypothese ist das dreiwertige Kationen (weit verbreitet in das Wachstumsmedium, das den Salzgehalt des Salzwassers imitiert) fungieren Sie als der Überbrückung Vermittler zwischen die tonteilchen und Bakterienzellen, Flockung und Sedimentation1zu erleichtern.
Es ist wichtig zu beachten, dass in Abbildung 3, gibt es einige ungewöhnlich hohe Ergebnisse, speziell an Daten Punkt 2. Dies ist ein Beispiel der Probenverarbeitung während welcher Schritt 4.4 nicht ausreichend folgte und die Probe wurde während der Messung trübe. Dies führt zu einem künstlich hohes Ergebnis (Abbildung 2, Daten Punkt 2). Ein Beispiel für Bilder in Zeitreihen, extrahiert aus einem Video sind in Abbildung 4, adaptiert von Playter Et al.angegeben. 22. es ist wichtig zu beachten, dass Kaolinit (nicht Kaolin) in Playter Et al.verwendet wurde. 22.
Abbildung 1 : Erläuternde Diagramm zur Veranschaulichung der Versuchsaufbau. Eine Videokamera ist mindestens 1 m aus dem Tank-Gerät einrichten. Der Tank ist mit 1 L von Cyanobakterien und flüssigen Medien gefüllt. Leuchten die Panzer von hinten und das Licht wird durch eine durchsichtige Folie verteilt. Diese gesamte eingerichtet ist mit einem schwarzen Tuch, zusätzliche Lichtquellen zu beseitigen drapiert. Diese Zahl wurde von Sutherland Et al.modifiziert. 19. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Chl Konzentrationen berechnet aus der OD-Werte in Tabelle 1 angegebenen. Diese Werte sind von einer vorkommenden /Kaolin Mischung (gelb). Vergleich mit Chl Konzentrationen für vorkommenden nur (blau) zeigt eine erhöhte Sedimentation Rate für die Cyanobakterien/Ton-Mischung. Diese Zahl wurde von Playter Et Al. modifiziert 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Chl eine Konzentrationen aus den OD-Werte in Tabelle 2 aufgeführten berechnet. Diese Werte sind vom Synechocystis /Kaolin Mischung (gelb). Vergleich mit Chl Konzentrationen für Synechocystis nur (blau) zeigt eine erhöhte Sedimentation Rate für die Cyanobakterien/Ton-Mischung. Diese Zahl wurde von Playter Et Al. modifiziert 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative zeitlichen Verlauf der vorkommenden-Kaolinit Ablagerung. Diese Schnappschüsse werden in diskreten Zeitintervallen (1 min) aus dem aufgezeichneten Video extrahiert. Diese Zahl wurde von Playter Et Al. modifiziert 22. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Für 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8,2 |
| 1 mL P1 Metalle Lager * |
Tabelle 1: Rezept für A + Media 14 . Siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung des P1-Metall-Lager. Dieses Rezept ergibt 1 L der Medien.
| Für 1 L-P1-Metall-Lager |
| 34,26 g H3BO3 |
| 4,32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0,315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (85 %) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0,01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabelle 2: Rezept für P1 Metalle Lager für A + Medien erforderlich.
| Für 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL Zitronensäure H2O |
| 1 mL Eisenchlorid Ammonium Citrate |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 Mikroelemente * |
Tabelle 3: Rezept für BG-11 Medien 16 . Siehe Tabelle 4 für die Zusammensetzung des A5 Mikroelemente. Dieses Rezept ergibt 1 L der Medien.
| Für 1 L Stammlösung |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| 0,222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0,390 g Na2MoO4 2 H2O |
| 0,079 g CuSO4 5 H2O |
| 0,40 g CoCl2 6 H2O |
Tabelle 4: Rezept für A5 Mikroelement Lager für BG-11 Medien erforderlich.
| Probieren Sie Zeit (min) | OD-665 nm | OD-652 nm | CHL ein (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0,428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0,036 | 0.084 |
| 15 | 0,027 | 0,025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
Tabelle 5: OD 665 und OD 652 Messungen für Vorkommenden in Anwesenheit von 50 g/L-Kaolin-Tonerde. CHL Werte werden berechnet mit der Formel in Schritt 4.4. Beachten Sie, dass Proben t6 und t7 fehlen. Dies ist ein Beispiel für eine konsequente Abtastintervall entsprechend dem Zelle-Probenahme-Protokoll nicht zu halten. Daten für den Standard stammt aus Playter, Et Al. (2017) 2.
| Probieren Sie Zeit (min) | OD-665 nm | OD-652 nm | CHL ein (mg/mL) |
| -1 | 0,384 | 0,345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0,104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0,048 | 1.463 |
| 120 | 0,016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0,011 | 0,005 | 0.136 |
Tabelle 6: OD 665 und OD 652 Messungen für Synechocystis in Anwesenheit von 50 g/L-Kaolin-Tonerde. CHL Werte werden anhand der Formel in Schritt 4.4 bereitgestellt.
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Discussion
Flockung, katalysiert durch Cyanobakterien Zelle-Ton Interaktion hat ein großes Interesse in den Bereichen Ökologie und Technik2,3,4,5,6,7 angezogen. ,8,9,10,11,12, aber die Untersuchung dieser Wechselwirkungen mit der Absicht der Modellierung der Ablagerung der Sedimente Einlagen (z. B. Schiefer) ist relativ neu. Die Visualisierung dieses Prozesses wurde in diesem Fall nicht für sedimentologische Anwendungen berichtet. In vergangenen Flockung Studien haben diese Wechselwirkungen untersucht, durch Mischen von Lehm und Cyanobakterien in Reagenzgläser, Gläser oder Becher und Probenahme bei diskrete Zeitabständen9,11,12, 26 , die Veränderungen in der Zelle Konzentration durch die Zeit bestimmen. Diese Studien haben die Konzentration von Cyanobakterien Zellen auf unterschiedliche Weise gemessen. Beispielsweise wurden die gesampelten Cyanobakterien Zell-Populationen durch zählen mit einem Mikroskop9,11,12,26gemessen. Im Vergleich zu den ursprünglichen Zellkonzentration kann die Entfernung Effizienz berechnete9,11,12,26. In einer separaten Studie, nach Abzug der Ton/Zelle Mischung zu Regeln wurde die Flüssigkeit verbleibenden oberhalb der sesshaften Zelle/Ton-Sediment beprobt und analysiert für Fluoreszenz zur Schätzung der Anzahl der verbleibenden Zellen in Suspension3. Messungen der Chl eine direkt vom Spalte Wasserproben wurden auch zur Zelle Konzentration8,10berechnen.
Im Gegensatz dazu misst unsere Methodik der Zellen in der Suspension im Laufe der Zeit, aufbauend auf die Methodik der Sengco, Et al. 4 von Messungen an ausgewählten Zeiten während des Prozesses, und koppeln diese Zeitintervalle mit Echtzeit-video-Bildgebung. Im Vergleich mit anderen experimentelle Protokolle mit der Ansiedlung des Tones im Beisein von anionischen Flockungsmittel unterscheidet sich mit biologischen (Algen oder Cyanobakterien) oder nicht-biologischen (synthetische flockiges Agenten) Flockungsmittel, unsere Analyse auf vielen zählt. Zunächst beinhaltet unsere Studie die Verwendung von kokkoiden Meeresarten von Cyanobakterien, während viele andere Studien beinhalten Süßwasser-Arten oder Arten, die produzieren extrazelluläre Polysaccharid Stoffe5,23,24 , 25. Darüber hinaus unsere Studie beinhaltet die Verwendung von standard-Tank, in dem die Lösung statisch bleibt. Dies kontrastiert mit Untersuchungen mit Reagenzgläsern oder Zylinder3,12,14 oder Flume Tanks, wo die Strömung eine Variable Zinsen6,7 ist. Die Statik der experimentellen Methode ermöglicht die Messung der Baseline sedimentationsraten wo sind Stapelfaser nicht in der Schwebe durch turbulente Strömung gehalten. Darüber hinaus kann mit einem Tank statt einem Reagenzglas, Glas oder Becher, zur besseren Visualisierung der daraus resultierenden Ablagerungen wegen der flachen Tank-Seiten; die Videobilder zeigen keine Verzerrung durch geschwungene und das Licht gleichmäßig verteilt ist. Drittens: die Methodik hier beschriebenen Maßnahmen Flockung Preise über sowohl die kurz (2 min. Takt) oder lange (Stunden-Takt); Darüber hinaus können Bilder in Maßstäben von Sekunden bis Minuten, so dass sowohl Visualisierung des Prozesses und eine zusätzliche Messung der Sinkgeschwindigkeit kompiliert werden. Die meisten Studien Maßnahme Flockung Preise über halbe bis volle Stunde Abständen5,6,23,25 oder einfach Maßnahme die endgültige Zahl der Zellen links in der Schwebe nach ein einziges Mal zeigen (2 – 2,5 h)9,24, obwohl einige Studien9 haben Veränderungen in der Zelle oder Chl eine Konzentration über 2-Minuten-Intervallen gemessen. Das Abtastintervall gewählt ist kritisch, da Flockung, schnell (innerhalb von 5 – 10 min auftreten kann)22. Zu guter Letzt eine große Stärke unserer Methodik ist, dass es in Echtzeit Bilder von der Flockung Prozess, nicht nur der hergestellten Aggregate produziert (zB., Avnimelech Et Al., 1982)24. Mit zwei Zeilen mit Daten, Zellkonzentration von sampling und visuelle Beweise, stärkt die Zuverlässigkeit der Ergebnisse und robuste Schlussfolgerungen unterstützt.
Geeignet für Flockung Messraten von Lehm und Cyanobakterien, unser Protokoll erfordert Sorgfalt in Bezug auf den Probenahmeort innerhalb des Tanks. Der gleichen Gegend des Tanks (X, y, Z) muss jedes Mal abgetastet werden, oder die Probenergebnisse verzerrt werden können. Auch muss darauf geachtet werden, um alle Partikel zu begleichen, bevor OD Messungen vorgenommen werden können. Wichtige Schritte umfassen: (i) unter Verwendung einer entsprechenden Samplingintervall für alle Experimente konsistent bleibt, und Ii) zu gewährleisten, dass der Ton/Cyanobakterien Pellet nach Zugabe von Methanol zu gewährleisten die ausreichende Absaugung von ausreichend gebrochen ist Chlorophyll aus den Zellen.
Die hier beschriebene Technik ist auch auf Modellierung Flockung voll sauerstoffhaltigen Bedingungen beschränkt. Die experimentelle Apparate und Verfahren müsste geändert werden, um eine geschichtete Wassersäule mit anoxischen unten Wasser zu modellieren.
Die sedimentologische im Rahmen hat diese Methode das Potenzial, zu Modellierung Ablagerungen von unterschiedlichen Ton-Verhältnisse oder biologischen Materialien angewendet werden, um Aspekte wie Veränderungen in der organischen Substanz und Salzgehalt von Fließgewässer-Eingang zu verstehen. Darüber hinaus können die Sedimente produziert mit dieser Methode verwendet werden, zu untersuchen, die Auswirkungen der möglichen Sturm Überarbeitung auf Floc-Kohärenz von Remixen oder Unruhe. Durch die Kombination der direkten Messung der Cyanobakterien Zellkonzentration mit visuellen Bildern, dieses Protokoll transzendiert die traditionellen Anwendungen der Cyanobakterien/Ton Flockung Prozesse und ermöglicht für diese Prozesse auf sedimentologische angewendet werden Modellierung von den Felsen-Datensatz.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen dankbar, Mittel aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (05448, 165831 und 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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