Summary
Samhandling og sedimentering leire og bakterieceller marine riket, observert i naturskjønne omgivelser, kan undersøkes best i et kontrollert laboratoriemiljø. Her beskriver vi en detaljert protokoll, som skisserer en ny metode for å måle sedimentering frekvensen av leire og cyanobacterial floccules.
Abstract
Mekanismene underbygger avsetning av finkornet, er organiske-rik sedimenter fortsatt i stor grad omdiskutert. Virkningen av samspillet av leire partikler med reaktive, planktoniske cyanobacterial celler i sedimentære posten er spesielt under studert. Dette samspillet er en potensielt stor bidragsyter til skifer depositional modeller. I lab omgivelser, kan flocculation og sedimentering utbredelsen av disse materialene undersøkes og målt i et kontrollert miljø. Her, detalj vi en protokoll for å måle sedimentasjonsrate cyanobacterial/leire blandinger. Denne metodikken demonstrert ved at beskrivelsen av to sample eksperimenter: først bruker kaolin (en dehydrert form for kaolinite) og Synechococcus sp. PCC 7002 (en marine coccoid Cyanobakterie), og andre bruker kaolin og Synechocystis sp. PCC 6803 (en ferskvann coccoid Cyanobakterie). Cyanobacterial kulturer er blandet med varierende mengder leire i en spesialdesignet tank apparater optimalisert for å gi kontinuerlig, sanntids video og Fotografiske opptak. Utvalgstrekking er detaljerte samt en post samling protokoll for nøyaktig måling av klorofyll en som konsentrasjonen av cyanobacterial celler i suspensjon kan bestemmes. Gjennom eksperimentell replikering, er en profil konstruert som viser sedimentasjonsrate.
Introduction
Med dagens miljømessige forhold og prosesser for å antyde forbi depositional mekanismer har lenge vært en understøttelsen av sedimentology. Mens moderne depositional analoger, som Svartehavet, brukt å forstå avsetning av organiske-rik, spesifiserte har laboratorieforsøk potensial til å kaste ytterligere lys over opprinnelsen av skifer. En er forespørsel i genesis av svart Leirskifer deponering rate og opprinnelige formasjonen mekanisme. Tradisjonelt, har det vært hypotesen at svart Leirskifer dannet i miljøer der sedimentering pris, primære produktivitet, og organisk materiale åndedrett priser fremme bevaring av organisk materiale i sedimenter1,2 ,3. Men rollen som cyanobacterial og leire flocculation hovedsak har vært unconsidered. Denne mekanismen av flocculation ville tillate rask deponering av organiske-rik, spesifiserte sedimenter skje, og ikke kreve lav oksygen. Vurderer dette premisset, denne protokollen har to mål: 1) måle sedimentering frekvensen av cyanobacterial/leire floccules og 2) visualisere sedimentering prosessen i sanntid. Denne metodikken, i tillegg til geokjemiske analyse, har blitt brukt til å demonstrere det cyanobacterial/leire flocculation kan faktisk være en viktig mekanisme for skifer formasjon1. Selv opprinnelig ment for modellering skifer deponering, gjelder denne metoden andre disipliner som biologi og miljømessige Utbedring der innflytelsen av leire inngang på bakteriell metabolisme og befolkningen må måles.
Tallrike studier har vært gjennomført for å observere flocculation Cyanobakterie og leire, for begrensende skadelige alge blomstrer2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. men mens du måler celle konsentrasjon over tid, disse studiene har ikke brukt Cyanobakterie/leire flocculation modellering avsetning av rock posten. Som sådan, mangler disse studiene en visuell komponent, som kan være kritisk når modellering forbi sedimentological prosesser. I tillegg fleste studier utnytte celle-telling (f.eks Pan et al. 11), som kan være en arbeidskrevende. Vår metode, med nylige fremskritt innen måling cyanobacterial flocculation, bestemmer endringene i cyanobacterial celle konsentrasjon av måler klorofyll en (Chl en) for diskret tidsintervaller. Sammenkobling Chl en måling med visuelle data er en ny tilnærming, som kan brukes til å overvåke depositional forhold. Bildene genereres kan også brukes til å beregne sedimentasjonsrate etter arbeidet Du et al. 13. kombinasjonen av visuelle og numeriske data styrker pålitelighet resultatene. Videre skissere vi flere protokoller slik at sedimentering døde biomasse og leire kan også sees. Dette er viktig når du vurderer forbi sedimentological miljøer, der det er levende og døde biomasse co har oppstått. Forskjeller i virkemåten til døde biomasse under flocculation (for eksempel nedgang i flocculation rate) må være sedimentological implikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør Cyanobacterial kulturer
-
Forbereder inoculation kulturer bruker solid medier
- Få axenic cyanobacterial celler fra amerikansk Type kultur samlingen eller Pasteur kultur samling. For eksempel encellede, marine Synechococcus sp. PCC 7002 ble Hentet fra samlingen Pasteur kultur, det vil bli referert til heretter som Synechococcus.
- Opprettholde Synechococcus celler på platene med heldekkende media (A + flytende media14 og 1,5% agar15). Dette vil bli referert til heretter som inoculation kulturer.
- Inkuber platene på 32 ± 2 ° C med kontinuerlig lys på 30-50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18.
- Gjenta 1,1-1,3 og erstatte en + media med BG-1116 i trinn 1.1.2 for ferskvann cyanobacterial arter, som Synechocystis sp. PCC 680316,17, referert til heretter som Synechocystis. Se tabellene 1 – 4 for sammensetningen av A + og BG-11.
-
Forbereder flytende kulturer: hver tank eksperiment krever en 400 mL cyanobacterial kultur.
- Samle en 250 mL og to 1 L varmebestandig Erlenmeyer kolbe.
- Skyll hver kolbe med en 4 M saltsyre (HCl) løsning (30 mL av HCl løsning for hver kolbe), etterfulgt av destillert vann.
Forsiktig: saltsyre er etsende og giftig. Kontroller at en labfrakk, vernebriller og syrefast hansker er slitt mens du bruker 4 M HCl løsning. Utføre dette trinnet i et laboratorium vasken og Følg lokale bestemmelser for kasting av 4 M HCl løsning - Fyll 250 mL kolbe med 50 mL av flytende media (A + eller BG-11). Fyll en 1 L kolbe med 400 mL væske media (A + eller BG-11) og andre 1 L kolbe med 600 mL av media (A + eller BG-11).
- Forsegle hver flasken en gass permeabel skum stopper og dekke skum disables og kolbe halsen med tinfoil.
- Etikett og autoklav tillate kolber 121 ° C og 100 kPa for 25 min. kolber avkjøles til romtemperatur.
- Klargjør laminær strømning hette ved sterilisering overflaten med 70% alkohol.
- Samle en wire inokuleringen sløyfe, en Bunsen brenner, avkjølt 50 mL væske media kolbe (fra trinn 1.2.5) og vaksinering kultur (fra trinn 1.1). Plassere disse elementene i steriliserte flyt panseret.
- Sterilisere wire inoculation loopen kort med flammen i en Bunsen brenner og la den avkjøles.
- Dra kule loopen langs overflaten av vaksinering kulturen å samle cyanobacterial celler.
- Fjerne skum stopper og folie lue fra 250 mL kolbe (uten å berøre skum stopperen) og sterilisere kanten av Erlenmeyer kolbe ved å passere det kort gjennom flammen.
- Vipp kolbe så media er nær halsen av flasken og sett inoculation loopen belagt med celler i flasken. Når loopen er neddykket i media, rør inokuleringen sløyfe for å fjerne celler.
- Fjern inoculation loopen og re sterilisere av flasken bruker Bunsen brenner flammen.
- Erstatte skum stopper og folie lue på Erlenmeyer kolbe (uten å berøre den skum stopperen).
- Sterilisere inoculation loopen kort i Bunsen brenner flammen.
- Forberede en vekst rom (referert til som vekst kammer) der temperaturen er opprettholdt på 30 ° C15,18 og lysintensiteten 30-50 µmol fotoner m-2 s-1,15,18 . Fuktighet, kontrolleres ikke aktivt.
- Tillat inokulerte 50 mL kulturen å ruge ved å riste på 150 rpm i vekst kammer, med en vedlikeholdt temperatur på 30 ° C. Holde munn kolbe dekket under omrøring til å kontrollere fordamping tap og hindre forurensning.
- La cyanobacterial culture(s) å vokse i 96 h. En vellykket kultur skal vises lysegrønn og har en optisk tetthet (OD) på 750 nm på 0,4-0,6.
- Når kulturen har vokst nok, plass 50 mL kultur og 1 L kolbe med 400 mL flytende medium (fra trinn 1.2.5) i laminær strømning panseret. Sikre flyten panseret er sterilisert følgende trinn 1.2.6.
- Gjenta trinn 1.2.10 for begge flasker i laminær strømning hette.
- Hell 50 mL kulturen i det 400 mL av media i 1 L flasken og re sterilisere av 1 L kolbe bruker Bunsen brenner flammen.
- Stedet skum stopper og folie cap, Knytt en steril boblende apparater som består av skum disables, pipette, plast rør, innebygd filter og folie dekselet til munningen av flasken.
- Agitere 1 L kolbe 150 RPM på 30 ° C med bubbler apparatet knyttet til en luftpumpe, som sirkulerer en fuktet luft-blandingen gjennom løsning15,18 på 300 mL/min.
- Tillate culture(s) å vokse i vekst kammer ved 30 ° C i 120-168 h. En vellykket kultur skal vises lysegrønn og har et OD750 nm på 0,4-0,6.
- Gjenta trinn 1.2 å produsere en kontroll-kultur, som ikke vil bli blandet med leire.
- Eksperimenter ved hjelp av død biomasse krever et ekstra trinn. Autoclave 1 L kolbe kultur for 60 min 121 ° c og la den avkjøles til romtemperatur.
2. eksperimentelle oppsett
- Plass en rektangulær akryl tank (lengde på 20 cm), 5,1 cm bredde og høyde på 30 cm foran en bank av lysrør (ni T8 pærer, minst 2600 lumen; Figur 1) 19.
- Plass gjennomsiktig, hvit plast ark mellom bredden av lys og tanken å spre lys, som skinner gjennom tanken. Dette oppsettet ble tilpasset fra Sutherland et al. 19
- Merk akryl tank i en høyde på 10 cm, målt vertikalt fra basen. Alle mål gjøres på denne høyden i kolonnen vann å sikre konsekvens i alle prøvetaking.
- Plassere et kamera på et stativ, 1 m foran tanken å registrere hvert eksperiment. Et videokamera anbefales som bildene kan hentes fra video-filer, og ved hjelp av matematisk modellering programvare, videofiler kan brukes til å modellere bosetting dynamics19.
- Plass en svart klut over lys banken, tank og kameraet å skjerme eksperimentet fra utenfor lyskilder (figur 1).
3. flocculation eksperimentelle protokollen
- Samle 400 mL kultur (trinn 1.2), store uteksaminert sylinder og 600 mL ekstra vekst medier i en 1 L kolbe (trinn 1.2.5).
- Fortynne 400 mL kultur (første celle konsentrasjon av 4-6 mg/mL) med ytterligere vekst medier (A + eller BG-11) til siste volum 1 l bruker uteksaminert sylinder. Legg til denne løsningen acrylic akvariet.
- Klargjør 2 mL microfuge rør ved merking og plassere dem i en beleilig beliggenhet nær acrylic akvariet. Mål 50 g av leire for eksperimentet.
- Start videoinnspilling. Hvis flere eksperimenter, kan et skilt med eksperimentet identifikatoren midlertidig holdes før kameraet.
- Bruker en pipette, ta en 1 mL prøve og plasserer den i en merket microfuge tube. Bruk dette eksemplet til å bestemme den første cyanobacterial celletall ved å måle OD750 nm verdier. Ta alle prøvene i tre eksemplarer å sikre nøyaktige resultater.
- Raskt hell leire (50 g) i tanken med energisk omrøring med en gripende pinne for 10-15 s.
- Starte tidtakeren og ta første 1 mL prøven for Chl beslutning bruker en P1000 pipette (eksempel tid0) .
- Ta flere eksempler på riktig tidsintervaller (f.eks1 minutt, 2 minutter, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min og 240 min).
- Når eksperimentet er ferdig, lagre videofilen, slå av videokameraet, og behandle alle prøver for Chl beslutning (trinn 4) .
- Autoclave gjenværende leire/cyanobacterial løsningen. Avhengig av cyanobacterial Art kast lokale bestemmelser og lab politikk, løsning ved hjelp av egnede metoder. Tanken med såpe og vann, skyll ren den med destillert vann og luft tørke den.
- Forberede en kontroll eksperiment med ingen leire lagt. Ta prøver på samme tidspunkt. Denne informasjonen kan sammenlignes med andre eksperimentelle data å bekrefte at bosetting priser er forbedret på grunn av flocculation med leire, ikke et resultat av naturlige settling.
- Hvis død biomasse brukes under eksperimentet, kan du bruke den samme eksperimentelle prosedyren. Disposisjon prosedyren av løsningen krever imidlertid ikke autoklavering.
4. prøve behandling og evaluering
- Bestemme Chl en konsentrasjon i hver celle prøve benytter en prosedyre endret fra Owttrim16. Når samlet, pellets cellene fra hver prøve for 3 min 13 000 x g ved hjelp av en microcentrifuge ved romtemperatur.
- Fjern overflødig medier med en P1000 pipette og tilsett 1 mL av 100% metanol (20 ° C). Vortex prøven i full fart for 1 min til resuspend celle pellets.
FORSIKTIG: Metanol er giftige og brennbare. Bruke hansker og vernebriller, og holde metanol fra antennelseskilder. - Inkuber samples ved 20 ° C 24 h til rette for utvinning av Chl en.
- Etter inkubasjon pellets mobilnettet rusk som beskrevet i 4.1, overføre grønne supernatant til søppel bruker en pipette, og plassere cuvette i spektrofotometeret. La prøven i spektrofotometer for 1 min å sikre at alle gjenværende leire i prøven ro og forstyrrer ikke målet.
- Bestemme Chl en konsentrasjon spektrofotometrisk ved å måle absorbans ved 665 nm og 652 nm og OD på 750 nm. Chl en konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av formelen Chl en = 16.29 x (en665 - OD750) - 8.54 x (en652 - OD750) 20. CHL en konsentrasjon brukes som en proxy for cellen konsentrasjon. I tillegg en konverteringsfaktor på 7,4 x 1010 celler/L = 10 g/L21 kan brukes til å beregne celle konsentrasjonen i gram cyanobacterial arter.
- Tomten beregnet Chl verdier versus tid .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de utsettes for leire, føres cyanobacterial celler av suspensjon22. Dette er demonstrert i representant resultatene gitt her. Å bestemme effekten av leire på cyanobacterial bestander og observere sedimentering priser, to eksperimenter ble utført der Synechococcus og Synechocystis ble utsatt for 50 g/L kaolinleire (tabell 5-6, Figur 2–3). Cyanobacterial kulturer ble dyrket som beskrevet i trinn 1. Senere, etter setter opp tanken (trinn 2), ble utvannet Synechococcus kultur helles i akvariet og blandet med 50 g av kaolinleire etter trinn 3. Dette ble gjentatt for Synechocystis kultur. Alle prøvene ble samlet fra den samme plasseringen i tanken. Prøvene ble behandlet og målinger av OD652 og OD665 samt den beregnede Chl en verdien gitt for Synechococcus (tabell 5) og Synechocystis (tabell 6). Disse resultatene var plottet grafisk linje tomter og sammenlignet resultatene av standarder for å fastslå om bosetting frekvensen av cyanobacterial/leire blandinger høyere enn naturlig bosetting Cyanobakterie bare. Disse resultatene viser at cyanobacterial befolkningen ble bragt ut suspensjon i 10 min leire eksponering (figur 2–3). Den marine Synechococcus viste en rask sedimentering rate enn ferskvann Synechocystis, som samsvarer med hypotesen at trivalent kasjoner (utbredt i vekst medium, som etterligner saltholdighet i saltvann) fungere som bygger bro agent mellom leire partikler og bakterielle celler, tilrettelegge flocculation og derfor sedimentering1.
Det er viktig å merke seg at i Figur 3, er det noen anomalously høy resultater, spesielt ved punkt 2. Dette er et eksempel på prøve behandling under hvilke skritt 4.4 ikke var tilstrekkelig fulgt eksemplet ble grumset under målingen. Dette gir en kunstig høyt resultat (figur 2, datapunktet 2). Et eksempel på bilder i tidsserier, Hentet fra en video finnes i Figur 4, tilpasset fra Playter et al. 22. det er viktig å merke seg at kaolinite (ikke kaolin) ble brukt i Playter et al. 22.
Figur 1 : Forklarende diagrammet illustrerer eksperimentelle oppsettet. Et videokamera er satt opp minst 1 m og tank apparater. Tanken er fylt med 1 L Cyanobakterie og flytende. Lyser belyse tanken bak og lyset spres med en gjennomsiktig film. Hele dette satt opp er drapert med en svart klut for å fjerne ekstra lyskilder. Dette tallet er endret fra Sutherland et al. 19. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Chl i konsentrasjoner beregnet fra OD verdiene gitt i tabell 1. Disse verdiene er fra en Synechococcus /kaolin blanding (gul). Sammenligning med Chl en konsentrasjoner for Synechococcus bare (blå) viser en økt sedimentering for cyanobacterial/leire blandingen. Dette tallet har blitt endret fra Playter et al. 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Chl en konsentrasjoner beregnet fra OD verdiene gitt i tabell 2. Disse verdiene er fra Synechocystis /kaolin blanding (gul). Sammenligning med Chl en konsentrasjoner for Synechocystis bare (blå) viser en økt sedimentering for cyanobacterial/leire blandingen. Dette tallet har blitt endret fra Playter et al. 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant gang løpet av Synechococcus-kaolinite avsettelse. Disse øyeblikksbilder er Hentet fra den innspilte videoen på diskrete tidsintervaller (1 min). Dette tallet har blitt endret fra Playter et al. 22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| For 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7T2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7.2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6t2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8.2 |
| 1 mL P1 metaller lager * |
Tabell 1: oppskrift på en + media 14 . Se tabell 2 for sammensetningen av P1 metaller lager. Denne oppskriften gir 1 L media.
| 1 L P1 metall aksje |
| 34.26 g H3BO3 |
| 4.32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (85%) |
| 0.003 g CuSO4 ∙ 5t2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6t2O |
Tabell 2: Oppskrift på P1 metaller lager kreves for en + media.
| For 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47T2O |
| 1 mL CaCl2 2t2O |
| 1 mL sitronsyre H2O |
| 1 mL Ferric Ammonium Citrate |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 Microelements * |
Tabell 3: oppskrift for BG-11 media 16 . Se Tabell 4 for sammensetningen av A5 Microelements. Denne oppskriften gir 1 L media.
| For 1 L lagerløsning |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| 0.222 g ZnSO4 7T2O |
| 0.390 g Na2MoO4 2t2O |
| 0.079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6t2O |
Tabell 4: Oppskrift på A5 Microelement lager kreves for BG-11 media.
| Testtiden (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0,027 | 0.025 | 0.226 |
| 30 | 0.007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0.007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0.012 | 0.000 |
Tabell 5: OD 665 og OD 652 mål for Synechococcus i nærvær av 50 g/L kaolinleire. CHL en verdiene beregnes ved hjelp av formelen i trinn 4.4. Merk som t6 og t7 mangler. Dette er et eksempel på ikke å holde en konsekvent prøveintervallet per celle prøvetaking protokollen. Dataene for standard hentes fra Playter, et al. (2017) 2.
| Testtiden (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL en (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0.169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0.007 | 0.201 |
| 180 | 0.012 | 0.004 | 0.161 |
| 240 | 0,011 | 0.005 | 0.136 |
Tabell 6: OD 665 og OD 652 mål for Synechocystis i nærvær av 50 finans kaolinleire. CHL en verdiene beregnes ved hjelp av formelen i trinn 4.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flocculation katalysert av cyanobacterial celle leire interaksjon har tiltrukket seg mye interesse i økologi og engineering2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, men etterforskningen av disse interaksjoner med hensikten av modellering avsetning av sedimentære (for eksempel Leirskifer) er relativt ny. Effekten av denne prosessen, er i dette tilfellet for sedimentological programmer, ikke rapportert. I siste flocculation studier, er disse interaksjonene gransket av leire og Cyanobakterie i glass, test-rør, eller begre og prøvetaking på diskrete tid intervaller9,11,12, 26 å avgjøre forandringene i cellen konsentrasjon gjennom tiden. Disse studiene har målt konsentrasjonen av cyanobacterial celler på forskjellige måter. For eksempel har samplet cyanobacterial celle populasjoner blitt målt ved å telle ved hjelp av et mikroskop9,11,12,26. Sammenlignet med den første celle konsentrasjonen, kan fjerning effektiviteten være beregnede9,11,12,26. I en egen studie, etter at leire/mobiltelefon blandingen å bosette, ble flytende gjenværende over utlignede cellen/leire sedimentet samplet og analysert for fluorescens å anslå antall gjenværende celler i suspensjon3. Målinger av Chl en direkte fra kolonnen vannprøver har også blitt brukt til å beregne celle konsentrasjon8,10.
I kontrast, måler vår metode cellene i suspensjon over tid, bygge på metoder for Sengco, et al. 4 av tar målinger Velg ganger gjennom hele prosessen, og sammenkobling disse tidsintervaller med sanntids video tenkelig. Sammenlignet med andre eksperimentelle protokoller som involverer bosetting av leire i nærvær av anionic flocculants, forskjellig biologiske (alger eller Cyanobakterie) eller ikke-biologiske (syntetisk flocculent agenter) flocculants, vår analyse på mange teller. Først innebærer vår studie bruk av en marine coccoid arter av Cyanobakterie, mens mange andre studier involverer ferskvann arter eller arter som produserer ekstracellulære polysakkarid stoffer5,23,24 , 25. i tillegg vår studie innebærer bruk av en standard tank, som løsningen forblir statisk. Dette gir kontrast til studier gjort med test-rør eller sylindere3,12,14 eller barnesklier stridsvogner, der væskestrøm er en variabel rente6,7. Statisk natur våre eksperimentell metode gir måling av sedimentering basissatser, der floccules er ikke holdt i suspensjon av turbulente flyt. I tillegg tillater bruker en tank i stedet for en reagensglasset, jar, eller kanne, for bedre visualisering av den resulterende innskudd på grunn av de flate tank sidene; bildene viser ingen forvrengning på grunn av buede og lyset er jevnt spredt. Tredje metodikk beskrevet her tiltak flocculation priser over både korte (2 min intervaller) og lange (time intervaller) begrepet; i tillegg kan bilder kompileres på skalaer sekunder til minutter, slik at både visualisering av prosessen, og en ekstra måling av bosetting rate. De fleste studier mål flocculation priser over halvparten til hele intervaller5,6,23,25 eller bare mål det endelige antallet celler igjen i suspensjon etter en eneste gang punkt (2- 2,5 t)9,24, selv om noen studier9 har målt i cellen eller Chl en konsentrasjon i 2 minutters intervaller. Prøveintervallet valgt er kritisk, som flocculation kan skje raskt (innen 5-10 min)22. Til slutt, en stor styrke for vår metode er at det gir sanntid bilder av flocculation, ikke bare de produserte aggregatene (f.eks., Avnimelech et al., 1982)24. Å ha to linjer av data, celle konsentrasjonen fra prøvetaking og visuelle bevis, styrker pålitelighet resultatene og støtter robust konklusjoner.
Mens egnet for måling av flocculation utbredelsen av leire og Cyanobakterie, våre protokollen krever flid med hensyn til hvor prøvetaking i tanken. Det samme området av tanken (x, y, z) må prøves hver gang eller prøven resultatene kan bli fordreid. Også må utvises tillate alle partikler til å bosette før OD målingene gjøres. Kritisk trinnene omfatter: i) bruker et riktig utvalg intervall som fortsatt er konsekvent for alle eksperimenter, og ii) sikrer at leire/cyanobacterial pellets er tilstrekkelig ødelagt etter tillegg av metanol å sikre tilstrekkelig utvinning av klorofyll fra cellene.
Teknikken er beskrevet her er også begrenset til modellering flocculation under fullt oksygenrikt forhold. Av eksperimentelle apparater og prosedyren må endres for å modellere en lagdelt vannsøylen anoksisk bunnen vann.
Innen sedimentological rammen har denne metoden potensial til å brukes til modellering forekomster av forskjellige leire prosenter eller biologisk materiale for å forstå aspekter som endringer i organisk materiale og saltholdighet riverine inndata. Videre kan sedimenter produsert ved hjelp av denne metoden brukes til å undersøke virkningen av potensielle storm omarbeiding på floc-sammenheng av remiksing eller agitasjon. Ved sammenkobling direkte måling cyanobacterial celle konsentrasjon med bilder, denne protokollen overskrider tradisjonell programmer Cyanobakterie/leire flocculation prosesser og gir disse prosessene skal brukes på sedimentological modellering av rock posten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner takknemlig støtte fra naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada (05448, 165831 og 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
