Summary
A interação e a sedimentação da argila e células bacterianas dentro do reino marinho, observada em ambientes naturais, podem ser melhor investigados em um ambiente controlado do laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado, que descreve um método novo para medir a taxa de sedimentação de argila e cianobactérias floccules.
Abstract
Os mecanismos subjacentes a deposição de granulação fina, sedimentos orgânicos ricos ainda em grande parte são debatidos. Especificamente, o impacto da interação de partículas de argila com reativas, planctônicas células das cianobactérias para o registro sedimentar é menos estudado. Essa interação é potencialmente grandes contribuintes para modelos deposicionais de xisto. Dentro de um ambiente de laboratório, as taxas de floculação e sedimentação destes materiais podem ser examinadas e medidas em um ambiente controlado. Aqui, detalhamos um protocolo para medição da taxa de sedimentação de misturas de cianobactérias/argila. Esta metodologia é demonstrada através da descrição de duas experiências de amostra: o primeiro usa caulim (uma forma desidratada de caulinita) e Synechococcus SP PCC 7002 (um cianobactérias cocoides marinho), e a segunda usa caulim e Synechocystis SP. PCC 6803 (um de água doce cocoides cianobactérias). Culturas de cianobactérias são misturadas com quantidades variadas de barro dentro de um aparelho de tanque projetado especialmente otimizado para permitir que o vídeo contínuo, em tempo real e gravação fotográfica. Os procedimentos de amostragem são detalhados bem como um protocolo pós-coleção para medição precisa da clorofila a partir do qual a concentração de células das cianobactérias, permanecendo em suspensão pode ser determinada. Por meio da replicação experimental, um perfil é construído que exibe a taxa de sedimentação.
Introduction
Usar condições ambientais presentes e processos para inferir passado mecanismos deposicionais tem sido um sustentamento de Sedimentologia. Enquanto modernos deposicionais análogos, tais como o mar Negro, têm sido utilizados para entender a deposição de depósitos orgânicos ricos, refinadas, experimentos de laboratório têm potencial para lançar luz adicional sobre a origem dos depósitos de xisto. Uma área de inquérito na gênese de folhelhos pretos é a taxa de deposição e o mecanismo de formação original. Tradicionalmente, ele tem sido a hipótese de que folhelhos negros formaram em ambientes onde a taxa de sedimentação, produtividade primária e taxas de respiração de matéria orgânica promovem a preservação de matéria orgânica no sedimento1,2 ,3. No entanto, o papel das cianobactérias e floculação da argila permaneceu largamente injustificada. Esse mecanismo de floculação permitiria uma rápida deposição de sedimentos orgânicos ricos, refinadas para ocorrer e não necessitam de ser pobre em oxigênio. Considerando esta premissa, o presente protocolo tem dois objectivos: 1) medir a taxa de sedimentação de floccules de cianobactérias/argila e 2) Visualizar o processo de sedimentação em tempo real. Esta metodologia, além de análises geoquímicas, serviu para demonstrar que essa floculação de cianobactérias/argila pode de fato ser um importante mecanismo para a formação de xisto1. Enquanto originalmente destinado para modelação de deposição de xisto, este método é aplicável a outras disciplinas como a biologia e remediação ambiental onde a influência da entrada de argila sobre o metabolismo bacteriano e a população precisa ser medido.
Numerosos estudos têm sido realizados para observar a floculação das cianobactérias e argila, para mitigação de algas nocivas2,3,4,5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. no entanto, ao medir a concentração de células ao longo do tempo, estes estudos não aplicaram floculação cianobactérias/argila para modelar a deposição do registro rocha. Como tal, estes estudos faltam um componente visual, que pode ser crítico quando modelagem por processos sedimentológico. Além disso, a maioria dos estudos utiliza a contagem de células (por exemplo, Pan et al. 11), que pode ser trabalhoso. Nosso método, com os avanços recentes na medição da floculação das cianobactérias, determina as alterações na concentração de células de cianobactérias medindo clorofila a (Chl a) em intervalos de tempo discreto. Emparelhamento Chl uma medição com dados visuais é uma nova abordagem, que pode ser usada para inferir as condições deposicionais. As imagens geradas também podem ser usadas para calcular a taxa de sedimentação após o trabalho de Du et al. 13. a combinação de visuais e numéricas de dados reforça a confiabilidade dos resultados. Além disso, nós esboçamos protocolos adicionais, permitindo a sedimentação da biomassa morta e argila para também ser observada. Isto é importante quando se considera passado sedimentológico ambientes, onde vivo e biomassa morta pode ter ocorrido co. Diferenças no comportamento da biomassa morta durante a floculação (por exemplo, redução na taxa de floculação) potencialmente teria implicações sedimentológico.
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Protocol
1. preparar culturas cianobactérias
-
Preparando as culturas de inoculação usando meios sólidos
- Obter células de cianobactérias axénica da American Type Culture Collection ou coleta de cultura de Pasteur. Por exemplo, os unicelulares, marinho Synechococcus SP. PCC 7002 foi obtida a partir da coleção de cultura de Pasteur, será referido como Synechococcusdaqui por diante.
- Manter Synechococcus células em placas contendo meios sólidos (A + líquido mídia14 e 1,5% ágar15). Isto serão referidos daqui por diante como culturas de inoculação.
- Incube as placas a 32 ± 2 ° C com luz contínua fornecida em 30 – 50 µmol fótons m-2 s-1,15,18.
- Repita as etapas 1.1-1.3 e substituir um + mídia com BG-1116 etapa 1.1.2 para espécies de água doce, cianobactérias, como Synechocystis SP. PCC 680316,17, referida em outra vida como Synechocystis. Consulte tabelas 1-4 para a composição dos meios de comunicação A + e BG-11.
-
Preparação de culturas líquidas: cada experimento tanque requer uma cultura de cianobactérias de 400 mL.
- Recolha uma 250 mL e dois L 1 frasco de Erlenmeyer resistente ao calor.
- Lave cada balão com uma solução de ácido clorídrico (HCl) de 4m (30 mL de solução de HCl para cada frasco), seguida por água destilada.
Cuidado: o ácido clorídrico é corrosivo e tóxico. Certifique-se de que um jaleco, óculos de segurança e luvas resistentes a ácidos são usadas enquanto estiver usando a solução de HCl de 4m. Execute esta etapa em uma pia de laboratório e siga os regulamentos locais relativas à eliminação da solução de HCl de 4m - Encha o balão de 250 mL com 50 mL de meio líquido (A + ou BG-11). Encha um frasco de 1 L com 400 mL de meio líquido (A + ou 11 BG) e o outro balão de 1L com 600ml de mídia (A + ou BG-11).
- Cada frasco com uma rolha de espuma permeável ao gás do selo e cobrir o pescoço de rolha e balão de espuma com papel alumínio.
- Rótulo e autoclave os frascos a 121 ° C e 100 kPa durante 25 min. permitir que os frascos arrefecer à temperatura ambiente.
- Prepare um capuz de fluxo laminar, esterilizar a superfície com álcool 70%.
- Recolha uma ansa de inoculação metálica, um bico de Bunsen, frasco de meio líquido de refrigeração 50 mL (da etapa 1.2.5) e a cultura de inoculação (da etapa 1.1). Coloca esses itens no bairro fluxo esterilizado.
- Esterilize a ansa de inoculação metálica brevemente usando a chama de um bico de Bunsen e deixe-o arrefecer.
- Arraste o loop legal ao longo da superfície da cultura inoculação para coletar células de cianobactérias.
- Remover o bujão de espuma e tampa de alumínio do frasco de 250 mL (sem tocar o batente de espuma) e esterilizar a borda do frasco Erlenmeyer por passagem brevemente através da chama.
- Incline o frasco a mídia aproxima-se o colo do balão e inserir o laço do inoculation revestido com células para o balão. Uma vez que o loop está submersa na mídia, agite o loop de inoculação para remover as células.
- Retire o laço do inoculation e re-esterilizar o lábio do balão utilizando a chama do bico de Bunsen.
- Substitua o bujão de espuma e tampa de alumínio o Erlenmeyer (sem tocar o batente de espuma).
- Esterilize o laço do inoculation brevemente dentro da chama do bico de Bunsen.
- Prepare um quarto de crescimento (referido como a câmara de crescimento) onde a temperatura é mantida em 30 ° C15,18 e intensidade da luz é de 30 – 50 µmol fótons m-2 s-1,15,18 . Umidade não é controlada ativamente.
- Permitir que a cultura inoculado 50ml incubar por agitação a 150 rpm em câmara de crescimento, com uma temperatura mantida entre 30 ° C. Manter a boca do frasco coberto durante a agitação para controlar as perdas por evaporação e evitar a contaminação.
- Permitir que as cianobactérias ficam a crescer por 96 h. Uma cultura bem sucedida deve aparecer verde brilhante e tem uma densidade óptica (OD) em 750 nm de 0.4-0.6.
- Uma vez que a cultura tem crescido suficientemente, coloca a cultura de 50 mL e balão de 1L contendo 400 mL de meio líquido (da etapa 1.2.5) do bairro de fluxo laminar. Garantir que a capa de fluxo é esterilizado passo seguinte 1.2.6.
- Repita a etapa 1.2.10 para ambos os frascos dentro de uma capa de fluxo laminar.
- Despeje a cultura de 50 mL a 400 mL de mídia no recipiente de 1 L e re-esterilizar o lábio do recipiente de 1 L utilizando a chama do bico de Bunsen.
- No lugar a tampa de rolha e folha de espuma, anexar um aparelho subido estéril constituído por uma pipeta, tubo plástico, rolha de espuma, filtro em linha e folha de capa para a boca do balão.
- Agite o frasco de 1 L a 150 rpm a 30 ° C com o aparelho de borbulhador ligado a uma bomba de ar, que circula uma mistura de ar umidificado através de de15,a solução18 a 300 mL/min.
- Permitir que o ficam a crescer dentro da câmara de crescimento a 30 ° C, durante 168 – 120 h. Uma cultura bem sucedida deve aparecer verde brilhante e tem uma OD750 nm de 0.4-0.6.
- Repita a etapa 1.2 para produzir uma cultura de controle, que não será misturada com o barro.
- Experimentos utilizando biomassa morta requerem uma etapa adicional. Autoclave o frasco de 1 L cultura para 60 min a 121 ° C e deixe-a esfriar a temperatura ambiente.
2. experimental instituído
- Coloque um tanque acrílico retangular (comprimento de 20 cm), largura de 5,1 cm e altura de 30 cm na frente de um banco de lâmpadas fluorescentes (nove lâmpadas T8, pelo menos 2.600 lúmens; A Figura 1) 19.
- Coloque uma folha de plástico translúcida, branca, entre a margem das luzes e do tanque para difundir a luz, que brilha através do tanque. Esta instalação foi adaptada de Sutherland et al . 19
- Mark o tanque acrílico a uma altura de 10 cm, medida verticalmente desde a base. Todas as medições devem ser feitas a esta altura na coluna d'água para garantir a consistência da amostragem todos.
- Coloca uma câmera em um tripé, 1 m à frente do tanque para gravar cada experimento. Recomenda-se uma câmera de vídeo como imagens podem ser extraídas de arquivos de vídeo, e usando o software de modelagem matemática, arquivos de vídeo podem ser usados para modelar o assentamento dinâmica19.
- Coloque um pano preto sobre a luz banco, tanque e câmera para proteger o experimento de fontes externas de luz (Figura 1).
3. floculação protocolo Experimental
- Recolha a cultura de 400 mL (etapa 1.2), um grande cilindro graduado e 600 mL de meio de crescimento extra num balão de 1L (etapa 1.2.5).
- Dilua a cultura de 400 mL (concentração inicial de célula de 4 a 6 mg/mL) com mídia de crescimento adicional (A + ou BG-11) para volume final de 1 L, usando o cilindro graduado. Adicione a solução para o tanque de acrílico.
- Prepare 2 mL tubos de microcentrífuga, rotulagem e colocando-os em uma localização conveniente perto do tanque de acrílico. Medida de 50g de argila para o experimento.
- Começa a gravação de vídeo. No caso de várias experiências, um sinal com o identificador do experimento pode ser temporariamente realizado antes da câmera.
- Utilizando uma pipeta, tirar uma amostra de 1 mL e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga rotulada. Usar esse exemplo para determinar a contagem de células de cianobactérias inicial medindo o OD750 nm valores. Leve todas as amostras em triplicata para garantir resultados precisos.
- Rapidamente despeje a argila (50 g) tanque com agitação vigorosa, usando uma vara de agita para 10-15 s.
- Iniciar o temporizador e tirar a amostra de 1ml inicial para Chl uma determinação usando uma pipeta P1000 (amostra tempo0).
- Tirar amostras adicionais em intervalos de tempo adequados (por exemplo, 1min, 2min, 3min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 60 min, 180 min e 240 min).
- Uma vez terminado o experimento, salvar o arquivo de vídeo, desligue a câmera de vídeo e processar todas as amostras para Chl uma determinação (passo 4).
- Autoclave a solução restante argila/cianobactérias. Dependendo da espécie de cianobactérias, os regulamentos locais e diretiva de laboratório, descarte a solução usando métodos apropriados. Limpar o tanque com água e sabão, enxágue com água destilada e seque-o ar.
- Prepare um experimento de controle com nenhuma argila adicionada. Colher amostras nos pontos de tempo mesmo. Este dados podem ser comparados aos outros dados experimentais para confirmar que as taxas de sedimentação são reforçadas devido a floculação com argila, não um resultado de sedimentação natural.
- Se a biomassa morta é usada durante o experimento, use o mesmo procedimento experimental. No entanto, o procedimento de eliminação da solução não requer esterilização em autoclave.
4. processamento e avaliação da amostra
- Determine a Chl uma concentração em cada amostra de célula, usando um procedimento modificado de Owttrim16. Uma vez recolhidos, pelota as células de cada amostra por 3 min a 13.000 x g usando microcentrifuga à temperatura ambiente.
- Remova o excesso mídia usando uma pipeta P1000 e adicione 1 mL de metanol 100% (20 ° C). A amostra a toda a velocidade para 1 min Ressuspender as células de vórtice.
Atenção: O metanol é tóxico e inflamável. Usar luvas e óculos de segurança e manter o metanol longe de fontes de ignição. - Incube as amostras a-20 º C por 24 h facilitar a extração de Chl a.
- Após a incubação, os restos celulares de Pelotas, conforme descrito em 4.1, transferir o sobrenadante de verde para uma cubeta com uma pipeta e colocar a cubeta do Espectrofotômetro. Permitir que a amostra descansar no espectrofotómetro para 1min garantir que qualquer argila restante dentro da amostra se instala e não interfere com a medição.
- Determinar uma concentração de Chl espectrofotometricamente medindo absorvância a 665 nm e 652 nm e OD a 750 nm. A Chl uma concentração é determinada usando a fórmula Chl um = 16.29 x (um665 - OD750) - 8,54 x (um652 - OD750) 20. Uma concentração de CHL é usada como um proxy para a concentração de células. Além disso, um fator de conversão de 7.4 x 1010 células/L = 10 g/L21 pode ser usado para calcular a concentração de células em gramas de algumas espécies de cianobactérias.
- Plotar Chl um valores calculados versus tempo.
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Representative Results
Quando exposto a argila, células de cianobactérias são trazidas da suspensão22. Isso é demonstrado nos resultados representativos dados aqui. Para determinar o efeito da argila em populações de cianobactérias e observar a sedimentação taxas, foram conduzidos dois experimentos durante o qual Synechococcus e Synechocystis foram expostos a argila de caulim de 50 g/L (tabela 5-6, Figura 2– 3). Culturas de cianobactérias foram cultivadas conforme descrito na etapa 1. Posteriormente, após a criação do tanque (etapa 2), a cultura de Synechococcus diluída foi derramada dentro do tanque e misturada com 50 g de argila de caulim, seguindo o passo 3. Isso foi repetido para a cultura de Synechocystis . Todas as amostras foram coletadas na mesma posição no tanque. As amostras foram processadas e medições de OD652 e OD665 , bem como o Chl um valor calculado são dadas por Synechococcus (tabela 5) e Synechocystis (quadro 6). Estes resultados foram plotados graficamente em parcelas de linha e comparados com os resultados dos padrões para determinar se a taxa de sedimentação de misturas de cianobactérias/argila foi maior do que a taxa de sedimentação natural de cianobactérias somente. Estes resultados demonstram que as populações de cianobactérias foram trazidas da suspensão dentro de 10 min de exposição de argila (Figura 2– 3). A Marinha Synechococcus mostrou uma taxa de sedimentação mais rápida do que a água fresca Synechocystis, que é consistente com a hipótese que cátions trivalentes (predominante no meio de crescimento, que imita a salinidade da água salgada) atuar como agente de ponte entre as partículas de argila e células bacterianas, facilitando a floculação e, portanto, sedimentação1.
É importante observar que na Figura 3, existem alguns resultados anormalmente altos, especificamente em dados ponto 2. Este é um exemplo de processamento de amostra durante qual etapa 4.4 não foi suficientemente seguido e a amostra tornou-se turva durante a medição. Isso produz um resultado artificialmente elevado (Figura 2, dados ponto 2). Um exemplo de imagens nas séries cronológicas, extraídos de um vídeo são fornecidos na Figura 4, adaptado de Playter et al. 22. é importante notar que caulinita (não caulim) foi usada em Playter et al. 22.
Figura 1 : Explicativo diagrama ilustrando a instalação experimental. Uma câmera de vídeo está configurada pelo menos 1 m do aparelho de tanque. O reservatório é enchido com 1 L de cianobactérias e meio líquido. As luzes iluminam o tanque por trás e a luz é dispersa por uma película translúcida. Esta todo conjunto é coberto com um pano preto para eliminar as fontes de luz adicionais. Esta figura foi modificada de Sutherland et al. 19. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Chl um concentrações calculadas a partir OD valores dados na tabela 1. Esses valores são de um Synechococcus /mistura de caulim (amarelo). Comparação com Chl um concentrações para Synechococcus apenas (azul) mostra uma aumento de hemossedimentação para a mistura de cianobactérias/argila. Esta figura foi modificada de Playter et al 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Chl um concentrações calculadas a partir OD valores dados na tabela 2. Esses valores são de Synechocystis /mistura de caulim (amarelo). Comparação com Chl um concentrações para Synechocystis apenas (azul) mostra uma aumento de hemossedimentação para a mistura de cianobactérias/argila. Esta figura foi modificada de Playter et al 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Curso de tempo representativo de Synechococcus-deposição de caulinita. Esses instantâneos são extraídos do vídeo gravado em intervalos de tempo discreto (1 min). Esta figura foi modificada de Playter et al 22. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Para 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0,6 g de KCl |
| g 1 NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7,2 mL CaCl2 |
| ΜL 161 at2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL de Tris HCl pH 8,2 |
| 1 mL P1 metais estoque * |
Tabela 1: receita para um + media 14 . Consulte a tabela 2 para a composição do estoque de metais de P1. Esta receita produz 1L de mídia.
| Estoque do metal para 1 L P1 |
| 34,26 g H3BO3 |
| 4,32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0,315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (85%) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5h2O |
| g 0,01215 CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tabela 2: Receita para P1 metais ações necessárias para um + media.
| Para 1 L |
| 10 mL de NaNO3 |
| mL 1 K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL de ácido cítrico H2O |
| Citrato de amónio férrico 1 mL |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| Microelementos de A5 1 mL * |
Tabela 3: receita para mídia BG-11 16 . Consulte a tabela 4 para a composição de microelementos A5. Esta receita produz 1L de mídia.
| Para 1 L de solução-mãe |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1,81 g MnCl2 4 H2O |
| 0,222 g ZnSO4 7 H2O |
| g 0,390 at2MoO4 2 H2O |
| 0,079 g CuSO4 5 H2O |
| 0,40 g CoCl2 6 H2O |
Tabela 4: Receita para A5 microelemento estoque necessário para mídia BG-11.
| Tempo da amostra (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL um (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0,046 | 1.432 |
| 10 | 0,024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0,027 | 0.025 | 0,226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0.061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0.061 | 0.000 |
| 180 | 0.005 | 0,012 | 0.000 |
| 240 | 0.005 | 0,012 | 0.000 |
Tabela 5: OD 665 e OD 652 medições para Synechococcus na presença de argila de caulim de 50 g/L. CHL um valores são calculados usando a fórmula na etapa 4.4. Nota que as amostras de t6 e t7 estão faltando. Este é um exemplo de não manter um intervalo de amostra consistente conforme o protocolo de amostragem celular. Dados para o padrão são retirados Playter, et al. (2017) 2.
| Tempo da amostra (min) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL um (mg/mL) |
| -1 | 0,384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1.739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0,104 | 0.089 | 0,934 |
| 30 | 0.126 | 0,169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0,115 | 0,048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0,012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0.005 | 0.136 |
Tabela 6: OD 665 e OD 652 medições para Synechocystis na presença de argila de caulim de 50 g/L. CHL um valores são calculados usando a fórmula fornecida na etapa de 4.4.
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Discussion
Floculação, catalisada por interação célula-argila cianobactérias atraiu muito interesse nos campos da ecologia e engenharia2,3,4,5,6,7 ,8,9,10,11,12, no entanto, a investigação dessas interações com a intenção de modelar a deposição de sedimentar depósitos (como shales) é relativamente novo. A visualização deste processo, neste caso para aplicações sedimentológico, não foi relatada. Nos últimos estudos de floculação, essas interações têm sido investigadas pela mistura de argila e cianobactérias em tubos de ensaio, frascos ou copos e amostragem em tempo discreto intervalos9,11,12, 26 , para determinar as mudanças na concentração de células através do tempo. Estes estudos têm medida a concentração de células de cianobactérias em maneiras diferentes. Por exemplo, as populações de células de cianobactérias amostrados foram medidas pela contagem usando um microscópio9,11,12,26. Quando comparado com a concentração inicial de células, a eficiência de remoção pode ser calculado9,11,12,26. Em um estudo separado, após permitir a mistura de argila/célula a um acordo, o fluido permanece acima do sedimento celular/argila resolvido foi amostrado e analisado por fluorescência estimar o número de células remanescentes em suspensão3. Medições de Chl um diretamente de amostras de coluna de água também tem sido usadas para calcular a célula concentração8,10.
Em contraste, nossa metodologia mede as células em suspensão ao longo do tempo, construindo a metodologia Sengco, et al 4 por tirar as medidas às vezes selecionados durante todo o processo e estes intervalos de tempo com imagens de vídeo em tempo real de emparelhamento. Quando comparado com outros protocolos experimentais envolvendo a sedimentação de argila na presença de floculantes aniônicos, usando biológico (algas ou cianobactérias) ou não-biológicos (agentes floculantes sintéticos) floculantes, nossa análise difere em muitas conta. Em primeiro lugar, o nosso estudo envolve o uso de uma espécie marinha cocoides de cianobactérias, enquanto muitos outros estudos envolvem espécies de água doce ou que produzem substâncias de polissacarídeo extracelular a5,23,24 , 25. Além disso, nosso estudo envolve o uso de um tanque padrão, dentro do qual a solução permanece estática. Isto contrasta com os estudos realizados utilizando tubos de ensaio ou cilindros3,12,14 ou calha tanques, onde o fluxo de fluido é uma variável de interesse6,7. A natureza estática do nosso método experimental permite a medição das taxas de sedimentação de linha de base, onde floccules não são mantidas em suspensão pelo fluxo turbulento. Além disso, usar um tanque em vez de um tubo de ensaio, jarra ou copo, permite a melhor visualização dos depósitos resultantes por causa dos lados do tanque plana; as imagens de vídeo não mostram nenhuma distorção devido a curvar-se e a luz se dispersa uniformemente. Em terceiro lugar, a metodologia descrita neste documento medidas taxas de floculação, sobre o curto (intervalos de 2 min) e a longo prazo de (intervalos de horas); Além disso, as imagens podem ser compiladas em escalas de segundos a minutos, permitindo a visualização do processo tanto como uma medida adicional da taxa de sedimentação. A maioria dos estudos medida floculação taxas mais metade de hora completa intervalos5,6,23,25 , ou simplesmente medida o número final de células à esquerda em suspensão após uma única vez ponto (2 – 2,5 h)9,24, embora alguns estudos9 ter medido mudanças na célula ou Chl uma concentração durante 2 minutos intervalos. O intervalo de amostragem escolhido é fundamental, como a floculação pode ocorrer rapidamente (dentro de 5-10 min)22. Finalmente, uma grande força de nossa metodologia é a que produz imagens em tempo real do processo de floculação, não meramente dos agregados produzidos (ex., Avnimelech et al., 1982)24. Ter duas linhas de dados, a concentração de célula de amostragem e visual provas, reforça a confiabilidade dos resultados e suporta conclusões robustas.
Embora apropriado para medir taxas de floculação da argila e cianobactérias, nosso protocolo requer diligência em relação ao local de amostragem dentro do tanque. A mesma área do tanque (x, y, z) deve ser amostrada de cada vez ou os resultados da amostra podem tornar-se distorcida. Também deve ter cuidado para permitir que todas as partículas resolver antes de OD as medições são feitas. Passos críticos incluem: i) usando um intervalo de amostragem adequado que permanece consistente para todos os experimentos e ii) garantindo que o sedimento argila/cianobactérias é suficientemente quebrado após a adição de metanol para garantir a adequada extração de clorofila das células.
A técnica descrita aqui é também limitada a modelagem floculação em condições totalmente oxigenadas. O aparato experimental e procedimento precisa ser modificado para um modelo de uma coluna de água estratificada com águas de fundo anóxica.
Dentro do contexto sedimentológico, esse método tem o potencial para ser aplicado a depósitos de modelização de proporções diferentes de argila ou materiais biológicos para compreender os aspectos tais como as alterações em matéria orgânica e salinidade de entrada ribeirinha. Além disso, os sedimentos produzidos usando este método podem ser usados para investigar o impacto da tempestade potencial reformulação em floc-coerência de remixing ou agitação. Emparelhando a medida direta da concentração de células de cianobactérias com imagens visuais, este protocolo transcende as tradicionais aplicações de processos de floculação de cianobactérias/argila e permite a estes processos a ser aplicado ao sedimentológico modelagem do registro rocha.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão financiamento de ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho do Canadá (05448, 165831 e 213411).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
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