Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

קביעת שיעור ליישוב של קליי/Cyanobacterial Floccules

Published: June 11, 2018 doi: 10.3791/57176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1,3, 4, 1, 1, 1, 1
1Department of Earth and Atmospheric Sciences, University of Alberta, 2Department of Biological Sciences, University of Alberta, 3Department of Earth Sciences, Simon Fraser University, 4Earth Sciences Department, University of Toronto

Summary

יכול להיות בצורה הטובה ביותר בסביבת מעבדה מבוקרת חקר את האינטראקציה והצטברות של קליי, תאים חיידקיים בתחום הימי, שנצפתה סביבות טבעיות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט, אשר מתאר שיטה למדידת קצב שקיעת חומר ו cyanobacterial floccules.

Abstract

המנגנונים לגורם המרכזי עליו מושתתת בתצהיר של פרטניות, עדיין במידה רבה נדונים משקעים אורגני עשיר. באופן ספציפי, ההשפעה של האינטראקציה של חלקיקים חימר עם תאים cyanobacterial תגובתי, פלנקטוניים לרשומה משקע מתחת למד. אינטראקציה זו הוא תורם פוטנציאלי מרכזי פצלי דגמי depositional. בתוך סביבה של המעבדה, שיעור flocculation והצטברות של חומרים אלה יכול להיות בדק ומדד בסביבה מבוקרת. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת קצב שקיעת cyanobacterial/קליי תערובות. מתודולוגיה זו הוכח דרך התיאור של שני ניסויים מדגם: הראשונה משתמשת קאולין (טופס מיובש של קאוליניט) ו Synechococcus sp. PCC 7002 (כחוליות coccoid ימית), ומשתמש השני קאולין, Synechocystis sp. PCC 6803 (כחוליות coccoid מים מתוקים). תרבויות cyanobacterial מעורבבים עם כמויות משתנות של קליי בתוך מנגנון טנק שתוכנן במיוחד ממוטבת כדי לאפשר הקלטה צילומי ווידאו רציפה, בזמן אמת. ההליכים דגימה מפורטים כמו גם פרוטוקול פוסט אוסף למדידה מדויקת של כלורופיל שממנו ניתן לקבוע את ריכוז cyanobacterial בתאי שנותרה ההשעיה. באמצעות שכפול ניסיוני, פרופיל נבנה המציג קצב שקיעת.

Introduction

באמצעות נוכח תנאי הסביבה ותהליכים להסיק מעבר מנגנונים depositional כבר זמן רב נדבך של סדימנטולוגיה. בעוד מקבילים depositional מודרניים, כגון הים השחור, שימשו כדי להבין בתצהיר של הפקדות אורגני עשיר, פרטניות, ניסויים במעבדה יש פוטנציאל לשפוך אור נוסף על המקור של פצלי פיקדונות. אזור אחד של החקירה היווצרותם של שיילס שחור הוא קצב התצהיר מנגנון היווצרות המקורי. באופן מסורתי, זה יש כבר המשוערות שיילס שחור נוצר בסביבות איפה קצב שקיעת פרודוקטיביות העיקרי, חומר אורגני נשימה המחירים לקדם שימור חומר אורגני משקעים1,2 ,3. עם זאת, תפקידו של cyanobacterial ואת קליי flocculation נותר במידה רבה ולהתייחסות. מנגנון זה של flocculation יאפשר בתצהיר מהירה של משקעים אורגני עשיר, פרטניות להתרחש, ומצריכות לא חמצן נמוך. בהתחשב הנחת, פרוטוקול זה יש שתי מטרות: 1) למדוד את קצב שקיעת של floccules cyanobacterial/קליי, ו 2) להמחיש את התהליך שקיעת בזמן אמת. מתודולוגיה זו, בנוסף ניתוח גיאוכימיים, שימש כדי להדגים שאת flocculation cyanobacterial/קליי עשוי למעשה להיות מנגנון חשוב עבור תצורת פצלי1. אמנם במקור מיועד דגמי פצלי התצהיר, שיטה זו ישימה לתחומים נוספים כגון ביולוגיה, סביבתיים משיקום שבו ההשפעה של קליי קלט על חילוף החומרים חיידקי, האוכלוסייה צריך להימדד.

מחקרים רבים נערכו כדי לבחון את flocculation של כחוליות, קליי, להקלת פורח אצה מזיקים2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. עם זאת, תוך מדידת ריכוז תא לאורך זמן, מחקרים אלה לא החלת כחוליות/קליי flocculation דגמי בתצהיר של הרשומה רוק. ככזה, מחקרים אלה חסרים רכיב חזותי, אשר יכול להיות קריטי כאשר דגמי עבר תהליכים סדימנטולוגיות. בנוסף, הרוב המכריע של המחקרים לנצל את ספירת תאים (למשל, פן et al. 11), אשר יכול להיות מייגע. השיטה שלנו, עם התפתחויות אחרונות מדידה flocculation cyanobacterial, קובע את השינויים בריכוז תא cyanobacterial על ידי מדידת כלורופיל (קלוא ) במרווחי זמן בדידים. זיווג קלוא מדידה עם נתונים חזותיים היא גישה חדשה, אשר יכול לשמש כדי להסיק תנאים depositional. תמונות שנוצרו יכול לשמש גם כדי לחשב את קצב שקיעת אחרי העבודה מ- Du ואח. 13. השילוב של נתונים מספריים החזותי מחזק את אמינות התוצאות. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות פרוטוקולים נוספים ומאפשר שיקוע של ביומסה מת, קליי גם להיות נצפתה. זה חשוב כאשר שוקלים מעבר סביבות סדימנטולוגיות, שם חי, מת ביומסה שאירעה אי שיתוף. ההבדלים בהתנהגות של ביומסה מת במהלך flocculation (לדוגמה, ןוטיק flocculation rate) פוטנציאל להיות השלכות סדימנטולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תרבויות Cyanobacterial

  1. הכנת חיסון תרבויות באמצעות מדיה מוצק
    1. להשיג axenic תאים cyanobacterial אמריקאי סוג תרבות אוסף או אוסף תרבות פסטר. לדוגמה, חד־תאיות, ימית Synechococcus sp. PCC 7002 הושג מאוסף תרבות פסטר, זה יכונו להלן בשם Synechococcus.
    2. לשמור על תאים Synechococcus על צלחות המכילה מוצק מדיה (+ נוזל מדיית14 ו- 1.5% אגר15). אלה יכונו להלן כמו חיסון תרבויות.
    3. דגירה הצלחות ב- 32 ± 2 ° C עם אור רציף הניתנים בגיל 30 – 50 µmol פוטונים ז-2 s-1,15,18.
    4. חזור על שלבים 1.1-1.3 ולהחליף + מדיה עם BG-1116 בשלב 1.1.2 עבור מינים cyanobacterial מים מתוקים, כגון Synechocystis sp. PCC 680316,17, התייחס מכאן והלאה כמו Synechocystis. עיין בטבלאות 1-4 על ההרכב של מדיה א + ו- BG-11.
  2. הכנת תרבויות נוזלי: ניסוי טנק דורש תרבות cyanobacterial 400 מ ל.
    1. לאסוף את אחד 250 מל שני 1 ליטר עמידים בחום Erlenmeyer את הבקבוק.
    2. יש לשטוף את הבקבוק כל פתרון חומצת מימן כלורי (HCl) 4 מטר (30 מ"ל HCl פתרון עבור כל הבקבוק), ואחריו מים מזוקקים.
      התראה: חומצת מלח הוא מאכל רעילים. ודא כי חלוק מעבדה בטיחות משקפי מגן, כפפות עמידי חומצה שחוקים תוך שימוש הפתרון HCl 4 M. לבצע שלב זה בכיור מעבדה ופעל תקנות מקומיות בנוגע לרשות הפתרון HCl 4 M
    3. למלא את הבקבוק 250 מ ל 50 מ של נוזל מדיית (A + או BG-11). מילוי הבקבוקון 1 ליטר אחד עם 400 מ של נוזל מדיית (A + או BG-11) ואת הבקבוק 1 ליטר אחרים עם 600 מ של מדיה (A + או BG-11).
    4. חותם כל בקבוק עם פקק קצף חדיר גז ולכסות קצף בסימפטומים ולא במחלה עצמה, flask בצוואר עם נייר כסף.
    5. תווית אוטוקלב המבחנות-121 מעלות צלזיוס ו kPa 100 עבור 25 מינימלית לאפשר המבחנות להתקרר לטמפרטורת החדר.
    6. הכן תא למינארי על ידי לחיטוי השטח עם אלכוהול 70%.
    7. לאסוף את לולאות תיל חיסון, מבער בונזן, את הבקבוקון מדיה נוזל מקורר 50 מ ל (מתוך שלב 1.2.5), התרבות חיסון (מתוך שלב 1.1). מקם פריטים אלה בשכונה זרימה מעוקר.
    8. לעקר את הלולאה חיסון תיל בקצרה בעזרת להבת מבער בונזן ולאפשר לו להתקרר.
    9. גרור הלולאה מגניב על פני התרבות חיסון לאסוף תאים cyanobacterial.
    10. הסר את קצף בולם ואת כובע לסכל הבקבוקון 250 מ ל (בלי לגעת את פקק קצף), לעקר את שפת הבקבוק Erlenmeyer על ידי מעבר זה בקצרה הלהבה.
    11. להטות את הבקבוקון אז התקשורת נמצא ליד צוואר הבקבוק והכנס למעגל חיסון מצופה עם תאים לתוך הבקבוק. ברגע הלולאה שקוע לתוך כלי התקשורת, מוסיפים את הלולאה חיסון כדי להסיר התאים.
    12. להסיר את הלולאה חיסון ולחטא מחדש את שפתו של הבקבוק בעזרת להבת מבער בונזן.
    13. החלף את קצף בולם ואת רדיד על הבקבוק Erlenmeyer (בלי לגעת את קצף בסימפטומים ולא במחלה עצמה).
    14. לעקר את הלולאה חיסון בקצרה בתוך הלהבה מבער בונזן.
    15. להכין חדר צמיחה (המכונה תא הצמיחה) כאשר הטמפרטורה נשמרת ב- 30 ° C15,18 ועוצמת האור היא 30 – 50 µmol פוטונים ז-2 s-1,15,18 . לחות לא נשלטת באופן פעיל.
    16. לאפשר התרבות חוסנו 50 מל ל דגירה ע י ניעור ב 150 סל ד בבית הבליעה צמיחה, עם טמפרטורת מתוחזק 30 ° C. לשמור על הפה של הבקבוק מכוסה במהלך התסיסה כדי לשלוט הפסדים אויר ולמנוע זיהום.
    17. אפשר את culture(s) cyanobacterial לגדול עבור 96 h. תרבות מוצלח צריך להופיע ירוק בהיר ויש של צפיפות אופטית (OD)-750 ננומטר של 0.4-0.6.
    18. ברגע התרבות גדל מספיק, הניחו את התרבות 50 מ ל ואת הבקבוק 1 ליטר המכיל 400 מ של התקשורת נוזלי (מתוך שלב 1.2.5) למינארי. ודא למכסה הזרימה בשלב הבא סטיריליים 1.2.6.
    19. חזור על צעד 1.2.10 בשתי מבחנות בתוך תא למינארי.
    20. שופכים את התרבות 50 מ לתוך 400 מ של התקשורת הבקבוקון 1 ליטר ולחטא מחדש את שפתו של הבקבוק 1 ליטר בעזרת להבת מבער בונזן.
    21. במקום של הכיפה בסימפטומים ולא במחלה עצמה ו לסכל קצף, לצרף מנגנון מבעבע סטרילי המורכב של קצף בסימפטומים ולא במחלה עצמה, פיפטה, צינורות פלסטיק, מסנן בשורה, רדיד כיסוי הפה של הבקבוק.
    22. להתסיס את הבקבוקון 1 ליטר ב 150 סל ד ב 30 ° C עם המנגנון bubbler מחוברת משאבת אוויר, אשר מסחררת תערובת אוויר humidified דרך15,פתרון18 -300 mL/min.
    23. אפשר את culture(s) לגדול בתוך התא צמיחה ב 30 ° C עבור h 120 – 168. תרבות מוצלח צריך להופיע ירוק בהיר ויש OD750 ננומטר של 0.4-0.6.
    24. חזור על שלב 1.2 לייצר תרבות שליטה, אשר לא יהיה מעורב עם החימר.
    25. ניסויים באמצעות ביומסה מת דורשים צעד נוסף. אוטוקלב הבקבוקון 1 ליטר תרבות עבור 60 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.

2. ניסיוני הגדר

  1. שמים מיכל אקריליק מלבניות (באורך של 20 ס מ), רוחבו של 5.1 ס מ, גובה 30 ס מ בנק של נורות ניאון (נורות T8 תשע, לומן 2,600 לפחות; איור 1) 19.
  2. מניחים יריעת פלסטיק שקוף, לבן, בין הגדה של אורות למיכל לפזר את האור, שבו זורחת דרך הטנק. זה היה ממאמרו של סאתרלנד. et al. 19
  3. מארק למיכל אקריליק בגובה 10 ס"מ, נמדד אנכית מהבסיס. כל המדידות צריך להיעשות בגובה הזה בעמודה מים כדי להבטיח מרקם של כל דגימה.
  4. במקום המצלמה על חצובה, 1 מ' מול הטנק כדי להקליט כל ניסוי. מצלמת וידאו מומלצת כפי תמונות יכול להיות מופק קבצי וידאו, באמצעות מודלים מתמטיים תוכנות, קבצי וידאו יכול לשמש כדי דגם dynamics שיקוע19.
  5. הצב בד שחור מעל בנק אור, מיכל, המצלמה כדי לחסום. את הניסוי ממקורות אור מבחוץ (איור 1).

3. flocculation נסיוני

  1. לאסוף את התרבות 400 מ ל (שלב 1.2), משורה גדולים וכן 600 מ של צמיחה נוספת מדיה בבקבוקון 1 ליטר (שלב 1.2.5).
  2. לדלל את התרבות 400 מ ל (ריכוז תא הראשונית של 4-6 מ"ג/מ"ל) עם מדיה לצמיחה נוספת (A + או BG-11) לנפח סופי של 1 ליטר באמצעות משורה. להוסיף פתרון זה למיכל אקרילי.
  3. להכין 2 מ"ל microfuge טורפדו על ידי תיוג הצבתם במיקום נוח ליד הטנק אקרילי. מידה 50 גר' חימר לניסוי.
  4. התחל הקלטת וידאו. במקרה של ניסויים מרובים, שלט עם המזהה הניסוי ניתן לקיים באופן זמני לפני המצלמה.
  5. באמצעות פיפטה, לקחת דגימה 1 מ"ל ולמקם אותו בצינור microfuge עם תוויות. השתמשו בדוגמה זו כדי לקבוע את ספירת התאים cyanobacterial הראשונית על ידי מדידת OD750 ננומטר ערכים. לקחת דגימות כל דולר כדי להבטיח תוצאות מדויקות.
  6. במהירות שופכים לתוך הטנק החימר (50 גרם) עם עצבנות נמרצת באמצעות מקל מלהיב עבור s 10-15.
  7. להתחיל את הטיימר ולקחת את הדגימה הראשונית 1 מ"ל עבור קלוא נחישות באמצעות פיפטה של P1000 (לדוגמה זמן0) .
  8. לקחת דוגמאות נוספות במרווחי זמן מתאים (למשל1 דקות, 2 דקות, מינימום 3, 4 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, מינימום 180, 240 דקות).
  9. לאחר סיום הניסוי, לשמור את קובץ הווידאו, כבה את המצלמה ולעבד הדוגמאות עבור קלוא על הקביעה (שלב 4).
  10. אוטוקלב חימר/cyanobacterial הפתרון הנותרים. בהתאם cyanobacterial מינים, תקנות מקומיות ומדיניות מעבדה, תשליך הפתרון באמצעות שיטות המתאימות. לנקות המיכל עם מים וסבון לשטוף אותו עם מים מזוקקים, אוויר יבש זה.
  11. להכין ניסוי שליטה עם לא היה חומר נוסף. לקחת דגימות באותן נקודות זמן. ניתן להשוות נתונים אלה לנתונים ניסיוני אחרים כדי לאשר כי המחירים שיקוע משופרים כתוצאה flocculation בחומר, לא תוצאה טבעית ליישב.
  12. אם ביומסה מת במהלך הניסוי, השתמש בהליך ניסיוני אותו. עם זאת, הנוהל לרשותו של הפתרון אינו דורש autoclaving.

4. לטעום עיבוד והערכה

  1. לקבוע קלוא ריכוז בכל מדגם התא באמצעות הליך שונה Owttrim16 . לאחר שנאספו, גלולה תאים מן כל מדגם למשך 3 דקות ב x 13,000 g באמצעות microcentrifuge בטמפרטורת החדר.
  2. להסיר את עודף מדיה באמצעות פיפטה P1000 ולהוסיף 1 מ"ל של 100% מתנול (20 ° C). מערבולת המדגם במלוא המהירות עבור 1 דקות עד resuspend בגדר התא.
    התראה: מתנול הוא רעיל, דליק. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים, מתנול להרחיק מקורות ההצתה.
  3. דגירה בדגימות ב-20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה להקל על הפקת קלוא .
  4. לאחר דגירה, גלולה ההריסות הסלולר כמתואר ב- 4.1, להעביר את הירוק supernatant cuvette באמצעות פיפטה ולאחר למקם את cuvette ספקטרופוטומטרים. לאפשר את הדגימה כדי לנוח ספקטרופוטומטרים עבור 1 דקות להבטיח כל קליי שנותרו בתוך המדגם ישקע לא מפריע למדידה.
  5. לקבוע קלוא ריכוז spectrophotometrically על ידי מדידת ספיגת-665 ננומטר 652 nm ו OD-750 ננומטר. קלוא ריכוז של נקבעת באמצעות נוסחה קלוא 16.29 x (665 - OD750) - = 8.54 x (652 - OD750) 20. קלוא ריכוז משמש כמדד עבור התא ריכוז. בנוסף, מקדם ההמרה של 7.4 x 1010 תאים/L = 10 גרם/L21 יכול לשמש כדי לחשב את הריכוז תא גרמים של מינים מסוימים cyanobacterial.
  6. מגרש קלוא ערכים מחושבים נגד הזמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר נחשף קליי, תאים cyanobacterial מובאים מתוך השעיית22. הוכח בתוצאות נציג ניתנות כאן. כדי לקבוע את ההשפעה של חימר על אוכלוסיות cyanobacterial להתבונן משקעי סחף את המחירים, שני ניסויים נערכו במהלכן נחשפו Synechococcus ו- Synechocystis כדי חימר קאולין 50 גרם/ליטר (טבלה 5 – 6, איור 2–3). תרבויות cyanobacterial גדלו כפי שמתואר בשלב 1. לאחר מכן, לאחר הגדרת למיכל (שלב 2), התרבות Synechococcus מדולל היה נשפך לתוך הטנק, מעורבב עם 50 גר' חימר קאולין בעקבות שלב 3. הנ ל חזר על התרבות Synechocystis . כל הדגימות שנאספו מאותו מיקום במיכל. הדגימות עובדו ניתנת מדידות של יתר652 , OD665 , כמו גם קלוא הערך המחושב עבור Synechococcus (טבלה 5) ו- Synechocystis (טבלה 6). תוצאות אלו היו ההתוויה גרפית של קו חלקות, בהשוואה לתוצאות תקנים כדי לקבוע אם שיעור שיקוע של תערובות cyanobacterial/קליי היה גבוה יותר מאשר הקצב שיקוע טבעי של כחוליות בלבד. תוצאות אלו מדגימים כי האוכלוסיות cyanobacterial הובאו לצאת מאיזון בתוך 10 דקות של חשיפה קליי (איור 2–3). ימית Synechococcus הראה קצב שקיעת מהירה יותר מאשר מים מתוקים Synechocystis, אשר עולה בקנה אחד עם ההשערה הזאת קטיונים כ (שכיחה במצע הגידול, אשר מחקה את המליחות של מי מלח) לפעול כסוכן גישור בין חימר חלקיקים תאים חיידקיים, הקלת flocculation ו, לכן, שקיעת1.

חשוב לציין כי איור 3, יש כמה תוצאות anomalously גבוהה, במיוחד הנתונים בשלב 2. זוהי דוגמה של עיבוד הדגימה במהלך שלב שבו 4.4 לא מספיק עקבו והפך הדגימה עכורים במהלך המדידה. זה יוצר תוצאה גבוהה באופן מלאכותי (איור 2, נקודת נתונים 2). דוגמה של תמונות בסדרה זמן, מופק וידאו מסופקים איור 4, משנת Playter et al. 22. חשוב לציין את קאוליניט (לא קאולין) היה בשימוש Playter ואח. 22.

Figure 1
איור 1 : הסבר דיאגרמה המדגימה את הגדרת הניסוי. מצלמת וידאו הוא להגדיר לפחות 1 מ' מן המנגנון טנק. למיכל מלא 1 ליטר של כחוליות ומדיה נוזלי. אורות מאירים את הטנק מאחור, האור מפוזר על ידי סרט שקוף. זה כולו להגדיר הוא עטוף במטלית שחורה לחסל את מקורות האור נוספים. איור זה השתנה מ סאת'רלנד ואח. 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : קלוא ריכוזים מחושב מתוך הערכים OD נתון טבלה 1- ערכים אלה הם מן Synechococcus /תערובת קאולין (צהוב). השוואה עם קלוא ריכוזים של Synechococcus בלבד (כחול) מראה את קצב שקיעת מוגברת על התערובת cyanobacterial/חימר. דמות זו שונתה מ. Playter et al. 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קלוא ריכוזים מחושב מתוך הערכים OD נתון בטבלה מס ' 2- ערכים אלה הם מן Synechocystis /תערובת קאולין (צהוב). השוואה עם קלוא ריכוזים של Synechocystis בלבד (כחול) מראה את קצב שקיעת מוגברת על התערובת cyanobacterial/חימר. דמות זו שונתה מ. Playter et al. 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : מסלול הזמן נציג של Synechococcus-התצהיר קאוליניט. התמונות האלה מופקים מן הווידאו המוקלט במרווחי זמן בדידים (1דקות.). דמות זו שונתה מ. Playter et al. 22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

עבור 1 ליטר
18 גרם NaCl
0.6 גרם אשלגן כלורי
ננו 1 g3
5 g MgSO4 ∙ 7 שעות2O
1 מ"ל ח'2PO4
7.2 mL CaCl2
161 μL נה2EDTA
1 מ"ל FeCl3 ∙ 6-אייץ '2O
10 מ"ל HCl טריס pH 8.2
1 מ"ל P1 מתכות מניות *

טבלה 1: מתכון + מדיה 14 . עיין בטבלה 2 להרכב של מניות מתכות P1. המתכון הזה מייצר 1 ליטר של מדיה.

עבור מניה מתכת P1 1 ליטר
34.26 g H3בו3
4.32 g MnCl2 ∙ H2O
0.315 g ZnCl
0.03 נקודות g MoO3 (85%)
0.003 g CuSO4 ∙ 5 שעות2O
0.01215 g CoCl2 ∙ 6-אייץ '2O

טבלה 2: מתכון P1 מתכות המניות הדרושות + מדיה.

עבור 1 ליטר
10 מ ל NaNO3
1 מ"ל K-2-HPO-4
1 מ"ל MgSO47 שעות2O
1 מ"ל CaCl2 2 H2O
1 מ"ל חומצה ציטרית H2O
1 מ"ל הברזל ותחמוצת אמוניום ציטראט
1 מ ל DiNaEDTA
1 מ ל נה2CO3
1 מ"ל A5 מיקרואלמנטים *

טבלה 3: מתכון מדיה BG-11 16 . עיין בטבלה 4 לקבלת ההרכב של מיקרואלמנטים A5. המתכון הזה מייצר 1 ליטר של מדיה.

עבור 1 ליטר של פתרון מניות
2.86 g H3בו3
1.81 g MnCl2 4 H2O
0.222 g ZnSO4 7 שעות2O
0.390 g נה2MoO4 2 H2O
0.079 g CuSO4 5 שעות2O
0.40 g CoCl2 6-אייץ '2O

טבלה 4: מתכון מניות A5 Microelement נדרש עבור מדיה BG-11.

דוגמת הזמן (דקות) OD 665 ננומטר OD 652 nm קלוא (mg/mL)
-1 0.563 0.373 5.986
0 0.428 0.33 4.154
5 0.112 0.046 1.432
10 0.024 0.036 0.084
15 0.027 0.025 0.226
30 0.007 0.002 0.097
60 0 0.061 0.000
120 0.007 0.061 0.000
180 0.005 0.012 0.000
240 0.005 0.012 0.000

טבלה 5: OD 665 ו- OD 652 מידות עבור Synechococcus בנוכחות חימר קאולין 50 g/L. קלוא ערכים מחושבים באמצעות הנוסחה בשלב 4.4. שימו לב: דוגמאות t6, t7 חסרים. זה דוגמה לא משאירה מרווח הדגימה עקבי לפי פרוטוקול דגימה תא. נתונים עבור התקן נלקח Playter, et al. (2017) 2.

דוגמת הזמן (דקות) OD 665 ננומטר OD 652 nm קלוא (mg/mL)
-1 0.384 0.345 3.309
0 1.863 1.739 15.497
5 0.64 0.528 5.916
10 0.217 0.216 1.690
15 0.104 0.089 0.934
30 0.126 0.169 0.609
60 0.424 0.402 3.474
90 0.115 0.048 1.463
120 0.016 0.007 0.201
180 0.012 0.004 0.161
240 0.011 0.005 0.136

טבלה 6: OD 665 ו- OD 652 מידות עבור Synechocystis בנוכחות חימר קאולין 50 גר'/ליטר. קלוא ערכים מחושבים באמצעות הנוסחה סיפקה בשלב 4.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flocculation על ידי האינטראקציה תא cyanobacterial-קליי משכה הרבה עניין בתחומי אקולוגיה הנדסית2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, עם זאת, החקירה של אינטראקציות אלה עם הכוונה של דגמי בתצהיר של משקע פיקדונות (כגון שיילס) הוא חדש יחסית. הפריט החזותי של תהליך זה, במקרה זה עבור יישומים סדימנטולוגיות, לא דווח. במחקרים flocculation האחרונות, אינטראקציות אלה נחקרו על ידי ערבוב כחוליות צנצנות, מבחנות, או בקבוקונים, דגימה זמן בדידים מרווחי9,11,12, וקליי 26 כדי לקבוע את השינויים בריכוז תא בזמן. מחקרים אלה יש למדוד את ריכוז תאי cyanobacterial בדרכים שונות. לדוגמה, האוכלוסיות שנדגמו תא cyanobacterial נמדדו על ידי ספירת באמצעות12,2611,9,במיקרוסקופ. בהשוואה לריכוז תא הראשונית, היעילות הסרת יכול להיות מחושב9,11,12,26. במחקר נפרד, לאחר המאפשר את התערובת קליי תא להתיישב, הנוזלים הנותרים מעל המשקע תא שיוחסו/קליי היה שנדגמו וניתח עבור קרינה פלואורסצנטית להעריך את מספר התאים הנותרים ההשעיה3. מדידות של קלוא ישירות מתוך עמודה דגימות מים גם שימשו לחישוב התא ריכוז8,10.

לעומת זאת, המתודולוגיה שלנו מודדת את התאים ההשעיה לאורך זמן, בניין על המתודולוגיה של Sengco, et al. 4 על-ידי לקיחת המידות עת בחר לאורך כל התהליך, זיווג אלה במרווחי זמן עם הדמיה וידאו בזמן אמת. כאשר לעומת פרוטוקולים ניסויים אחרים המערבים שיקוע של קליי בנוכחות ההפתתה anionic, ביולוגית (אצות או כחוליות) או ההפתתה הלא-ביולוגיים (סוכנים צימרי, דמויי אניץ סינתטי), באמצעות הניתוח שלנו שונה על רבים סופרת. קודם כל, המחקר שלנו כרוכה בשימוש זן coccoid ימית של כחוליות, בעוד מחקרים רבים אחרים לערב מים מתוקים מין או מינים אשר מייצרים חומרים חוץ-תאית רב-סוכר5,23,24 , 25. בנוסף, המחקר שלנו כרוכה בשימוש של טנק סטנדרטי, שבתוכו הפתרון נשאר סטטי. זה מנוגד מחקרים באמצעות מבחנות או צילינדרים3,12,14 או לבריכה טנקים, איפה זרימת נוזל משתנה של ריבית6,7. מהות השיטה הניסיונית שלנו סטטי מאפשר המדד של מחירי בסיס שיקוע, שבה floccules לא נשמרים ההשעיה על ידי מערבולות זרימת. בנוסף, באמצעות טנק במקום מבחנה, כד, או גביע, מאפשר כאחראית על ההפקדות הנובעת בשל בצדדים טנק שטוח; תמונות וידאו להראות עיוות לא בשל עיקול, האור מפוזר באופן שווה. שלישית, המתודולוגיה המתוארים בזאת באמצעים flocculation המחירים מעל קצר (2 דקות מרווחי) והן ארוך המונח (במרווחי זמן של שעה); בנוסף, תמונות הידור-סולמות של שניות עד דקות, המאפשר ויזואליזציה של התהליך הן, והן של מדידה נוספת של קצב שיקוע. רוב המחקרים מידה flocculation שיעורי מעל חצי שעה שלמה מרווחי5,6,23,25 או פשוט למדוד המספר הסופי של נותרו תאים ההשעיה לאחר זמן יחיד הצבע (2 – 2.5 h)9,24, למרות כמה מחקרים9 יש למדוד שינויים בתא או קלוא ריכוז מעל 2 מרווחי דקה . מרווח הדגימה שנבחרה היא קריטית, כמו flocculation יכול להתרחש במהירות (תוך 5-10 דקות)22. לבסוף, כוח גדול של המתודולוגיה שלנו הוא שהיא מייצרת תמונות בזמן אמת של התהליך flocculation, לא רק של מצרפי המיוצר (למשל., אבנימלך et al., 1982)24. יש שתי שורות של נתונים, התא ריכוז מהראיות מדגם וחזותית, מחזקת את אמינות התוצאות ותומך מסקנות חזקים.

בזמן מתאים למדידת שיעורי flocculation של קליי, כחוליות, הפרוטוקול שלנו דורש בדיקת נאותות לגבי מיקום הדגימה בתוך הטנק. באותו האזור של הטנק (x, y, z) חייב לטעום בכל פעם או יכול להיות מוטה תוצאות המדגם. גם יש לנקוט כדי לאפשר כל החלקיקים להתיישב לפני OD המדידות נעשות. שלבים קריטיים כוללים: i) באמצעות מרווח הדגימה המתאימה אשר נשאר עקבי עבור כל הניסויים, ומבטיחה ii) בגדר חימר/cyanobacterial שבורה מספיק לאחר התוספת של מתנול כדי להבטיח הפקת נאותה כלורופיל את התאים.

בטכניקה המתוארת כאן מוגבלת גם דגמי flocculation בתנאים מחומצן באופן מלא. מכשיר ניסיוני וההליך צריך להיות שונה לדגם עמודת המים מרובדת עם המים התחתונה אנאוקסיים.

בהקשר סדימנטולוגיות, שיטה זו יש פוטנציאל שיוחל פיקדונות הדוגמנות של יחסי חימר שונים או חומרים ביולוגיים כדי להבין היבטים כגון שינויים חומר אורגני ומליחות של קלט הם נופי הנהר המרשימים. יתר על כן, המשקעים המיוצר בשיטה זו יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של פוטנציאל סופה עיבוד ב- floc-קוהרנטיות מאת רמיקס או עצבנות. על ידי זיווג מדידה ישירה של ריכוז תא cyanobacterial עם דימויים ויזואליים, פרוטוקול זה מתעלה על היישומים המסורתי של כחוליות/קליי flocculation תהליכים ומאפשרת את התהליכים האלה שיוחל סדימנטולוגיות דוגמנות של הרשומה רוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים להכיר בהכרת תודה מימון מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (05448, 165831 ו- 213411).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) Pasteur Culture Collection PCC 7002 or PCC 6803 used to inoculate the plates
agar Thermo Scientific CM0003 used to fill two petri dishes
Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) Sarstedt 82.1473.001 2 required
1 L heat resistant Erlenmeyer flask Pyrex 4980-125 1 required
250 mL heat resistant Erlenmeyer flask Pyrex 4980-250 1 required
Nichrome inoculating loop with handle Fisher Scientific 14-956-103 1 required
tinfoil Reynolds Wrap Aluminum Foil 89079-067 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks
growth media (e.g. A+) 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4
Bunsen Burner Fisher Scientific S95941 1 required
plastic tubing Fisher Scientific S504591 1 m required; used to create the bubbling apparatus
sponge stopper Jaece Industries Inc 14-127-40E 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus
acrylic sheet  Home Depot Optix clear acrylic sheet model # MC-102S 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm)
clear waterproof silicone adhesive Home Depot Loctite clear silicone model # 908570 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm)
camera or video recorder Panasonic HC-V770 HD camcorder 1 required
tripod Magnus VT-300 1 required
black cloth primomart  EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment
heat resistant serological pipet corning incorporated C708510 13-671-101G 1 required; used to create the bubbling apparatus
sample vials  Dynalon S30467 at least 12 (will vary with time interval chosen)
heat resistant glass pipette Fisher Scientific Corning Incorporated C708510, 13-671-101G 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved.
microcentrifuge Eppendorf 22 62 120-3  1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g
vortex machine (Vortex-Genie 2) Scientific Industries, Inc SI-0236 1 required
100% methanol Fisher Scientific A412-500 SDS at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used.
cuvettes (1.6  mL, polystyrene) Sarstedt 67.742 at least 12 required
spectrophotometer Fisher Scientific 222-271600 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used.
light bulbs Home Depot model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments
pipette (Pipetman Classic P1000 Gilson F123602 used to collect samples
37 % Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood.
Foam stopper (small) Canlab T 1385
Foam stopper (large) Canlab T 1387 Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre
30 °C incubator/growth room with continuous illumination 1 required
70 % Ethanol Fisher Scientific BP8201500 30 mL  required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses
hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) Sartorius 17805 1 required
clay (e.g. kaolin) Fisher Scientific MFCD00062311 at least 50 g required
microfuge tubes (2 mL, polypropylene) Sarstedt 72.695.500 Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen)
1000 µL pipet tips Sarstedt 70.762 1 required

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
  2. Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
  3. Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
  4. Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
  5. Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
  6. Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
  7. Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
  8. de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
  9. Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
  10. Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
  11. Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
  12. Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
  13. Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
  14. A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
  15. Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
  16. Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
  17. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
  18. Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
  19. Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
  20. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
  21. Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
  22. Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
  23. Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
  24. Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
  25. Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
  26. Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 136 Flocculation כחוליות Synechococcus Synechocystis קליי קצב שקיעת אורגני עשיר משקעים פצלי התצהיר קאוליניט מונטמורילוניט
קביעת שיעור ליישוב של קליי/Cyanobacterial Floccules
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, … More

Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G. W., Whitford, D. S., Warchola, T., Hodgson, C., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Zonneveld, J. P., Pemberton, S. G., Gingras, M. K. Determination of the Settling Rate of Clay/Cyanobacterial Floccules. J. Vis. Exp. (136), e57176, doi:10.3791/57176 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter