Summary
L'interazione e la sedimentazione di argilla e cellule batteriche all'interno del Regno marino, osservate in ambienti naturali, può essere studiati meglio in un ambiente di laboratorio controllato. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato, che delinea un nuovo metodo per misurare il tasso di sedimentazione di argilla e cianobatterica fiocco.
Abstract
I meccanismi su cui si fonda la deposizione di grana fine, sedimenti organici ricchi sono ancora largamente dibattuti. In particolare, l'impatto dell'interazione di particelle di argilla con cellule cianobatterica reattive, planctoniche al record sedimentario è meno studiato. Questa interazione è un fattore potenzialmente importante di modelli deposizionali shale. All'interno di un ambiente di laboratorio, i tassi di flocculazione e sedimentazione di questi materiali possono essere esaminati e misurati in un ambiente controllato. Qui, dettagliamo un protocollo per la misurazione del tasso di sedimentazione di miscele cianobatterica/argilla. Questa metodologia è dimostrata attraverso la descrizione di due esperimenti di campione: il primo utilizza caolino (una forma disidratata di caolinite) e Prochlorococcus marinus PCC 7002 (un coccoid cianobatteri marini) e il secondo utilizza il caolino e Synechocystis SP. PCC 6803 (un coccoid cianobatteri d'acqua dolce). Cianobatterica culture sono mescolate con diverse quantità di argilla all'interno di un apparato di serbatoio appositamente ottimizzato per consentire di continuo, in tempo reale video e fotografica della registrazione. Le procedure di campionamento sono dettagliate così come un protocollo di post-raccolta per la misura precisa della clorofilla una da cui può essere determinata la concentrazione di cellule cianobatterica residue in sospensione. In replica sperimentale, viene costruito un profilo che consente di visualizzare il tasso di sedimentazione.
Introduction
Usare le condizioni ambientali presenti e processi per dedurre passato meccanismi deposizionali è stato a lungo un fondamento della sedimentologia. Mentre moderni deposizionali analoghi, come il Mar Nero, sono stati utilizzati per comprendere la deposizione di depositi organici ricchi, a grana fine, esperimenti di laboratorio hanno il potenziale per fare ulteriori luce sull'origine dei depositi di scisto. Un'area di indagine nella genesi di scisti neri è il tasso di deposizione e il meccanismo di formazione originale. Tradizionalmente, è stato ipotizzato che scisti neri formata in ambienti dove il tasso di sedimentazione, produttività primaria e tassi di respirazione di materia organica promuovono la conservazione della sostanza organica nel sedimento1,2 ,3. Tuttavia, il ruolo di cianobatterica e flocculazione argilla ha in gran parte rimasto unconsidered. Questo meccanismo di flocculazione consentirebbe per rapida deposizione di sedimenti organici ricchi, a grana fine per accadere e non necessitano di ossigeno. Considerando questa premessa, questo protocollo ha due obiettivi: 1) misurare il tasso di sedimentazione di fiocco cianobatterica/argilla e 2) visualizzare il processo di sedimentazione in tempo reale. Questa metodologia, oltre alle analisi geochimiche, è stata utilizzata per dimostrare che flocculazione cianobatterica/argilla può infatti essere un meccanismo importante per shale formazione1. Sebbene originariamente concepita per la modellazione a deposizione di scisto, questo metodo è applicabile ad altre discipline come la biologia e la bonifica ambientale dove l'influenza dell'input di argilla sul metabolismo batterico e la popolazione devono essere misurate.
Numerosi studi sono stati condotti per osservare la flocculazione di cianobatteri e argilla, per mitigare le fioriture algali nocivo2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. Tuttavia, durante la misurazione della concentrazione cellulare nel corso del tempo, questi studi non siano applicate flocculazione cianobatteri/argilla per modellare la deposizione del record roccia. Come tali, questi studi mancano un componente visiva, che può essere critica durante la modellazione passato processi sedimentologici. Inoltre, la maggior parte degli studi utilizza conta cellulare (ad es., Pan et al. 11), che può essere laborioso. Il nostro metodo, con gli avanzamenti recenti nella misura cianobatterica flocculazione, determina i cambiamenti nella concentrazione delle cellule cianobatterica misurando clorofilla un (Chl un) a intervalli di tempo discreti. L'associazione Chl una misurazione con dati visivi è un nuovo approccio, che può essere utilizzato per dedurre le condizioni deposizionali. Le immagini generate è utilizzabile anche per calcolare il tasso di sedimentazione dopo il lavoro da Du et al. 13. la combinazione di dati visivi e numerici rafforza l'affidabilità dei risultati. Inoltre, abbiamo delineare protocolli aggiuntivi, consentendo la sedimentazione di necromassa e argilla devono anche essere rispettate. Questo è importante quando si considera passato sedimentologici ambienti, dove vivono e necromassa co-potrebbe essersi verificato. Differenze nel comportamento di biomassa morta durante la flocculazione (ad esempio, diminuzione della frequenza di flocculazione) potenzialmente avrebbe implicazioni sedimentologiche.
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Protocol
1. preparazione cianobatterica culture
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Preparazione di colture di inoculazione su supporti solidi
- Ottenere cellule cianobatterica axeniche dalla American Type Culture Collection o Pasteur Culture Collection. Ad esempio, il Prochlorococcus unicellulari, marine PCC 7002 è stata ottenuta dall'insieme cultura Pasteur, si farà riferimento d'ora in poi come Acinetobacter.
- Mantenere le cellule Synechococcus su piastre contenenti terreni solidi (A + liquido media14 e 1,5% agar15). Questi di cui qui di seguito come culture di inoculazione.
- Incubare le piastre a 32 ± 2 ° C con luce continua fornito a 30 – 50 µmol fotoni m-2 s-1,15,18.
- Ripetere i passaggi da 1.1 – 1.3 e sostituire un + supporto con BG-1116 nel passaggio 1.1.2 per specie d'acqua dolce cianobatterica, come Synechocystis SP. PCC 680316,17, denominata di seguito Synechocystis. Vedere tabelle 1 – 4 per la composizione dei media A + e BG-11.
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Preparazione di colture liquide: ogni esperimento serbatoio richiede una cultura cianobatterica 400 mL.
- Raccogliere un 250 mL e due L 1 flacone erlenmeyer resistente al calore.
- Sciacquare ogni boccetta con una soluzione di acido cloridrico (HCl) di 4 M (30 mL di soluzione di HCl per ciascuna beuta), poi con acqua distillata.
Attenzione: l'acido cloridrico è corrosivo e tossico. Garantire che un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti resistenti agli acidi sono indossati mentre si utilizza la soluzione di HCl 4 M. Eseguire questo passaggio in un lavandino di laboratorio e seguire le normative locali per lo smaltimento della soluzione di HCl 4 M - Riempire il pallone da 250 mL con 50 mL di liquido media (A + o BG-11). Riempire un pallone da 1 L con 400 mL di liquidi (A + o BG-11) e l'altro L 1 pallone con 600 mL di media (A + o BG-11).
- Sigillare ogni recipiente con un tappo di gomma piuma permeabile del gas e coprire il collo di boccetta e tappo di gomma piuma con carta stagnola.
- Etichetta e autoclave le beute a 121 ° C e 100 kPa per 25 min. consentono le beute raffreddare a temperatura ambiente.
- Preparare una cappa a flusso laminare di sterilizzazione della superficie con alcol al 70%.
- Raccogliere un ciclo di inoculazione di filo, un bruciatore di Bunsen, il pallone di mezzi liquidi raffreddato da 50 mL (dal punto 1.2.5) e la cultura di inoculazione (dal punto 1.1). Posizionare questi elementi nella cappa flusso sterilizzato.
- Sterilizzare l'ansa per inoculazione filo brevemente utilizzando la fiamma di un becco Bunsen e lasciare che si raffreddi.
- Trascina il loop di fresco lungo la superficie della cultura inoculazione per raccogliere le cellule cianobatterica.
- Rimuovere il tappo di gomma piuma e stagnola dal pallone da 250 mL (senza toccare il tappo di gomma piuma) e sterilizzare il cerchio del matraccio Erlenmeyer passandola brevemente attraverso la fiamma.
- Inclinare il pallone così i media è vicino al collo del pallone e inserire l'ansa per inoculazione ricoperto di cellule nel pallone. Una volta che il ciclo è sommerso in media, mescolare l'ansa per inoculazione per rimuovere le cellule.
- Rimuovere l'ansa per inoculazione e risterilizzare il labbro del pallone utilizzando la fiamma del bruciatore di Bunsen.
- Sostituire il tappo di schiuma e stagnola sulla beuta (senza toccare il tappo di gomma piuma).
- Sterilizzare l'ansa per inoculazione brevemente all'interno la fiamma del bruciatore di Bunsen.
- Preparare una camera di crescita (di cui la camera di crescita) dove la temperatura è mantenuta a 30 ° C15,18 e intensità della luce è di 30 – 50 µmol fotoni m-2 s-1,15,18 . Umidità non è attivamente controllato.
- Consentire la cultura inoculato 50ml Incubare agitando a 150 rpm nella camera di crescita, con una temperatura mantenuta di 30 ° C. Tenere la bocca del pallone coperto durante l'agitazione per controllare le perdite per evaporazione e prevenire la contaminazione.
- Consentire la costruiscono cianobatterica a crescere per 96 h. Una cultura di successo dovrebbe apparire verde brillante e avere una densità ottica (OD) a 750 nm di 0,4 – 0,6.
- Una volta che la cultura è cresciuta sufficientemente, posizionare la cultura di 50 mL e il pallone da 1 L contenente 400 mL di liquido media (dal punto 1.2.5) nella cappa a flusso laminare. Garantire che la cappa a flusso è sterilizzato seguente punto 1.2.6.
- Ripetere il passaggio 1.2.10 per entrambi boccette all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Versare la cultura 50ml in 400 mL di media nella beuta di 1 L e risterilizzare il labbro del pallone da 1 L con la fiamma del bruciatore di Bunsen.
- Al posto della schiuma e lamina ghiera, allegare un apparato di bubbling sterile costituito da un tappo di gomma piuma, pipetta, tubi in plastica, filtro in linea e sventare copertura fino alla foce del pallone.
- Agitare il matraccio 1 L a 150 giri/min a 30 ° C con l'apparato della vasca di gorgogliamento attaccato ad una pompa di aria, che circola una miscela di aria umidificata attraverso la soluzione15,18 a 300 mL/min.
- Consentire la capacità di crescere all'interno della camera di crescita a 30 ° C per 120 – 168 h. Una cultura di successo dovrebbe apparire verde brillante e avere un OD750 nm di 0,4 – 0,6.
- Ripetere il passaggio 1.2 per produrre una cultura del controllo, che non sarà mescolata con l'argilla.
- Esperimenti utilizzando biomassa morta richiedono un ulteriore passaggio. Autoclave L 1 pallone cultura per 60 min a 121 ° C e lasciar raffreddare a temperatura ambiente.
2. sperimentale istituito
- Posizionare una vasca rettangolare acrilica (lunghezza di 20 cm), larghezza di 5,1 cm e altezza di 30 cm davanti a una banca di luci fluorescenti (nove lampade T8, almeno 2.600 lumen; Figura 1) 19.
- Posizionare un foglio di plastica trasparente, bianco tra la banca di luci e il serbatoio per diffondere la luce, che brilla attraverso il serbatoio. Questo set-up è stato adattato da Sutherland et al. 19
- Mark l'acrilico serbatoio ad un'altezza di 10 cm, misurata verticalmente dalla base. Tutte le misurazioni dovrebbero essere fatte a questa altezza nella colonna d'acqua per garantire la coerenza di ogni campionamento.
- Inserire una fotocamera su un treppiede, 1 m davanti al serbatoio per registrare ogni esperimento. Una videocamera è raccomandata in quanto può essere estratta dal file video, e utilizzando il software di modellazione matematica, file video possono essere utilizzati per modellare sedimentazione dynamics19.
- Posizionare un panno nero sopra la banca leggera, serbatoio e fotocamera per schermare l'esperimento da fonti di luce esterne (Figura 1).
3. flocculazione protocollo sperimentale
- Raccogliere la cultura 400ml (punto 1.2), un grande cilindro graduato e 600 mL di terreno di crescita supplementare in un pallone da 1 L (punto 1.2.5).
- Diluire la cultura 400 mL (concentrazione iniziale delle cellule di 4 – 6 mg/mL) con supporto di crescita ulteriore (A + o BG-11) a volume finale di 1L utilizzando il cilindro graduato. Aggiungere questa soluzione nel serbatoio acrilico.
- Preparare 2 mL provette microfuge etichettatura e ponendoli in una posizione conveniente vicino al carro armato acrilico. Misura 50 g di argilla per l'esperimento.
- Iniziare la registrazione dei video. Nel caso di esperimenti multipli, un cartello con l'identificatore di esperimento possa essere temporaneamente tenuto prima della macchina fotografica.
- Utilizzando una pipetta, prelevare un campione di 1 mL e metterlo in una provetta con etichetta microfuge. Utilizzare questo esempio per determinare il conteggio iniziale delle cellule cianobatterica misurando la OD750 nm valori. Prendere tutti i campioni in triplice copia per garantire risultati accurati.
- Versare rapidamente l'argilla (50 g) nel serbatoio con vigorosa agitazione utilizzando un bastone di agitazione per 10 – 15 s.
- Avviare il timer e prelevare il campione iniziale 1 mL per Chl una determinazione utilizzando una pipetta P1000 (campione tempo0).
- Prelevare ulteriori campioni a intervalli di tempo appropriati (ad es., 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min e 240 min).
- Una volta che l'esperimento è finito, salvare il file video, spegnere la videocamera e trattare tutti i campioni per Chl una determinazione (passaggio 4).
- Sterilizzare in autoclave la soluzione rimanente argilla/cianobatterica. A seconda della specie cianobatterica, regolamenti locali e criteri di laboratorio, smaltire la soluzione utilizzando metodi appropriati. Pulire il serbatoio con acqua e sapone, sciacquare con acqua distillata e asciugare a aria.
- Preparare un esperimento di controllo con nessun argilla aggiunto. Prelevare campioni allo stesso tempo punti. Questi dati possono essere confrontati agli altri dati sperimentali per confermare che tassi di sedimentazione sono aumentati a causa della flocculazione con argilla, non il risultato di decantazione naturale.
- Se la biomassa morta viene utilizzato durante l'esperimento, utilizzare la stessa procedura sperimentale. Tuttavia, la procedura di smaltimento della soluzione non richiede trattamento in autoclave.
4. l'elaborazione e la valutazione del campione
- Determinare Chl una concentrazione in ogni campione di cella utilizzando una procedura per l'ultima volta da Owttrim16. Una volta raccolti, appallottolare le celle da ogni campione per 3 min a 13.000 x g usando una microcentrifuga a temperatura ambiente.
- Rimuovere il terreno in eccesso utilizzando una pipetta P1000 e aggiungere 1 mL di metanolo al 100% (20 ° C). Vortexare il campione a tutta velocità per 1 minuto risospendere il pellet cellulare.
Attenzione: Il metanolo è tossico ed infiammabile. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e tenere metanolo lontano da fonti di ignizione. - Incubare i campioni a-20 ° C per 24 h facilitare l'estrazione di Chl un.
- Dopo l'incubazione, i detriti cellulari il pellet come descritto in 4.1, trasferire il surnatante verde a una cuvetta utilizzando una pipetta e disponga la provetta nello spettrofotometro. Lasciare il campione riposare nello spettrofotometro per 1 min garantire che qualsiasi argilla rimanente all'interno del campione si deposita e non interferire con la misurazione.
- Determinare una concentrazione di Chl spettrofotometricamente misurando l'assorbanza a 665 nm e 652 nm e OD a 750 nm. La Chl una concentrazione viene determinata utilizzando la formula Chl un = 16,29 x (un665 - OD750) - 8,54 x (un652 - OD750) 20. CHL una concentrazione viene utilizzata come proxy per la concentrazione delle cellule. Inoltre, un fattore di conversione di 7,4 x 1010 cellule/L = 10 g/L21 può essere utilizzato per calcolare la concentrazione cellulare in grammi di alcune specie cianobatterica.
- Trama Chl un valori calcolati rispetto al tempo.
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Representative Results
Quando esposti ad argilla, cellule cianobatterica sono portate fuori sospensione22. Ciò è dimostrato nei risultati rappresentativi dati qui. Per determinare l'effetto di argilla sulle popolazioni cianobatterica e osservare la sedimentazione tariffe, due esperimenti sono stati condotti durante il quale Prochlorococcus marinus e Synechocystis sono stati esposti a caolino di 50 g/L (tabella 5-6, Figura 2-3). Cianobatterica culture sono state coltivate come descritto nel passaggio 1. Successivamente, dopo aver impostato il serbatoio (passaggio 2), la cultura di Synechococcus diluita è stata versata nel serbatoio e mescolata con 50 g di caolino calcinato seguendo il passaggio 3. Questo è stato ripetuto per la cultura di Synechocystis . Tutti i campioni sono stati prelevati dalla stessa posizione nel serbatoio. I campioni sono stati elaborati e misurazioni di OD652 e OD665 nonché il Chl un valore calcolato sono date per Prochlorococcus marinus (tabella 5) e Synechocystis (tabella 6). Questi risultati sono stati tracciati graficamente in linea trame e rispetto ai risultati degli standard per determinare se il tasso di sedimentazione di miscele cianobatterica/argilla era superiore al tasso di sedimentazione naturale di cianobatteri solo. Questi risultati dimostrano che le popolazioni cianobatterica sono state portate fuori di sospensione entro 10 min di esposizione di argilla (Figura 2-3). Il marine Synechococcus ha mostrato un più rapido tasso di sedimentazione dell'acqua fresca Synechocystis, che è coerente con l'ipotesi che i cationi trivalenti (prevalente nel mezzo di crescita, che imita la salinità dell'acqua salata) agire come l'agente gettante un ponte tra le particelle di argilla e le cellule batteriche, facilitando la flocculazione e, di conseguenza, sedimentazione1.
È importante notare che nella Figura 3, ci sono alcuni risultati anomalamente alti, specificamente ai dati punto 2. Questo è un esempio di elaborazione del campione durante il quale passaggio 4.4 non è stata sufficientemente seguita e il campione è diventato torbido durante la misurazione. Questo produce un risultato artificialmente elevato (Figura 2, i dati punto 2). Un esempio di immagini in serie temporale, estratte da un video sono forniti in Figura 4, adattato da Playter et al. 22. è importante notare che caolinite (non caolino) è stato usato in Playter et al. 22.
Figura 1 : Schema esplicativo che illustra la messa a punto sperimentale. Una videocamera è impostata di almeno 1 m dall'apparato di serbatoio. Il serbatoio viene riempito con 1 L di cianobatteri e mezzi liquidi. Le luci illuminano il serbatoio da dietro e la luce viene dispersa da una pellicola traslucida. Questo intero set up è drappeggiato con un panno nero per eliminare ulteriori fonti di luce. Questa figura è stata modificata da Sutherland et al. 19. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Chl un concentrazioni calcolate dai valori OD riportati nella tabella 1. Questi valori sono da un Prochlorococcus marinus /miscela di caolino (giallo). Confronto con Chl un concentrazioni per Prochlorococcus marinus solo (blu) evidenzia un tasso di sedimentazione aumentato per la miscela di cianobatterica/argilla. Questa figura è stata modificata da Playter et al. 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Chl un concentrazioni calcolate dai valori OD indicati nella tabella 2. Questi valori sono da Synechocystis /miscela di caolino (giallo). Confronto con Chl un concentrazioni per Synechocystis solo (blu) evidenzia un tasso di sedimentazione aumentato per la miscela di cianobatterica/argilla. Questa figura è stata modificata da Playter et al. 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Corso di tempo rappresentativo del Synechococcus-deposizione di caolinite. Queste istantanee vengono estratti dal video registrato a intervalli di tempo discreti (1 min). Questa figura è stata modificata da Playter et al. 22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Per 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g KCl |
| 1g NaNO3 |
| 5g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL di Tris-HCl pH 8.2 |
| 1 mL P1 metalli stock * |
Tabella 1: ricetta per un + media 14 . Riferimento alla tabella 2 per la composizione del magazzino metalli P1. Questa ricetta produce 1 L di media.
| Per 1 L di brodo di metallo P1 |
| 34,26 g H3BO3 |
| 4,32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0,315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (85%) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5h2O |
| g 0,01215 CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabella 2: Ricetta per P1 metalli stock necessario per un + media.
| Per 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL acido citrico H2O |
| Citrato di ammonio ferrico 1 mL |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| Microelementi A5 1 mL * |
Tabella 3: ricetta per BG-11 media 16 . Riferimento alla tabella 4 per la composizione di microelementi A5. Questa ricetta produce 1 L di media.
| Per 1 L di soluzione madre |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| g 0,222 ZnSO4 7 H2O |
| 0,390 g Na2MoO4 2 H2O |
| g 0,079 CuSO4 5 H2O |
| 0,40 g CoCl2 6 H2O |
Tabella 4: Ricetta per brodo A5 microelemento necessario per BG-11 media.
| Tempo di campionamento (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL un (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0,112 | 0,046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0,036 | 0,084 |
| 15 | 0,027 | 0.025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0,097 |
| 60 | 0 | 0,061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0,061 | 0.000 |
| 180 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0,005 | 0,012 | 0.000 |
Tabella 5: OD 665 e OD 652 misure per Prochlorococcus marinus in presenza di caolino di 50 g/L. CHL i valori sono calcolati utilizzando la formula al punto 4.4. Nota che i campioni t6 e t7 sono mancanti. Questo è un esempio di non mantenere un intervallo di campionamento coerente secondo il protocollo di campionamento delle cellule. Dati per lo standard sono preso da Playter, et al. (2017) 2.
| Tempo di campionamento (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL un (mg/mL) |
| -1 | 0,384 | 0,345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0,64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0,217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0,104 | 0,089 | 0.934 |
| 30 | 0,126 | 0,169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0,115 | 0,048 | 1.463 |
| 120 | 0,016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0,011 | 0,005 | 0,136 |
Tabella 6: OD 665 e OD 652 misure per Synechocystis in presenza di caolino di 50 g/L. CHL un valori vengono calcolati utilizzando la formula previsto al punto 4.4.
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Discussion
Flocculazione catalizzata dalla interazione cellula cianobatterica-argilla ha attirato molto interesse nei settori dell'ecologia e ingegneria2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, tuttavia, l'indagine di queste interazioni con l'intento di modellare la deposizione di sedimentarie depositi (ad esempio di shales) è relativamente nuovo. La visualizzazione di questo processo, in questo caso per applicazioni sedimentologiche, non è stata segnalata. In studi precedenti di flocculazione, queste interazioni sono state studiate mescolando argilla e cianobatteri in vasetti, provette, o bicchieri e campionamento a tempo discreto intervalli9,11,12, 26 per determinare i cambiamenti nella concentrazione di cellule attraverso il tempo. Questi studi hanno misurato la concentrazione di cellule cianobatterica in modi diversi. Ad esempio, le popolazioni delle cellule cianobatterica inclusi nel campione sono state misurate contando utilizzando un microscopio9,11,12,26. Rispetto alla concentrazione iniziale delle cellule, l'efficienza di rimozione può essere calcolato9,11,12,26. In uno studio separato, dopo che la miscela di argilla/cella per depositarsi, il liquido restante sopra il sedimento depositato cella/argilla è stato campionato ed analizzato per fluorescenza stimare il numero di celle rimanenti nella sospensione3. Misurazioni di Chl un direttamente da campioni di colonna d'acqua sono stati utilizzati anche per calcolare la concentrazione cellulare8,10.
Al contrario, la nostra metodologia di misura le cellule in sospensione nel corso del tempo, sulla base della metodologia di Sengco, et al. 4 effettuare le misurazioni a selezionare volte durante tutto il processo, e abbinando questi intervalli di tempo con formazione immagine video in tempo reale. Se confrontato con altri protocolli sperimentali che coinvolgono la decantazione dell'argilla in presenza di flocculanti anionici, utilizzando biologico (alghe o cianobatteri) o non-biologico (agenti sintetici fioccoso) flocculanti, la nostra analisi è diverso su molti conta. In primo luogo, il nostro studio prevede l'utilizzo di una specie marine coccoid di cianobatteri, mentre molti altri studi coinvolgono specie d'acqua dolce o specie che producono polisaccaride extracellulare sostanze5,23,24 , 25. Inoltre, il nostro studio prevede l'utilizzo di un serbatoio standard, all'interno del quale la soluzione rimane statica. Questo contrasta con gli studi fatti utilizzando provette o cilindri3,12,14 o flume serbatoi, dove il flusso del fluido è una variabile di interesse6,7. La natura statica del nostro metodo sperimentale consente la misurazione dei tassi di sedimentazione della linea di base, dove fiocco non è tenute in sospensione da un flusso turbolento. Inoltre, utilizzando una vasca invece di una provetta, vaso o Becher, permette per una migliore visualizzazione dei depositi risultanti a causa ai lati del serbatoio piatto; le immagini dei video non mostrano nessuna distorsione a causa di curvatura e la luce viene dispersa in modo uniforme. In terzo luogo, la metodologia descritta nel presente documento misure tassi di flocculazione sopra sia breve (min 2 intervalli) e lungo termine (intervalli di ore); Inoltre, le immagini possono essere compilati a scale di secondi a minuti, consentendo la visualizzazione del processo sia un'ulteriore misura del tasso di sedimentazione. Maggior parte dei studi misura flocculazione tassi oltre la metà per un'ora intera intervalli5,6,23,25 o semplicemente misura il numero finale di celle a sinistra in sospensione dopo una sola volta scegliere (2 – 2,5 h)9,24, anche se alcuni studi9 hanno misurato i cambiamenti nella cella o Chl una concentrazione sopra 2 intervalli di un minuto. L'intervallo di campionamento scelto è critica, come flocculazione può verificarsi rapidamente (entro 5-10 min)22. Infine, un punto di forza della nostra metodologia è che produce immagini in tempo reale del processo di flocculazione, non solo degli aggregati prodotti (ad es., Avnimelech et al., 1982)24. Avendo due righe di dati, concentrazione di cellule da prove di campionamento e visual, rafforza l'affidabilità dei risultati e sostiene le conclusioni robusti.
Mentre è adatto per misurare i tassi di flocculazione di argilla e cianobatteri, nostro protocollo richiede la diligenza per quanto riguarda la posizione di campionamento all'interno del serbatoio. La stessa area del serbatoio (x, y, z) dovrà essere campionata ogni volta o i risultati del campione possono diventare distorta. Inoltre deve prestare attenzione per consentire tutti i particolati di stabilirsi prima OD misurazioni avvengono. Fasi critiche includono: i) utilizzando un intervallo di campionamento appropriato che rimane costante per tutti gli esperimenti e ii) assicurare che la pallina di argilla/cianobatterica è sufficientemente rotta dopo l'aggiunta di metanolo per garantire l'adeguata estrazione dei clorofilla dalle cellule.
La tecnica qui descritta è anche limitata alla modellazione flocculazione in condizioni completamente ossigenate. L'apparato sperimentale e procedura avrebbe bisogno di essere modificati per modellare una colonna d'acqua stratificata con acque di fondo anossico.
All'interno del contesto sedimentologico, questo metodo ha il potenziale per essere applicato ai depositi di modellazione di argilla diversi rapporti o materiali biologici al fine di comprendere aspetti come i cambiamenti di salinità dall'input fluviali e materia organica. Inoltre, i sedimenti prodotti utilizzando questo metodo possono essere utilizzati per studiare l'impatto di potenziale tempesta rielaborazione il floc-coerenza di rimescolamento o agitazione. Abbinando la misura diretta della concentrazione di cellule cianobatterica con immagini visive, questo protocollo trascende le tradizionali applicazioni di processi di flocculazione cianobatteri/argilla e consente per questi processi da applicare al sedimentologica modellazione del record roccia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine finanziamenti dalle scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (05448, 165831 e 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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