يصف لنا بروتوكول للكشف عن المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء استخدام ربط لمستقبلات الفرز، سورتيلين، إلى حلقة لومينال الأولى من البروتين الناقل الجلوكوز، GLUT4، على سبيل مثال.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أن قدرتنا على استكشاف تفاعلات البروتين البروتين هو المفتاح لفهم الاتصالات التنظيمية في الخلية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين في كثير من الحالات يرتبط مع تحديات تجريبية كبيرة. على وجه الخصوص، الفرز مستقبلات تتفاعل مع حمولتها البروتين في التجويف المقصورات الغشاء غالباً بطريقة حساسة للمنظفات، مما يجعل co-إيمونوبريسيبيتيشن من هذه البروتينات غير قابلة للاستخدام. ملزمة من سورتيلين مستقبلات الفرز لنقل الجلوكوز GLUT4 قد تخدم كمثال على ضعف تفاعلات البروتينات الغشاء لومينال. وهنا يصف لنا مقايسة سريعة وبسيطة وغير مكلفة للتحقق من صحة التفاعل بين سورتيلين و GLUT4. لذلك، قمنا بتصميم وتصنيعه كيميائيا الببتيد معلم حركة المقابلة حانمه ملزمة سورتيلين المحتملة في الجزء لومينال من GLUT4. سورتيلين المفتاحية هيستيدينيس ست المعرب عنها في خلايا الثدييات، ومعزولة عن ليساتيس الخلية باستخدام قشور حبات. سورتيلين المعطل تداولها على الخرز كان المحتضنة مع الحل الببتيد في قيم الأس الهيدروجيني مختلفة، وكان تحليل المواد الوتيد بواسطة النشاف الغربية. هذا التحليل يمكن تكييفها بسهولة لدراسة تفاعلات أخرى حساسة للمنظفات البروتين-بروتين.
المقدمة
هو GLUT4 بروتين الناقل جلوكوز التي يعبر عنها غالباً في خلايا العضلات والدهون والهيكل العظمى حيث أنه يتوسط تأثير الأنسولين على إزالة جلوكوز الدم بعد prandial1. يجري بروتين مستقرة جداً، وينظم GLUT4 عند مستوى بوستترانسلاشونال. نظراً لغياب الأنسولين، GLUT4 مستبعد إلى حد كبير من غشاء البلازما (ومن ثم انخفاض نفاذية القاعدية الجلوكوز) وهو مترجم أساسا داخل الخلية في حويصلات تستجيب للأنسولين الصغيرة (إيرفس) وشبكة ترانس-غولجي (TGN) التي من المحتمل أن تمثل حجرة المانحة ايرف. لدى الإدارة الأنسولين، إيرفس الصمامات مع غشاء البلازما وتسليم GLUT4 إلى موقع عمله. وهذا يزيد من نفاذية غشاء البلازما للسكر، حيث أن امتصاص الجلوكوز من الدم في adipocytes والهيكل العظمى....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تناول الببتيد
- تصميم وترتيب الببتيد
- اختر التسلسل المطلوب من الببتيد، وإضافة علامة، مثل حركة حانمه (اقكليسيد) في أما ن-أو ج-نهايته.
- التحقق من قابلية الذوبان المتوقع من الببتيد في الماء، واستخدام http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php آلة حاسبة الذوبان الببتيد. إذا كان منخفضا الذوبان، في محاولة لإضافة علامة أخرى للذوبان في الماء تغيير التوازن المسؤول.
ملاحظة: كنا الببتيد المقابلة للحلقة الأولى لومينال (fll) من GLUT4 المفتاحية حانمه حركة (خط غامق) في المحطة N (حركة-fll-GLUT4): لنابقكفيقسيناتولجرقجبجبسيبجتلتلوا اقكليسيديحتوي على الذوبان المتوقع "جيدة" في المياه . - الببتيد مخصصة مع 75 في المائة على ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أعدت ليساتيس من 3T3 الخلايا L1 ستابلي transfected مع سورتيلين-حركة/صاحب5 ومن وزن 3T3 L1 الخلايا، واستخدامها كعنصر سلبي. كلا ليساتيس المحتضنة مع قشور حبات على درجة الحموضة 6 أو 8 درجة الحموضة وغسلها جيدا. ثم كانت المحتضنة الخرز مع البروتينات المعطل تداولها في حل حركة-fll-Glut4. بعد يغسل حذراً، كانت الوتيد البروتينات التي ترتبط الخرز مع 0.25 م ايميدازول. تعرض عينات، جنبا إلى جنب مع ليساتيس الأصلي، للحزب الديمقراطي الصربي صفحة في تريسيني 10-20% تليها هلام التدرج النشا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
سورتيلين هو مستقبلات بروتين يجند متعدد مصانة تطورية التي تشارك في كل إشارة في غشاء البلازما وفي داخل الخلية فرز الأحداث6،7. ومع ذلك، البحث عن يغاندس في سورتيلين أصيلة (بعضها من البروتينات الغشاء لومينال أو لا يتجزأ) معقد كما يظهر تفاعل سورتيلين مع بعض شركائها الملزم لتكون حساسة للمنظفات. ولذلك، وسيلة سهلة واتباع نهج واسع النطاق لدراسة تفاعلات البروتين البروتين، co-إيمونوبريسيبيتيشن، لا يمكن أن تطبق على سهولة. واستخدمت بعض المجموعات البحثية co-إيمونوبريسيبيتيشن لإ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد المنح البحثية وأيده DK52057 و DK107498 من المعاهد الوطنية للصحة إلى K.V.K. X.P 2T32DK007201 منحة التدريب المؤسسي من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كوكتيل مثبط البروتياز | Sigma | P8849 | للاستخدام في تنقية بروتين علامة الهيستيدين |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1 مل حقنة الأنسولين U-100 | BD | 329652 | 26 جم × 1/2 |
| BCA مجموعة فحص البروتين | بيرس | 23228 | |
| عازلة غسيل | بوسطن بيو بروكوتسز | BP-234 | لتنقية البروتين |
| HisPur Cobalt Resin | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine عينة Buffer | Bio-Rad | 161-0739 | مع SDS ، يجب إضافة bMercaptaethanol |
| Elution ؛ Buffer | Boston BioProducts | BP-236 | لتنقية البروتين الخاص به مع 250 ملي مولار Imidazole |
| Mini-Protean Tris-Tricine جل مسبقة الصب 10-20٪ ؛ | Bio-Rad | 456-3115 | لفصل الببتيد والبروتين الصغير |
| Tris / Tricine / SDS تشغيل العازلة ؛ | Bio-Rad | 161-0744 | |
| نقل العازلة | Boston BioProducts | BP-190 | إضافة 20٪ غشاء الميثانول |
| النيتروسليلوز 0.45 مم | Bio-Rad | 1620115 | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma | A9647 | BSA |
| الأجسام المضادة | الخلايا | 2272 | Rabbit |
| Peptide | Genscipt | تخصيص طلب | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standarts | BioRad | 161-0374 |
المراجع
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pa....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
