Summary
相互作用と堆積粘土と自然環境の観測、海洋の領域内での細菌のセルの内容は、制御されたラボ環境で最高調べることができます。ここでは、粘土とシアノ バクテリアの floccules の沈降速度を測定する手法の概要を説明する詳細なプロトコルについて述べる。
Abstract
細粒の堆積を支えるメカニズム、有機性豊富な沈殿物はまだほとんど討論されています。具体的には、粘土粒子の堆積のレコードに反応性、浮遊性のシアノ バクテリア細胞との相互作用の影響下で検討しました。この相互作用は、頁岩堆積モデルの潜在的貢献です。ラボの設定内でこれらの材料の凝集、沈降率を検討し、管理された環境で測定できます。ここでは、シアノ バクテリア/粘土の混合物の沈降速度を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。この方法論は 2 つの例題実験の説明により示される: 最初のカオリン (カオリナイトの脱水フォーム) と導入したsp PCC 7002 (海洋球状の藍藻) を使用、2 番目はカオリンとを使用して阻害sp. PCC 6803 (淡水球状のシアノ バクテリア)。シアノ バクテリアの培養は、連続的な実時間ビデオおよび写真記録をできるように最適化された特別に設計されたタンク装置内で粘土の変化量と混合されます。サンプリング手順にクロロフィル、シアノ バクテリア細胞の残りの懸濁液中の濃度を決定できるの正確な測定のため回収後プロトコルだけでなく。実験的レプリケーションによる沈降速度を表示する、プロファイルで構成されます。
Introduction
過去の堆積機構を推測する環境の現状とプロセスを使用して長い堆積学の基盤をされています。黒海など現代の堆積の類縁体は、有機性豊富なきめの細かい堆積物の堆積を理解する使用されてきたが、頁岩堆積物の起源に追加の光を当てる可能性がある実験室。黒色頁岩の起源の調査の 1 つの領域は、成膜速度と機構の元です。伝統的に、それは黒色頁岩が堆積速度、主な生産性、および有機物の呼吸速度が堆積物1,2 における有機物の保存を促進する環境で形成されたことが仮定された ,3。しかし、シアノ バクテリアの役割と粘土凝集は unconsidered 残った主。この凝集のメカニズム有機性豊富なきめの細かい堆積物の高速堆積が発生する可能になるし、低酸素を必要としません。この前提を考慮してこのプロトコルは 2 つの目標: 1) シアノ バクテリア/粘土 floccules の沈降速度を測定し、2) 堆積プロセスをリアルタイムに可視化します。地球化学的分析に加え、この方法論は、そのシアノ バクテリア/粘土凝集あります頁岩形成1のための重要なメカニズムを示すために使用されています。本来頁岩堆積をモデル化するため、このメソッドは他の生物や環境修復などの分野に適用可能な細菌の代謝と人口に及ぼす粘土の入力を測定する必要があります。
シアノ バクテリアや有害藻類ブルーム2,3,4,5,6,7を軽減するための粘土の凝集を観察する数多くの研究が行われています。,8,9,10,11,12。 しかし、時間の経過とともに細胞濃度を測定している間これらの研究適用していないシアノ バクテリア/粘土凝集ロック レコードの沈着をモデリングします。そのため、これらの研究は過去の堆積過程モデリングするとき重要なことができる視覚的なコンポーネントを欠いています。また、研究の大部分を利用して細胞数 (例えば、パンら 。11)、骨の折れることもあります。測定のシアノ バクテリアの凝集の最近の進歩と私たちの方法は、離散時間間隔でクロロフィルを(クロロフィル、) を測定することによってシアノ バクテリア細胞濃度の変化を決定します。クロロフィルと視覚的なデータの測定を組み合わせは、堆積条件を推測する使用ことができます新しいアプローチです。生成された画像は、デュらから仕事の後の沈降速度の計算にも使用できます。13。 visual と数値データの組み合わせは、結果の信頼性を強化します。さらに、我々 も観察できるように死んだバイオマスと粘土の沈降のための追加のプロトコルの概要を説明します。生きているところ、過去の堆積環境を考慮した場合、これは重要で、死んだバイオマス共同発生しました。凝集の中に死んでいるバイオマスの動作の違い (たとえば、凝集速度の増減) 堆積学的含意潜在的でしょう。
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Protocol
1 シアノ バクテリア培養の準備
-
固体媒体を使用するカルチャの接種の準備
- アメリカのタイプ文化コレクションまたはパスツール文化コレクションから無菌共生シアノ バクテリア細胞を取得します。たとえば、単細胞、海洋におけるsp. PCC 7002 パスツール文化コレクションから得られた、導入した来世に参照されます。
- 固体媒体 (+ 液体メディア14と 1.5% 寒天培地15) を含んでいる版に導入した細胞を維持します。これらを接種文化として来世に呼びます。
- 30-50 µmol 光子 m-2の-1、15、18で連続で 32 ± 2 ° C で版を孵化させなさい。
- 手順 1.1-1.3 ととして以下 BG 1116ステップ 1.1.2阻害sp. PCC 680316,17, などの淡水のシアノ バクテリア種でメディア + を交換阻害。A + と BG 11 メディアの構成のテーブル 1-4を参照してください。
-
液体培養の準備: 各水槽実験 1 つ 400 mL シアノ バクテリア培養が必要です。
- 1 つ 250 mL と 1 L 耐熱性の 2 つの三角フラスコを収集します。
- 蒸留水が続く 4 M 塩酸 (HCl) 溶液 (各フラスコの HCl 溶液 30 mL) 各フラスコをすすいでください。
注意: 塩酸は腐食性、有毒です。4 M 塩酸溶液を使用している間、白衣、安全メガネおよび耐酸手袋を着用することを確認します。研究室のシンクでこの手順を実行して 4 M 塩酸溶液の処分に関する地域の規制に従ってください。 - 液体メディア (A + または BG 11) 50 mL と 250 mL のフラスコを入力します。400 ml 液体メディア (A + または BG 11) の 1 つの 1 L フラスコとメディア (A + または BG 11) 600 mL と他の 1 L フラスコを入力します。
- ガス透過性泡ストッパー付き各フラスコを密封し、アルミ箔と泡ストッパーとフラスコの首をカバーします。
- ラベルとオートクレーブ 121 ° C、25 分 100 kPa でフラスコは部屋の温度に冷却するフラスコを許可します。
- 70% アルコールで表面を殺菌することによって層流フードを準備します。
- (ステップ 1.1) から接種文化 (ステップ 1.2.5) から 50 mL の冷却液体メディア フラスコ、ブンゼン バーナー接種ワイヤループを収集します。滅菌流フードにこれらの項目を配置します。
- ブンゼン バーナーの炎を使用して簡単にワイヤー接種ループを殺菌し、冷却することができます。
- シアノ バクテリア細胞を収集するために接種培養面に沿ってクールなループをドラッグします。
- (泡ストッパーに触れないで) 250 mL フラスコから泡ストッパーとホイル キャップを取り外し、炎を簡単に通すことで三角フラスコの縁を滅菌します。
- フラスコを傾くようにメディアはフラスコの首近く、フラスコに細胞で被覆された接種ループを挿入します。ループは、メディアに浸水は、一度細胞を取り除く接種ループをかき混ぜます。
- 接種ループを削除し、再滅菌するブンゼン バーナー炎を使用してフラスコの唇。
- (泡ストッパーを触れる) ことがなく泡ストッパーと三角フラスコにホイル キャップを取り付けます。
- ブンゼン バーナーの炎の中で簡単に接種ループを滅菌します。
- (成長室と呼ばれる) 成長部屋の準備ここで温度 30 ° C15,18照度は 30-50 µmol 光子 m-2の-115,18.湿度は積極的に制御されていません。
- 30 ° c. の温度の維持、成長チャンバ内 150 rpm で揺することによって孵化する接種 50 mL 文化を許可します。蒸発損失を制御し、汚染を防ぐために攪拌中覆われたフラスコの口を保ちます。
- 96 h の成長するシアノ バクテリアのドシンドシンを許可します。培養に成功する必要があります明るい緑を表示され、750 ある光学濃度 (OD) 0.4 – 0.6 nm。
- 文化が十分に成長していたら、50 mL の文化と層流フード (ステップ 1.2.5) から液体媒体の 400 mL を含む 1 L フラスコを配置します。滅菌手順 1.2.6 流フードを確認します。
- 層流フードの内で両方のフラスコの 1.2.10 のステップを繰り返します。
- 1 L フラスコ内のメディアの 400 mL 注ぎ、50 mL 文化、再滅菌するブンゼン バーナー炎を使用して 1 L フラスコの唇。
- 泡ストッパー、ホイル キャップ代わり泡ストッパー、ピペット、プラスチック製のチューブ、インライン フィルターから成る滅菌バブリング装置を接続し、フラスコの口にカバーを箔します。
- バブラー装置ソリューション15,18 300 mL/分まで加湿空気混合気を循環する空気ポンプに接続されている 30 ° C で 150 rpm で 1 L フラスコを揺り動かしなさい。
- 120-168 h 30 ° C で成長チャンバ内で成長するドシンドシンを許可します。培養に成功する必要があります明るい緑を表示され、OD がある750 nm 0.4 – 0.6 の。
- 1.2 粘土混入がないコントロールの文化を作成する手順を繰り返します。
- 死んだバイオマスを用いた実験では、追加の手順を必要とします。オートクレーブ 1 L フラスコ文化の 121 ° C で 60 分間室温に冷却するようにし、なさい。
2. 実験のセットアップ
- 蛍光灯 (9 T8 電球、少なくとも 2,600 ルーメン; の銀行の前に長方形のアクリル水槽 (長さ 20 cm)、5.1 cm の幅、30 cm の高さの場所します。図 1)19。
- ライトの銀行とタンクを介して輝いて光を拡散するタンクの半透明、白のプラスチック シートを配置します。このセットアップ ・ サザーランドらから適応されました。19
- マーク高さ 10 cm のアクリル水槽は、底から垂直方向に測定。すべての測定は、すべてのサンプリングの整合性を確保する水の列でこの高さにされるべきであります。
- 各実験を記録する戦車の前に 1 m、三脚にカメラを配置します。動画ファイルから画像を抽出でき、整定時間のダイナ ミックス19をモデル化する数学的モデリング ソフトウェアを使用して、ビデオ ファイルを使用することができますは、カメラ、ビデオをお勧めします。
- 光銀行、タンク、および外側の光源 (図 1) から実験を盾にカメラの上には、黒い布を置きます。
3. 凝集実験的プロトコル
- 400 mL 文化 (ステップ 1.2)、大型のメスシリンダー、1 L フラスコ (ステップ 1.2.5) で余分な成長媒体の 600 mL を収集します。
- 1 L のメスシリンダーを使用しての最終的なボリュームに追加成長媒体 (A + または BG 11) と 400 mL 文化 (4-6 mg/mL の初期細胞濃度) を希釈します。アクリル水槽にこのソリューションを追加します。
- ラベル付け、アクリル水槽は近く便利な場所に配置することにより microfuge の管 2 mL を準備します。実験のための粘土の 50 グラムを測定します。
- ビデオの録画を開始します。複数の実験の場合、カメラの前に実験識別子を持つ記号を一時的に保持することができます。
- ピペットを使用して、1 mL のサンプルを取るし、ラベルおよび microfuge の管にそれを置きます。このサンプルを使用して、外径を測定することによって初期のシアノ バクテリア細胞数を決定する750 nmの値。正確な結果を確保するため 3 通すべてのサンプルを取る。
- すぐにタンクに 10-15 秒の攪拌棒を使用して積極的な撹拌で粘土 (50 g) を注ぐ。
- タイマーを開始し、クロロフィル定量 P1000 ピペット (サンプル時間0) を使用して初期の 1 mL のサンプルを取る。
- 適切な間隔 (例えば、1 分、2 分、3 分、4 分、5 分、10 分、15 分、30 分、60 分、180 分、240 分) でその他のサンプルを取る。
- 実験が終了すると、ビデオのファイルを保存、ビデオ カメラをオフに、クロロフィル定量 (ステップ 4)すべてのサンプルを処理します。
- オートクレーブ残りの粘土/シアノ バクテリア溶液。シアノ バクテリアの種によって現地の規制とラボのポリシーは、適切なメソッドを使用して、ソリューションの処分します。きれいな石鹸と水でタンクは蒸留水、それを洗い、空気乾燥します。
- 追加ない粘土で制御実験を準備します。同じ時点でサンプルを取る。このデータは、定着率が自然沈降の結果ではなく、粘土の凝集により強化されますを確認する他の実験データと比較できます。
- 実験中に死んだバイオマスを使用する場合は、同じ実験を使用します。ただし、ソリューションの処分方法には、オートクレーブ滅菌は不要です。
4. サンプルの処理と評価
- クロロフィル Owttrim16から変更手順を使用して各セルのサンプルの濃度を決定します。収集されると、室温で遠心機を使用して 13,000 x gで 3 分の各サンプルから細胞をペレットします。
- P1000 ピペットを使用して余分なメディアを削除し、1 mL の 100% メタノール (20 ° C) を追加します。渦細胞ペレットを再懸濁しますに 1 分間、全速力でサンプル。
注意: メタノールは有毒、可燃性です。手袋と安全メガネを着用し、メタノールを着火源から離して保管します。 - クロロフィルの抽出を容易にする 24 時間-20 ° C でサンプルをインキュベートします。
- インキュベーション後、4.1 で説明したように、細胞の残骸をペレット、培養上清中のグリーンをピペットを使用してキュベットに転送、分光光度計のキュヴェットに。サンプル内で残りの粘土が落ち着くし、測定を妨害しないことを確保するため 1 分の分光光度計で残りの部分にサンプルを許可します。
- 665 で吸光度を測定することによって光光度法によるクロロフィル濃度を決定する nm の nm と 750 で OD の 652 nm。数式クロロフィルを使って、クロロフィル濃度を決定 (、665 - 外径750) - x 16.29 を = (、652 - 外径750) × 8.54 20。クロロフィル濃度は、細胞濃度のプロキシとして使用されます。さらに、変換係数 1010セル/L x 7.4 = 10 g/L21グラムのシアノ バクテリア種細胞濃度の計算に使用できます。
- プロットには、クロロフィルと時間の値が計算されます。
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Representative Results
粘土にさらされて、シアノ バクテリア細胞懸濁液22から取り込まれます。これは、ここに与えられた代表的な結果で示されます。粘土のシアノ バクテリアの個体群への影響を判断して沈降を観察するレート, その中に導入したと阻害は、50 グラム/L のカオリン粘土 (表 5-6にさらされた 2 つの実験を行った図 2– 3)。シアノ バクテリアの培養は、手順 1 で説明したように成長しました。その後、タンク (ステップ 2) の設定後、希釈における文化だったタンクに注ぎ、カオリン粘土の手順 3 を次の 50 g を混ぜています。これは、阻害文化の繰り返されました。タンク内の同じ位置から採取しました。サンプルが処理され、導入した(表 5) の阻害(表 6) OD652外径665と計算されたクロロフィル、値の測定があります。これらの結果は、ライン プロットにグラフィカルにプロットされ、シアノ バクテリア/粘土の混合物の定着率がシアノ バクテリアのみの自然定着率よりも高いかどうかを判断するための基準の結果と比較しています。これらの結果は、シアノ バクテリアの集団が粘土露出 (図 2– 3) の 10 分以内のペンションから持って来られたことを示します。海洋における示した新鮮な水阻害仮説と一致しているよりより急速な沈降速度、3 価の陽イオン (食塩水の塩分濃度を模倣した培地に普及している)凝集と、したがって、沈降1促進する粘土粒子と細菌の細胞の間の架橋剤として機能します。
図 3では、いくつかの異常に高い結果に注意してください、特にデータ ポイント 2 ですることが重要です。これはどの段階 4.4 ない十分に続いたサンプル加工の例で、測定中にサンプルが濁り。これは人工的に高い結果を生成する (図 2、データ ポイントの 2)。ビデオから抽出された時系列画像の例は図 4、Playterらから適応で提供されます。22. そのカオリナイト (カオリンない) Playterらで使用されていたに注意することが重要です。22。
図 1: 実験のセットアップを示す説明図。ビデオカメラは、タンク装置から 1 m 以上に設定されます。タンクは、シアノ バクテリアの液体 1 L でいっぱいです。タンクが後ろから点灯し、半透明フィルムで、光を分散します。これは全体の設定は、追加の光源を排除するために黒い布で覆われました。この図は、サザーランドらから変更されています。19.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:クロロフィル濃度が表 1 OD 値から計算されます。これらの値から、における/カオリン混合物 (黄色)。クロロフィル濃度におけるのみ (青)との比較では、シアノ バクテリア/粘土の混合物の増加沈降率を示しています。この図は、Playterらから変更されています。22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:クロロフィルを表 2 OD 値から濃度計算します。これらの値は、阻害/カオリン混合物 (黄色)。クロロフィル濃度の阻害のみ (青)との比較では、シアノ バクテリア/粘土の混合物の増加沈降率を示しています。この図は、Playterらから変更されています。22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:シネココッカスの代表的な時間コース-カオリナイト沈着します。これらのスナップショットは、離散時間間隔 (1 分) で録画したビデオから抽出されます。この図は、Playterらから変更されています。22.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 1 L 用 |
| 18 g 塩化ナトリウム |
| 0.6 g KCl |
| 1 g ナノ3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7.2 mL CaCl2 |
| 161 μ L ナ2EDTA |
| 1 mL した FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL トリス塩酸 pH 8.2 |
| 1 mL P1 金属ストック * |
表 1: + メディアのレシピ14.P1 金属株式の構成のため、表 2を参照してください。このレシピは、メディアの 1 リットルを生成します。
| 1 L P1 のメタル ストック |
| 34.26 g H3ボー3 |
| 4.32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0.03 g MoO3 (85%) |
| 0.003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
テーブル 2: P1 のためのレシピは金属 + メディアに必要な在庫です。
| 1 L 用 |
| 10 mL ナノ3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL クエン酸 H2O |
| 1 mL クエン酸鉄アンモニウム |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 個数 * |
テーブル 3: BG 11 メディアのレシピ16.A5 微細構造の組成は表 4を参照してください。このレシピは、メディアの 1 リットルを生成します。
| 原液の 1 L 用 |
| 2.86 g H3ボー3 |
| 1.81 g MnCl2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g ナ2MoO4 2 H2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6 H2O |
表 4: A5 微細株式 BG 11 メディアに必要なためのレシピ。
| サンプル時間 (分) | 外径 665 nm | OD 652 nm | クロロフィル、 (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0.33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0.027 | 0.025 | 0.226 |
| 30 | 0.007 | 0.002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0.007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
表 5: OD665OD652測定導入しました。50 g/L カオリン粘土存在下で。値にクロロフィルは、4.4 の手順で数式を使用して計算されます。サンプル t6 および t7 は不足していることに注意してください。これは細胞のサンプリング プロトコルに従って一貫したサンプル間隔を保たないの例です。標準のデータは Playter から取られるら。(2017)2。
| サンプル時間 (分) | 外径 665 nm | OD 652 nm | クロロフィル、 (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0.007 | 0.201 |
| 180 | 0.012 | 0.004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0.005 | 0.136 |
表 6: OD665OD652測定阻害50 グラム/L のカオリン粘土存在下で。値にクロロフィルは、4.4 の手順で提供されている数式を使用して計算されます。
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Discussion
シアノ バクテリア細胞粘土相互作用による触媒凝集は生態学および工学2,3,4,5,6,7 分野への関心の多くを集めています。 ,8,9,10、11,12、ただし、堆積の沈着をモデリングの目的でこれらの相互作用の調査預金 (頁岩) などは比較的新しいです。このプロセスの可視化この場合堆積用は報告されていません。過去の凝集研究でこれらの相互作用は、粘土と離散時間間隔9,11,12、サンプリングやビーカー、試験管、瓶でシアノ バクテリアの混合によって研究されてきた 26時間を介して細胞濃度の変化を調べること。これらの研究は、さまざまな方法でシアノ バクテリア細胞の濃度を測定しました。たとえば、サンプリングされたシアノ バクテリア細胞集団を顕微鏡の9,11,12,26を使用してカウントすることによって測定しました。初期細胞濃度を比較すると、除去効率は計算9,11,12,26をすることができます。解決、粘土/細胞の混合物を可能にした後、別の研究でまとまったセル/粘土堆積物の上に残った液体だったの採取・分析用蛍光懸濁液3の残りのセルの数を推定します。クロロフィル、水の列のサンプルから直接の測定は、細胞濃度8,10の計算に使用されています。
対照的に、私たちの方法論測定中断のセル時間をかけて Sengcoらの方法論の構築4選択時、プロセス全体で測定を行うとリアルタイムのビデオ画像とこれらの時間間隔をペアリングします。多くの異なる我々 の分析を (藻類やシアノ バクテリア) の生物学的または非生物 (合成凝集剤) 凝集剤などを使用してアニオン系凝集剤の存在下で粘土の沈降を含む他の実験のプロトコルと比較すると、カウントします。まず、我々 の研究にはでは他の多くの研究を含む淡水種や細胞外多糖類物質5,23,24を作り出す種、シアノ バクテリアの海洋球状の種の使用が含まれます。,25します。 さらに、我々 の研究は、解決は静的に残る標準的なタンクの使用を含みます。これは、研究を行うタンクを使用してテスト チューブやシリンダー3,12,14または水路、流体の流れが関心6、7の変数とは対照的します。実験的手法の静的な性質は、floccules ないが保管される懸濁液の乱流によってベースライン堆積速度の測定のためことができます。さらに、得られた沈殿物のより良い視覚化のためフラット タンク両サイドのためできますテスト チューブ、瓶やビーカーではなくタンクを使用映像はカーブに起因するひずみを示さないし、光が均等に分散します。対策に方法論記載第三に、短い (2 分間隔) および長い (時間間隔) 的に凝集率また、画像は数秒から数分、両方のプロセスの可視化や定着率の付加的な測定のスケールでコンパイルできます。ほとんど研究メジャー凝集率以上完全な時間間隔5,6,23,25に半分または単に測定セル左の最終的な数単一時間後懸濁液ポイント (2-2.5 h)9,24, が、いくつかの研究9セルまたはクロロフィル 2 分間隔以上の濃度の変化を測定しました。凝集することができます急速に (5-10 分) 以内に発生するので選ばれたサンプル間隔は重要です22。最後に、私たちの方法論の主要な強さはそれが作り出された集計だけではなく、凝集過程のリアルタイム画像を生成すること (例えば。、Avnimelech et al., 1982)24。データ、サンプリングと視覚的証拠から細胞濃度の 2 つの行を持つ結果の信頼性を強化し、強固な結論をサポートしています。
粘土とシアノ バクテリア、我々 のプロトコルの凝集率を測定に適したタンク内のサンプリング位置に関して注意が必要です。タンク (x、y、z) の同じ領域を試さなくてはならないたびにまたはサンプルの結果傾斜することができます。ケアも OD 測定を行う前に和解するすべての粒子を許可するように取られなければなりません。重要なステップがあります: i) すべての実験で一貫して残っている適切なサンプリング間隔を使用して、ii) の適切な抽出を確保するためメタノールの添加後、粘土/シアノ バクテリアの餌が十分に壊れていることを確認細胞からクロロフィル。
ここで説明する手法も完全に酸素条件下で凝集をモデルに限定です。実験装置およびプロシージャは無酸素下海成層水の列をモデルに変更する必要があります。
堆積学的文脈の中では、このメソッドは、有機物と河川流入量から塩分濃度の変化などの側面を理解するために粘土鉱物の比率または生物学的材料のモデリングの預金に適用される可能性をあります。さらに、このメソッドを使用して生成された堆積物は、リミックスや撹拌によってフロック コヒーレンスの作り直し潜在的な嵐の影響を調査する使用できます。映像によるシアノ バクテリア細胞濃度の直接測定を組み合わせることでこのプロトコルを超越するシアノ バクテリア/粘土凝集プロセスの従来のアプリケーションと堆積学的に適用されるこれらのプロセスでは、ロック レコードのモデリング。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
作者は感謝して自然科学と工学研究評議会カナダ (05448、165831、213411) からの資金を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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