Summary
Etkileşim ve sedimantasyon kil ve doğal ortamlarında gözlenen deniz bölge içindeki bakteri hücreleri en iyi kontrollü laboratuar ortamında soruşturma olmaktır. Burada, kil ve siyanobakteriyel flakon sedimantasyon oranı ölçmek için bir roman yöntemi özetlendiği ayrıntılı bir protokol açıklayın.
Abstract
İyi ayarlanmış birikimi destek mekanizmaları, hala büyük ölçüde zengin organik çökeller tartışma konusu. Özellikle, kil parçacıkları etkileşim tortul kaydı reaktif, planktonik siyanobakteriyel hücrelere etkisi altında incelenmiştir. Bu etkileşim şeyl depositional modelleri için potansiyel olarak büyük bir katkıda bulunuyor. Bir laboratuvar ayarı içinde bu malzemelerin flokülasyon ve sedimantasyon oranları incelendiğinde ve kontrollü bir ortamda ölçülen. Burada, siyanobakteriyel/kil karışımları sedimantasyon oranı ölçmek için bir protokol ayrıntılı. Bu yöntem iki örnek deney açıklama aracılığıyla gösterilmiştir: ilk kaolin (susuz kaolinite şeklinde) ve Synechococcus sp. PCC 7002 (deniz kok Siyanobakteriler), ve ikinci kaolin ve kullanır Synechocystis sp. PCC 6803 (bir tatlı su kok Siyanobakteriler). Siyanobakteriyel kültürlerin değişen miktarlarda sürekli, gerçek zamanlı video ve fotoğraf kaydı izin vermek için en iyi duruma getirilmiş bir özel olarak tasarlanan tank aparatı içinde kil ile karıştırılır. Örnekleme prosedürleri bir sonrası koleksiyonu protokol hangi siyanobakteriyel hücre süspansiyon kalan konsantrasyon belirlenebilir klorofil bir hassas ölçüm için yanı sıra ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Deneysel çoğaltma yoluyla, bir profil sedimantasyon oranı görüntüleyen inşa edilmiştir.
Introduction
Depositional mekanizmaları anlaması için mevcut çevresel koşulları ve işlemleri kullanarak uzun sedimantoloji bir destek olmuştur. Karadeniz gibi modern depositional analogları devrilmesinden sonra organik zengin, iyi ayarlanmış mevduat anlamak için kullanılan iken, laboratuvar deneyleri şeyl mevduat kökeni ek ışık potansiyeline sahip. Birikim hızı ve orijinal oluşum mekanizması soruşturma siyah şeyller Genesis bir alandır. Geleneksel olarak, bu siyah şeyller burada sedimantasyon hızı, birincil verimlilik ve organik madde solunum hızını tortu1,2 organik madde korunması teşvik ortamlarda oluşan onaylanmadığına karar ,3. Ancak, siyanobakteriyel rolü ve kil flokülasyon büyük ölçüde önemsenmemiş kalmıştır. Bu mekanizma Flokülasyon, gerçekleşmesi için organik zengin, iyi ayarlanmış çökeller hızlı ifade için izin verecek ve düşük oksijen gerekli değil. Bu öncül göz önüne alındığında, bu protokol iki hedefi vardır: 1) siyanobakteriyel/kil flakon sedimantasyon oranı ölçmek ve 2) gerçek zamanlı sedimantasyon sürecinde görselleştirmek. Jeokimyasal analiz, ek olarak bu metodoloji o siyanobakteriyel/kil flokülasyon aslında şeyl oluşumu1için önemli bir mekanizma olabilir göstermek için kullanılmıştır. Ettiğinizden şeyl ifade modelleme için bu yöntem bakteri metabolizması ve nüfus kil giriş olan etkisinin ölçülmesi gerekir nerede biyoloji ve çevre düzeltme gibi diğer disiplinler için geçerli iken.
Siyanobakteriler ve zararlı yosun blooms2,3,4,5,6,7 azaltıcı için kil, çökeltme gözlemlemek için çok sayıda çalışma yapılmıştır , 8 , 9 , 10 , 11 , 1 2. ancak, hücre konsantrasyonu zamanla ölçme yaparken, bu çalışmalar Siyanobakteriler/kil flokülasyon devrilmesinden sonra rock kayıt modelleme için başvurmadım. Bu nedenle, bu çalışmalar sedimentological süreçleri modelleme kritik olabilir görsel bir bileşen eksik. Ayrıca, hücre sayımı çalışmaları çoğunluğu kullanmak (Örneğin, Pan ve ark. 11), hangi-ebilmek var olmak zahmetli. Bizim Yöntem, ölçüm siyanobakteriyel Flokülasyon, son gelişmeler ile klorofil bir (Chl bir) kesikli zaman aralıklarında ölçerek siyanobakteriyel hücre konsantrasyon değişiklikleri belirler. Depositional koşulları anlaması için kullanılan yeni bir yaklaşım CHL görsel veri bir ölçüm eşleşmesidir. Oluşturulan görüntüler de Du ve arkişten sonra sedimantasyon oranı hesaplamak için kullanılabilir. 13. görsel ve sayısal verileri birleşimi sonuçların güvenilirliğini güçlendirir. Ayrıca, ek protokoller de uyması gereken ölü biyokütle ve kil sedimantasyon için izin verilmiştir. Bu sedimentological ortamlar canlı nerede ne zaman önemlidir ve ölü biyokütle Co oluşmuş olabilir. Ölü biyokütle davranış farklılıkları flokülasyon sırasında (örneğin, içinde flokülasyon oranını düşürmek) potansiyel sedimentological etkileri olurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması siyanobakteriyel kültürler
-
Katı ortam kullanarak aşılama kültür hazırlama
- Axenic siyanobakteriyel hücreler Amerikan türü kültür koleksiyonu veya Pasteur kültür koleksiyon alabilirsiniz. Örneğin, tek hücreli, deniz Synechococcus sp. PCC 7002 Pasteur kültür derlemeden elde edildi, o bundan sonra Synechococcusolarak sevk edilecek.
- Sağlam medya (A + sıvı medya14 ve % 1.5 agar15) içeren plakaları synechococcus hücreleri korumak. Bunlar ahiret için aşı kültürler anılacaktır.
- Sürekli ışık 30 – 50 µmol fotonlar m-2 s-1,15,18, sağlanan ile tabak 32 ± 2 ° C, kuluçkaya.
- Tekrarlamak merdiven 1.1-1.3 ve ahiret anılacaktır bir + medya BG-1116 1.1.2. adımda Synechocystis sp. PCC 680316,17gibi tatlı siyanobakteriyel türler ile yerine Synechocystis. Tablo 1 – 4 için A + ve BG-11 medya kompozisyon için bakın.
-
Sıvı kültürleri hazırlanıyor: her tank deney bir 400 mL siyanobakteriyel kültür gerektirir.
- Toplamak bir 250 mL ve iki 1 L ısıya dayanıklı Erlenmeyer flask.
- Her şişesi 4 M hidroklorik asit (HCl) çözüm (30 mL HCl çözeltisi her şişesi için), distile su ile takip ile yıkayın.
Dikkat: hidroklorik asit aşındırıcı ve zehirli. 4 M HCl çözüm kullanırken bir laboratuar önlüğü, gözlük ve aside dayanıklı eldiven giyilir emin olun. Bir laboratuvar lavaboda bu adımı gerçekleştirmeniz ve 4 M HCl çözüm atılması ile ilgili yerel düzenlemelere - 250 mL şişe sıvı ortam (A + veya BG-11) 50 mL ile doldurulması. Bir 1 L şişesi 400 mL sıvı medya (A + veya BG-11) ile ve medya (A + veya BG-11) 600 mL ile diğer 1 L şişeye doldurun.
- Her şişe bir gaz geçirgen köpük stoper ile mühür ve köpük tıpa ve şişe boyun folyo ile kaplayın.
- Etiket ve basınçlı kap şişeler 121 ° C ve 25 dakika süreyle 100 kPa oda sıcaklığında soğumaya şişeler izin verir.
- Laminar akış kukuIeta % 70 alkol ile yüzey sterilize tarafından hazırlayın.
- Bir tel aşılama döngü, Bunsen burner, soğutmalı 50 mL sıvı medya şişeye (Kimden adım 1.2.5) ve aşı Kültür (Kimden adım 1.1) toplamak. Bu öğeleri sterilize akışı mahallede yerleştirin.
- Kısaca Bunsen burner Alevi kullanarak Tel aşılama döngü sterilize ve soğumasını bekleyin.
- Serin döngünün siyanobakteriyel hücreleri toplamak için aşı kültür yüzeyi boyunca sürükleyin.
- Köpük tıpa ve folyo kap 250 mL şişe (köpük tıpa dokunmadan) kaldırmak ve kısa bir süre alev tarafından geçen Erlenmeyer flask kenarında sterilize.
- Yani medya şişeye boyun yakınlarında şişeye eğilme ve balonun hücrelerle kaplı aşılama döngü eklemek. Bir kez döngü medya batık, hücreleri kaldırmak için aşı döngü karıştırın.
- Aşı döngü kaldırmak ve yeniden Bunsen burner alev kullanarak şişeye dudak sterilize.
- Köpük tıpa ve folyo kap Erlenmeyer balonun üzerine (köpük tıpa dokunmadan) değiştirin.
- Kısa bir süre içinde Bunsen burner alev aşılama döngü sterilize.
- (Büyüme odası adlandırılır) bir büyüme odasını hazırlayın nerede sıcaklığı 30 ° C15,18 , korunur ve ışık şiddeti 30 – 50 µmol fotonlar m-2 s-1,15,18 . Nem aktif olarak denetlenmez.
- 50 mL aşısını kültür büyüme odasında muhafaza sıcaklığı 30 ° c ile 150 rpm'de sallayarak kuluçkaya izin Evaporatif kayıp kontrol etmek ve önlemek ajitasyon sırasında kaplı şişeyi ağzına tut.
- 96 h için büyümeye siyanobakteriyel culture(s) izin verir. Başarılı bir kültür parlak yeşil görünür ve 750 bir optik yoğunluk (OD) 0.4-0.6 nm.
- Kültür yeterince büyüdü sonra 50 mL kültür ve 400 mL sıvı ortamda laminar akış hood (Kimden adım 1.2.5) içeren 1 L şişeye koyun. Akış örtünün sterilize aşağıdaki adım 1.2.6 olduğundan emin olun.
- Her iki şişe içinde laminar akış hood için 1.2.10 arasındaki adımları yineleyin.
- 50 mL kültür 400 mL 1 L şişeye medya içine dökün ve Bunsen burner alev kullanarak 1 L matarayı dudak yeniden sterilize.
- Köpük kap, tıpa ve folyo yerine steril bir kabarcıklanma aparatı oluşan bir köpük tıpa, pipet, plastik boru, satır içi filtre takmak ve balonun ağız kapak folyo.
- 30 ° C'de 150 rpm'de 1 L şişe oksijen hava karışımı ile 300 mL/dk çözüm15,18 dolaşır bir hava pompası bağlı bubbler aparatı ile tahrik.
- Culture(s) büyüme odası için 120-168 h 30 ° C'de içinde büyümeye izin. Başarılı bir kültür parlak yeşil görünür ve aşırı doz750 nm 0.4-0.6.
- Kil ile karışık değil bir denetim kültür üretmek için 1.2 arasındaki adımları yineleyin.
- Ölü biyokütle kullanarak deneyler ek bir adım gerektirir. Otoklav 1 L şişeye 121 ° C'de 60 dk için kültür ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
2. deneysel kurmak
- Bir dikdörtgen akrilik tank (20 cm uzunluğunda), 5.1 cm genişlik ve yüksekliği 30 cm floresan ışıkları (dokuz T8 ampuller, en az 2.600 lümen; bankosunun önünde yer Şekil 1) 19.
- Işıklar banka ve tank tank ile parlayan ışık diffüz arasında şeffaf, beyaz plastik örtü koyun. Bu kurulum Sutherland ve ark. uyarlanmıştır 19
- Mark 10 cm yükseklikte akrilik tank baz istasyonundan dikey olarak ölçülür. Tüm ölçümler tüm örnekleme tutarlılığını sağlamak için su sütunu bu yükseklikte yapılmalıdır.
- Bir kamera bir tripod, 1 m her deney kaydetmek için tankın önünde yerleştirin. Bir video kamera görüntüleri video dosyalarından elde edilebilir, ve matematiksel modelleme yazılımı kullanılarak, video dosyalarını yerleşim dinamikleri19modellemek için kullanılabilir olarak önerilir.
- Işık banka, tank ve dış ışık kaynakları (Şekil 1) deneyden kalkan için kamera üzerinde siyah bir bez koyun.
3. flokülasyon Deneysel protokol
- 400 mL Kültür (adım 1.2), büyük dereceli silindir ve bir 1 L şişesi (adım 1.2.5) ilave büyüme ortamının 600 mL toplamak.
- Ek büyüme ortamında (A + veya BG-11) ile 400 mL Kültür (ilk hücre konsantrasyonu 4-6 mg/mL) 1 dereceli silindir kullanarak L son hacim için sulandırmak. Bu çözüm için akrilik tank ekleyin.
- 2 mL microfuge borular etiketleme ve akrilik tank yakınında elverişli bir konuma yerleştirerek hazırlayın. Kil deneme için 50 g ölçü birimi.
- Video kaydetmeye başlamak. Birden çok deneyler söz konusu olduğunda, bir işaret deneme tanımlayıcısı ile geçici olarak kamera önce tutulamaz.
- Bir pipet kullanarak, 1 mL örnek alıp, bir etiketli microfuge tüpü yerleştirin. Bu örnek OD ölçerek ilk siyanobakteriyel hücre sayısını belirlemek için kullanın750 nm değerleri. Tüm örnek doğru sonuçlar sağlamak için nüsha almam.
- Hızlı bir şekilde kil (50 g) 10-15 s için bir karıştırma stick kullanarak güçlü ajitasyon ile tanka dökün.
- Sayacı başlatmak ve Chl belirlenmesi P1000 pipet (örnek zaman0) kullanma için ilk 1 mL örnek al.
- Ek örnekler uygun zaman aralıklarında (Örneğin, 1 dk, 2 dk, 3 dk, 4 dk, 5 dk, 10 dk, 15 dk, 30 dk, 60 dk, 180 dk ve 240 min) alın.
- Deney tamamlandıktan sonra video dosyasını kaydetmek, video kamerayı kapatın ve tüm örnekleri için Chl bir kararlılık (adım 4) işlemek.
- Otoklav kalan kil/siyanobakteriyel çözüm. Uygun yöntemlerle çözüm siyanobakteriyel tür yerel düzenlemelere ve laboratuvar ilkesi, dispose bağlı olarak. Temiz tank sabun ve su ile durulayın o ile distile su ve hava kuru.
- Bir denetim deney ekledi hiçbir kil ile hazırlayın. Örnek aynı zaman noktalarda almam. Bu veriler diğer deneysel verileri yerleşim oranları ile kil, değil doğal yerleşme sonucu flokülasyon nedeniyle Gelişmiş onaylamak için karşılaştırılabilir.
- Ölü biyokütle deneme sırasında kullanılıyorsa, aynı deneysel yordamı kullanın. Ancak, elden çıkarma yordamı çözüm ısıyla gerektirmez.
4. örnek işleme ve değerlendirme
- CHL Owttrim16' dan değiştiren bir yordam kullanarak her hücre örnek bir konsantrasyonu belirlemek. Bir kez toplanan, her örnek için bir microcentrifuge oda sıcaklığında kullanarak 13.000 x g de 3 dk hücrelerden cips.
- P1000 pipet kullanarak aşırı medyayı çıkarın ve 1 mL % 100 metanol (20 ° C) ekleyin. Girdap örnek hücre Pelet resuspend için 1 dakika için tam hızda.
Uyarı: Toksik ve yanıcı metanol. Eldiven ve koruyucu gözlük ve metanol ateşleme kaynaklarından uzak tutun. - Örnekleri Chl birçıkarma kolaylaştırmak 24 h için-20 ° C'de kuluçkaya.
- Kuluçka sonra hücresel enkaz 4.1 içinde açıklandığı gibi cips, süpernatant yeşil bir pipet kullanarak bir küvet aktarmak ve küvet spektrofotometre yerleştirin. Örnek spektrofotometre örnek içinde kalan herhangi bir kil yerleşir ve ölçüm ile müdahale değil emin olmak 1 dk içinde dinlenmek izin verir.
- 665 absorbans ölçerek spectrophotometrically CHL bir konsantrasyonu belirlemek nm ve 652 nm ve OD 750 nm. Chl bir toplama formül Chl bir kullanarak belirlenir 16.29 (bir665 - OD750) - x = 8,54 (bir652 - OD750) x 20. CHL bir konsantrasyon hücre toplama için bir proxy olarak kullanılır. Ayrıca, bir dönüştürme faktörü 7,4 x 1010 hücreler/U, 10 g/L =21 gram siyanobakteriyel bazı türlerin hücre toplama hesaplamak için kullanılabilir.
- Arsa Chl zaman karşı bir değerleri hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clay'e maruz kaldığında, siyanobakteriyel hücre süspansiyon22dışarı götürülür. Bu burada verilen temsilcisi sonuçlarında gösterilmiştir. Kil etkisi siyanobakteriyel örneğin alınma olasılığını belirlemek ve sedimantasyon gözlemlemek için oranları, iki deney sırasında 50 g/L kaolin kil (Tablo 5-6, için Synechococcus ve Synechocystis maruz kaldılar yapılmıştır Şekil 2–3). 1. adımda açıklandığı gibi siyanobakteriyel kültürler yetiştirilmiştir. Daha sonra depoyu (adım 2) ayarladıktan sonra seyreltilmiş Synechococcus kültür tank içine dökülür ve 3. adımda takip kaolin kil ile 50 gr karışık. Bu Synechocystis kültür için tekrarlandı. Tüm örnekleri içinde belgili tanımlık tank aynı konumdan toplanmıştır. Örnekleri işlendi ve ölçümler OD652 ve OD665 hem de hesaplanan Chl bir değeri Synechococcus (Tablo 5) ve Synechocystis (Tablo 6) verilir. Bu sonuçlar grafiksel olarak çizilen çizgi araziler ve siyanobakteriyel/kil karışımları dispersiyon oranı Siyanobakteriler sadece doğal dispersiyon oranı yüksek olup olmadığını belirlemek için standartlar sonuçları karşılaştırıldığında. Bu sonuçlar siyanobakteriyel nüfus süspansiyon kil maruz kalma (Şekil 2–3) 10 dakika içinde dışarı getirildi gösterilmektedir. Deniz Synechococcus daha tatlı su Synechocystis, hipotez ile tutarlı bir daha hızlı sedimantasyon oranı o değerlikli katyonlar (tuzluluk tuzlu su emme hareketini taklit eden büyüme orta yaygın) gösterdi Flokülasyon ve bu nedenle, sedimantasyon1kolaylaştıran köprüleme aracı kil parçacıkları ve bakteri hücreleri arasında hareket.
Not Şekil 3' te, anormal derecede yüksek bazı sonuçları vardır, özellikle veri nokta 2 önemlidir. Bu örnek işlem sırasında hangi adım 4.4 değil yeterince izledi örneğidir ve örnek ölçüm sırasında bulanık oldu. Bu yapay olarak yüksek bir sonuç oluşturur (Şekil 2, veri noktası 2). Saat serisi, videodan çıkarılan Albümdeki örneği Şekil 4Playter ve arkadapte, temin edilmektedir. 22. bu kaolinite (değil kaolin) Playter ve arkiçinde kullanıldı unutmamak gerekir. 22.
Resim 1 : Deneysel kurulum gösteren açıklayıcı diyagramı. Bir video kamera tank cihazları en az 1 m kadar ayarlanır. Tank ile 1 litre sıvı ortamı ve Siyanobakteriler girilir. Işıklar tankı arkadan aydınlatmak ve ışık tarafından yarı saydam bir film dağınık olduğunu. Kurmak bu tüm ışık kaynakları ek ortadan kaldırmak için bir siyah bezle bol dökümlü. Bu rakam Sutherland ve arkdeğiştirildi. 19. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Tablo 1'de verilen OD değerleri üzerinden hesaplanan konsantrasyonları Chl . Bu değerler bir Synechococcus /kaolin karışımı (sarı). Chl Synechococcus sadece (mavi) için bir konsantrasyonları ile karşılaştırma siyanobakteriyel/kil karışımı bir artmış sedimantasyon oranı gösterir. Bu rakam Playter ve ark. değiştirildi 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Chl bir konsantrasyonu hesaplanır tablo 2'de verilen OD değerlerden. Bu değerler Synechocystis /kaolin karışımı (sarı). Chl Synechocystis sadece (mavi) için bir konsantrasyonları ile karşılaştırma siyanobakteriyel/kil karışımı bir artmış sedimantasyon oranı gösterir. Bu rakam Playter ve ark. değiştirildi 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Synechococcustemsilcisi saat ders-kaolinite ifade. Bu anlık görüntüleri kaydedilen video ayrık zaman aralıklarında (1 dk) ayıklanır. Bu rakam Playter ve ark. değiştirildi 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| İçin 1 L |
| 18 g NaCl |
| 0.6 g KCl |
| 1 g NaNO3 |
| 5 g MgSO4 ∙ 7 H2O |
| 1 mL KH2PO4 |
| 7.2 mL CaCl2 |
| 161 μL Na2EDTA |
| 1 mL FeCl3 ∙ 6 H2O |
| 10 mL Tris HCl pH 8.2 |
| 1 mL P1 hisse senedi * metal |
Tablo 1: tarifi için bir + kitle iletişim araçları 14 . P1 metaller hisse senedi kompozisyon için Tablo 2 ' ye bakın. Bu tarifi 1 L medya üretir.
| 1 L P1 metal stok için |
| 34.26 g H3BO3 |
| 4,32 g MnCl2 ∙ H2O |
| 0.315 g ZnCl |
| 0,03 g MoO3 (% 85) |
| 0,003 g CuSO4 ∙ 5 H2O |
| 0.01215 g CoCl2 ∙ 6 H2O |
Tablo 2: A + medya için gerekli stok tarifi P1 için metal.
| İçin 1 L |
| 10 mL NaNO3 |
| 1 mL K2HPO4 |
| 1 mL MgSO47 H2O |
| 1 mL CaCl2 2 H2O |
| 1 mL sitrik asit H2O |
| 1 mL ferrik amonyum sitrat |
| 1 mL DiNaEDTA |
| 1 mL Na2CO3 |
| 1 mL A5 Microelements * |
Tablo 3: BG-11 medya tarifini 16 . A5 Microelements kompozisyon için Tablo 4 ' e bakın. Bu tarifi 1 L medya üretir.
| Hisse senedi çözüm için 1 L |
| 2,86 g H3BO3 |
| 1.81 g MnCl2 4 H2O |
| 0,222 g ZnSO4 7 H2O |
| 0.390 g Na2MoO4 2 H2O |
| 0,079 g CuSO4 5 H2O |
| 0.40 g CoCl2 6 H2O |
Tablo 4: Tarifi A5 Microelement hisse senedi BG-11 medya için gerekli için.
| Örnek süresi (dk) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL bir (mg/mL) |
| -1 | 0.563 | 0.373 | 5.986 |
| 0 | 0.428 | 0,33 | 4.154 |
| 5 | 0.112 | 0.046 | 1.432 |
| 10 | 0.024 | 0.036 | 0.084 |
| 15 | 0,027 | 0,025 | 0.226 |
| 30 | 0,007 | 0,002 | 0.097 |
| 60 | 0 | 0,061 | 0.000 |
| 120 | 0,007 | 0,061 | 0.000 |
| 180 | 0,005 | 0.012 | 0.000 |
| 240 | 0,005 | 0.012 | 0.000 |
Tablo 5: OD 665 ve OD 652 ölçülerini Synechococcus 50 g/L kaolin kil huzurunda. Değerler CHL 4.4 adımda formül kullanılarak hesaplanır. Örnekleri t6 t7 eksik olduğunu unutmayın. Bu tutarlı örnek aralığı hücre örnekleme Protokolü gereğince tutmak değil bir örnektir. Veri standart Playter alınır ve ark. (2017) 2.
| Örnek süresi (dk) | OD 665 nm | OD 652 nm | CHL bir (mg/mL) |
| -1 | 0.384 | 0.345 | 3.309 |
| 0 | 1.863 | 1,739 | 15.497 |
| 5 | 0.64 | 0.528 | 5.916 |
| 10 | 0.217 | 0.216 | 1.690 |
| 15 | 0.104 | 0.089 | 0.934 |
| 30 | 0.126 | 0,169 | 0.609 |
| 60 | 0.424 | 0.402 | 3.474 |
| 90 | 0.115 | 0.048 | 1.463 |
| 120 | 0.016 | 0,007 | 0.201 |
| 180 | 0.012 | 0,004 | 0.161 |
| 240 | 0.011 | 0,005 | 0.136 |
Tablo 6: OD 665 ve OD 652 ölçülerini Synechocystis 50 g/L kaolin kil huzurunda. Değerler CHL 4.4 adımda sağlanan formül kullanılarak hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siyanobakteriyel hücre-kil etkileşim tarafından katalize Flokülasyon, ekoloji ve mühendislik2,3,4,5,6,7 ilgi çok çekti ,8,9,10,11,12, ancak, bu etkileşimler niyetiyle devrilmesinden sonra tortul modelleme incelenmesi mevduat (gibi shales) nispeten yeni. Bu işlem, görselleştirme sedimentological uygulamalar için bu durumda bildirilmemiştir. Son çökeltme çalışmalarda, bu etkileşimler araştırıldı kil ve Siyanobakteriler kavanoz, test tüpleri, veya şişeler ve örnekleme ayrık zaman aralıkları9,11,12karıştırarak, zaman içinde hücre konsantrasyon değişiklikleri belirlemek için 26 . Bu çalışmalar konsantrasyonu siyanobakteriyel hücrelerinin farklı yöntemlerle ölçülen var. Örneğin, örneklenen siyanobakteriyel hücre popülasyonlarının mikroskop9,11,12,26kullanarak sayarak ölçülen. İlk hücre konsantrasyonu karşılaştırıldığında, kaldırma verimliliği hesaplanan9,11,12,26olabilir. Ayrı bir çalışmada, yerleşmeye, kil/hücre karışımı sonra sıvı kapatılan cep/kil tortu kalan örneklenmiş ve floresan süspansiyon3kalan hücreleri tahmin etmek için analiz. Chl bir doğrudan doğruya--dan su sütunu örnekleri ölçümleri de hücre konsantrasyonu8,10hesaplamak için kullanılmaktadır.
Buna ek olarak, metodolojimiz süspansiyon hücrelerinde zaman içinde Sengco, vd. Yöntembilimi'bina ölçer 4 select zamanlarda süreci boyunca ölçümler alarak ve bu zaman aralıkları ile gerçek zamanlı video görüntüleme eşleştirme. Kil anyonik flokülantlar huzurunda yerleşme içeren diğer Deneysel protokol ile karşılaştırıldığında, biyolojik (yosun veya Siyanobakteriler) ya da biyolojik olmayan (sentetik topaklanmış aracıları) flokülantlar, kullanarak bizim analiz birçok farklı sayar. Tatlı su türler veya hücre dışı polisakkarit maddeler5,23,24 üreten türler dahil birçok diğer çalışmaları sırasında ilk olarak, bizim çalışma Siyanobakteriler, deniz kok süsengiller kullanımı içerir , 25. ek olarak, bizim çalışma içinde çözüm statik kalır bir standart depo kullanımını gerektirir. Bu sıvı akış bir değişken faiz6,7nerede test tüpleri veya silindir3,12,14 veya oluklu tankları, kullanarak çalışmalar yapılması karşıttır. Bizim deneysel Yöntem statik doğa flakon süspansiyon türbülanslı akış tarafından tutulduğu değil temel sedimantasyon fiyatlar, ölçüm için sağlar. Ayrıca, bir tüp, kavanoz ya da kabı, yerine bir tank kullanarak sonuç mevduat daha iyi görselleştirme için düz tank taraf nedeniyle sağlar; video resimleri eğme nedeniyle hiç bozulma göster ve ışık eşit dağınık. Üçüncü olarak, metodoloji burada açıklanan önlemler flokülasyon oranları üzerinden kısa (2 dk aralıklarla) ve uzun (saat aralıkları) terimi; Buna ek olarak, görüntüleri görselleştirme sürecinin hem yerleşim oranının ek bir ölçüm sağlar saniye dakika, ölçeklerde derlenebilir. Çoğu çalışmalar ölçü flokülasyon üzerinde yarım saat aralıkları5,6,23,25 oranları veya süspansiyon tek bir süre sonra sadece hücre sola son sayısı ölçü noktası (2 – 2.5 s)9,24, her ne kadar bazı çalışmalar9 ölçülen hücre veya Chl 2 dakika aralığı üzerinde bir konsantrasyon değişiklikleri. Çökeltme (5-10 dk) içinde hızla oluşabilir olarak seçilen örnek aralığı önemlidir22. Son olarak, bir büyük metodolojimiz flokülasyon sürecinin, üretilen toplamları değil, sadece gerçek zamanlı görüntü üreten gücüdür (Örn., Avnimelech ve ark., 1982)24. Veri, hücre konsantrasyonu örnekleme ve görsel kanıt, üzerinden iki satır sahip sonuçları güvenilirliğini güçlendirir ve sağlam sonuç destekler.
Kil ve Siyanobakteriler, bizim iletişim kuralı flokülasyon oranları ölçmek için uygun iken tank içinde örnekleme konumu açısından gerekli özen gerektirir. Tank (x, y, z) aynı bölgede her zaman örnek olmalıdır veya örnek sonuçları çarpık hale. Ayrıca aşırı doz ölçüm yapılmadan önce yerleşmek tüm parçacıklar izin vermek için özen göstermelidir. Kritik adımlar içerir: i) kullanarak tüm deneyler için tutarlı bir uygun örnekleme aralığı ve II) kil/siyanobakteriyel Pelet yeterli çıkarma emin olmak için metanol eklenmesinden sonra yeterince kırık olduğunu kontrol ettikten klorofil hücrelerden.
Burada açıklanan tekniği tamamen oksijenli koşullar altında flokülasyon modelleme için sınırlıdır. Deneysel cihazları ve yordam tabakalı su sütunu anoksik dip suları ile model için değiştirilmesi gerekir.
Sedimentological içeriğinde, bu yöntem farklı kil oranları veya Biyolojik materyallerde modelleme mevduat yönleri gibi organik madde ve tuzluluk gelen ekosisteminin giriş değişiklikleri anlamak için uygulanması potansiyeline sahiptir. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak üretilen çökeller potansiyel fırtına flok-tutarlılık üzerinde remixing veya ajitasyon tarafından elden geçirilmesi etkisini araştırmak için kullanılabilir. Doğrudan görsel görüntülerle siyanobakteriyel hücre konsantrasyonu ölçümü eşleştirme tarafından bu protokolü Siyanobakteriler/kil flokülasyon süreçlerinin geleneksel uygulamalar aşar ve bu işlemler için sedimentological uygulanmasına olanak sağlar rock kaydını modelleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (05448, 165831 ve 213411) fon minnetle kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cyanobacteria (in this study: Synechococcus sp. PCC 7002 and Synechocystis sp. PCC 6803) | Pasteur Culture Collection | PCC 7002 or PCC 6803 | used to inoculate the plates |
| agar | Thermo Scientific | CM0003 | used to fill two petri dishes |
| Petri plates (standard bacteriology, 100 x 15 mm) | Sarstedt | 82.1473.001 | 2 required |
| 1 L heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-125 | 1 required |
| 250 mL heat resistant Erlenmeyer flask | Pyrex | 4980-250 | 1 required |
| Nichrome inoculating loop with handle | Fisher Scientific | 14-956-103 | 1 required |
| tinfoil | Reynolds Wrap Aluminum Foil | 89079-067 | 50 cm required; used to cover foam stopper and neck of erlenmeyer flasks |
| growth media (e.g. A+) | 1050 mL required; produced using composition described in tables 1-4 | ||
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | S95941 | 1 required |
| plastic tubing | Fisher Scientific | S504591 | 1 m required; used to create the bubbling apparatus |
| sponge stopper | Jaece Industries Inc | 14-127-40E | 1 required; hole made in center for pipette; used for constructin the bubbling apparatus |
| acrylic sheet | Home Depot | Optix clear acrylic sheet model # MC-102S | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| clear waterproof silicone adhesive | Home Depot | Loctite clear silicone model # 908570 | 1 required; used to construct acrylic tank (20 x 30 x 5.1 cm) |
| camera or video recorder | Panasonic | HC-V770 HD camcorder | 1 required |
| tripod | Magnus | VT-300 | 1 required |
| black cloth | primomart | EAN 0726670162199; Part number 680254blacknappedfr | 1 required; duvetyne light block-out cloth; approximatly 152 x 213 cm to cover tank experiment |
| heat resistant serological pipet | corning incorporated C708510 | 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus |
| sample vials | Dynalon | S30467 | at least 12 (will vary with time interval chosen) |
| heat resistant glass pipette | Fisher Scientific | Corning Incorporated C708510, 13-671-101G | 1 required; used to create the bubbling apparatus; Polystyrene serological pipet would also work, but should be connected to the tubing and stopper after the rest of the apparatus is autoclaved. |
| microcentrifuge | Eppendorf | 22 62 120-3 | 1 required;Comparable products may be used if capable of centrifuging 1.5 -2 mL microfuge tubes at 13,000 x g |
| vortex machine (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries, Inc | SI-0236 | 1 required |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-500 SDS | at least 12 mL (1mL per sample) required; Caution: Flammable, toxic. Wear gloves and safety glasses. Do not use or store near ignition source. Alternate sources may be used. |
| cuvettes (1.6 mL, polystyrene) | Sarstedt | 67.742 | at least 12 required |
| spectrophotometer | Fisher Scientific | 222-271600 | 1 required; Pharmacia Biotech Novaspec ll could also be used. |
| light bulbs | Home Depot | model # 451807; internet #205477895; store SKU #1001061538 | 6-8 bulbs required to provide light for the tank experiments |
| pipette (Pipetman Classic P1000 | Gilson | F123602 | used to collect samples |
| 37 % Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Caution: Corrosive and toxic. Wear lab coat, safety glasses and acid-resistant gloves while using. Prepared to 4 N before use by dilution into deionized water in a chemical fumehood. |
| Foam stopper (small) | Canlab | T 1385 | |
| Foam stopper (large) | Canlab | T 1387 | Requires some intact stoppers and some with a single hole through the centre |
| 30 °C incubator/growth room with continuous illumination | 1 required | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 30 mL required;Caution: Toxic and flammable. Wear lab coat and safety glasses |
| hydrophobic air filter (Midisart 2000, 0.2 µm) | Sartorius | 17805 | 1 required |
| clay (e.g. kaolin) | Fisher Scientific | MFCD00062311 | at least 50 g required |
| microfuge tubes (2 mL, polypropylene) | Sarstedt | 72.695.500 | Comparable products may be used. At least 12 (will vary with time interval chosen) |
| 1000 µL pipet tips | Sarstedt | 70.762 | 1 required |
References
- Macquaker, H. S., Keller, M. A., Davies, S. J. Algal blooms and "marine snow": mechanisms that enhance preservation of organic carbon in ancient fine-grained sediments. J. Sediment. Res. 80, 934-942 (2010).
- Tyson, R. V. Sedimentation rate, dilution, preservation and total organic carbon: some results of a modeling study. Org. Geochem. 32, 333-339 (2001).
- Piper, D. Z., Calvert, S. E. A marine biogeochemical perspective on black shale deposition. Earth-Sci. Rev. 95, 63-96 (2009).
- Sengco, M. R., Li, A. S., Tugend, K., Kulis, D., Anderson, D. M. Removal of red- and brown-tide cells using clay flocculation I. Laboratory culture experiments with Gymnodiniumbreve and Aureococcus anophagefferens. Mar. Ecol. Prog. Ser. 210, 41-53 (2001).
- Guenther, M., Bozelli, R. Factors influencing algae-clay aggregation. Hydrobiologia. 523, 217-223 (2004).
- Archambault, M. -C., Grant, J., Bricelj, V. M. Removal efficiency of the dinoflagellate Heterocapsa triquetra by phosphatic clay and implications for the mitigation of harmful algal blooms. Mar. Ecol. Prog. Ser. 253, 97-109 (2003).
- Beaulieu, S. E., Sengco, M. R., Anderson, D. M. Using clay to control harmful algal blooms: deposition and resuspension of clay/algal flocs. Harmful Algae. 4, 123-138 (2005).
- de Magalhães, L., Noyma, N., Furtado, L., Mucci, M., van Oosterhout, F., Husza, V., Marinho, M., Lürling, M. Efficacy of coagulants and ballast compounds in removal of cyanobacteria (Microcystis) from water of the tropical lagoon Jacarepaguá (Rio de Janeiro, Brazil). Estuaries and Coasts. 40, 121-133 (2017).
- Li, L., Pan, G. A universal method for flocculating harmful algal blooms in marine and fresh waters using modified sand. Environ. Sci. Tech. 47, 4555-4562 (2013).
- Miranda, M., Noyma, N., Pacheco, F. S., de Magalhães, L., Pinto, E., Santos, S., Soares, M., Huszar, V., Lürling, M., Marinho, M. The efficiency of combined coagulant and ballast to remove harmful cyanobacterial blooms in a tropical shallow system. Harmful Algae. 65, 27-39 (2017).
- Pan, G., Chen, J., Anderson, D. Modified local sands for the mitigation of harmful algal blooms. Harmful Algae. 10, 381-387 (2011).
- Shi, W., Tan, W., Wang, L., Pan, G. Removal of Microcystis aeruginosa using cationic starch modified soils. Water Research. 97, 19-25 (2016).
- Du, J., Pushkarova, R. A., Smart, R. A cryo-SEM study of aggregate and floc structure changes during clay settling and raking processes. Int. J. Miner. Process. 93, 66-72 (2009).
- A+ Medium Recipe, 2017. UTEX Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin. , Available from: http://web.biosci.utexas.edu/utex/Media%20PDF/a%20plus%20medium.pdf (2017).
- Stevens, S. E., Porter, R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 6052-6056 (1980).
- Owttrim, G. W. RNA helicases in cyanobacteria: biochemical and molecular approaches. Methods Enzymol. 511, 385-403 (2012).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111, 1-61 (1979).
- Chamot, D., Owttrim, G. W. Regulation of cold shock-induced RNA helicase gene expression in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 182, 1251-1256 (2000).
- Sutherland, B. R., Barrett, K. J., Gingras, M. K. Clay settling in fresh and salt water. Environ. Fluid Mech. 15, 147-160 (2014).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975, 384-394 (1989).
- Liu, Y. X., Alessi, D. S., Owttrim, G. W., Petrash, D. E., Mloszewska, A. M., Lalonde, S. V., Martinez, R. E., Zhou, Q. X., Konhauser, K. O. Cell surface reactivity of Synechococcus sp. PCC 7002: implications for metal sorption from seawater. Geochim. Cosmochim. Acta. 169, 30-44 (2015).
- Playter, T., Konhauser, K., Owttrim, G., Hodgson, C., Warchola, T., Mloszewska, A. M., Sutherland, B., Bekker, A., Zonneveld, J. -P., Pemberton, S. G., Gingras, M. Microbe-clay interactions as a mechanism for the preservation of organic matter and trace metal biosignatures in black shales. Chem Geol. 459, 75-90 (2017).
- Verspagen, J. M. H., Visser, P. M., Huisman, J. Aggregation with clay causes sedimentation of the buoyant cyanobacteria Microcystis spp. Aquat. Microb. Ecol. 44, 165-174 (2006).
- Avnimelech, Y., Troeger, B. W., Reed, L. W. Mutual flocculation of algae and clay: evidence and implications. Science. 216, 63-65 (1982).
- Chen, L., Men, X., Ma, M., Li, P., Jiao, Q., Lu, S. Polysaccharide release by Aphanothece halophytica inhibits cyanobacteria/clay flocculation. J. Phycol. 46, 417-423 (2010).
- Pan, G., Zhang, M. -M., Chen, H., Zou, H., Yan, H. Removal of cyanobacterial blooms in Taihu Lake using local soils. I. Equilibrium and kinetic screening on the flocculation of Microcystis aeruginosa using commercially available clays and minerals. Environ. Poll. 141, 195-200 (2006).
