我们以分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的第一个腔内环之间的结合为例，介绍了一种利用去垢剂敏感性检测膜蛋白间相互作用的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
研究蛋白质-蛋白质相互作用的能力是理解细胞内调控网络的关键。然而，在许多情况下，检测蛋白质-蛋白质相互作用面临显著的实验挑战。特别是分选受体与其蛋白货物在膜区室腔内的相互作用通常对去垢剂敏感，导致这些蛋白无法通过共免疫沉淀进行检测。分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的结合即为膜蛋白之间微弱腔内相互作用的一个实例。本文中，我们描述了一种快速、简便且经济的检测方法，用于验证sortilin与GLUT4之间的相互作用。为此，我们设计并化学合成了对应于GLUT4腔内区潜在sortilin结合表位的myc标签肽段。将带有六个组氨酸标签的sortilin在哺乳动物细胞中表达，并利用钴珠从细胞裂解液中分离获得。将珠上固定的sortilin与肽段溶液在不同pH条件下孵育，随后通过蛋白质印迹分析洗脱物。该方法可轻松适用于研究其他对去垢剂敏感的蛋白质-蛋白质相互作用。
引言
GLUT4 是一种葡萄糖转运蛋白，主要在脂肪细胞和骨骼肌细胞中表达，在其中介导胰岛素对餐后血糖清除的作用。1作为一种非常稳定的蛋白质，GLUT4在翻译后水平受到调控。在缺乏胰岛素的情况下，GLUT4主要被排除在质膜之外（因此葡萄糖的基础通透性较低），并主要定位于细胞内小的胰岛素响应性囊泡（IRVs）以及反式高尔基网络（TGN），后者很可能是IRV的供体区室。在给予胰岛素后，IRVs与质膜融合，将GLUT4运送至其功能位点，从而增加质膜对葡萄糖的通透性，使葡萄糖从血液进入脂肪细胞和骨骼肌细胞的摄取量升高10至40倍。胰岛素撤除后，GLUT4被内吞至早期内体/分选内体，随后被回收至TGN，在此IRVs重新形成。GLUT4转运途径中的这两个分选步骤， 即 从外周早期内体向核周反式高尔基网络（TGN）的逆向运输，以及在TGN供体膜上胰岛素响应性囊泡（IRVs）的形成，依赖于Vps10p家族成员sortilin的介导。sortilin是一种I型跨膜蛋白和分选受体。根据一种模型，sortilin作为跨膜支架蛋白发挥作用：它在早期内体和TGN腔内结合GLUT4，并在供体膜的胞质侧招募retromer或网格蛋白适配蛋白复合物。 通过 其C末端2,3这有助于将GLUT4分布到囊泡载体中，从而介导GLUT4在细胞内区室间的转位。
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方案
1. 肽的处理
- 多肽的设计与订购
- 选择所需多肽的序列，并在其N端或C端添加标签，例如myc表位（EQKLISEED）。
- 使用多肽溶解度计算器 http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php 预测多肽在水中的溶解度。如果溶解度较低，可尝试添加另一个水溶性标签以改变电荷平衡。
注意：我们使用的多肽对应于GLUT4的第一个腔内环（fll），并在N端带有myc表位（粗体）（Myc-fll-GLUT4）：EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA，该序列预测在水中具有"良好"的溶解度。 - 订购纯度至少为75%的定制多肽，此纯度已足够用于检测，并向供应商索取溶解度测试报告。为防止多肽溶解过程中出现意外问题，应将订购的多肽分装为至少两份独立样品。
注意：Myc-fll-GLUT4被分为两份独立样品订购，其在超纯水中的报告溶解度为≤10 mg/mL。
- 多肽的溶解
注意：超纯水是最佳溶剂。如果多肽似乎不溶于水，请参考 http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html 获取操作说明。- 用超纯水或所选缓冲液配制多肽的1....
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结果
使用稳定转染了Sortilin-myc/His5的3T3 L1细胞以及野生型3T3 L1细胞（作为阴性对照）制备裂解液。将两种裂解液分别在pH 6或pH 8条件下与钴珠孵育，并充分洗涤。随后，将结合有固定化蛋白的珠子与Myc-fll-Glut4溶液孵育。经过仔细洗涤后，用0.25 M咪唑洗脱与珠子结合的蛋白。样品连同原始裂解液一同在10-20% Tricine梯度凝胶中进行SDS-PAGE电泳，随后使用抗Myc抗体进行Western blot检测，以同时检测Sortilin-myc/His（110 kD）和Myc-fll-GLUT4（5 kD）（图1）。
将 Myc-fll-GLUT4（10 ng）加样至凝胶的第一泳道作为参照。由于该肽的纯度仅为 75%，可见存在污染条带（上方条带）。来自野生型（WT）和表达 Sortilin-myc/His 的.......
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讨论
Sortilin 是一种在进化上保守的多配体蛋白受体，参与细胞膜上的信号传导以及细胞内分选过程6,7。然而，寻找 sortilin 的真实配体（其中一些是腔内蛋白或整合膜蛋白）存在困难，因为 sortilin 与其某些结合伙伴的相互作用似乎对去垢剂敏感。因此，研究蛋白-蛋白相互作用的一种简便且广泛应用的方法——共免疫沉淀——难以直接应用。一些研究团队曾使用共免疫沉淀来证明 sortilin 与其潜在配体之间的相互作用8,9。然而，这些实验是在 0.1% Triton 或 0.6% CHAPS 条件下进行的，这引发了对膜蛋白是否被充分溶解的质疑。
其他研究人员通过表面等离子共振技术研究了sortilin与其配体之间的相互作用10,11。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）向 K.V.K. 提供的研究基金 DK52057 和 DK107498 资助。X.P. 由美国国立卫生研究院（NIH）的机构培训基金 2T32DK007201 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8849 | 用于组氨酸标签蛋白的纯化 |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | PBS |
| 1 mL 胰岛素注射器 U-100 | BD | 329652 | 26G x 1/2 |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce | 23228 | |
| 洗涤缓冲液 | Boston BioProducts | BP-234 | 用于组氨酸标签蛋白纯化 |
| HisPur 钴树脂 | Thermo Scientific | 89964 | |
| Tricine 样品缓冲液 | Bio-Rad | 161-0739 | 含 SDS，需添加 β-巯基乙醇 |
| 洗脱 缓冲液 | Boston BioProducts | BP-236 | 用于组氨酸标签蛋白纯化，含 250 mM 咪唑 |
| Mini-Protean Tris-Tricine 预制胶 10-20% | Bio-Rad | 456-3115 | 用于肽段和小分子蛋白的分离 |
| Tris/Tricine/SDS 电泳缓冲液 | Bio-Rad | 161-0744 | |
| 转膜缓冲液 | Boston BioProducts | BP-190 | 添加 20% 甲醇 |
| 硝酸纤维素膜 0.45 mm | Bio-Rad | 1620115 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9647 | BSA |
| 抗 Myc 抗体 | Cell Signaling | 2272 | 兔源 |
| 多肽 | Genscipt | 定制订购 | |
| Precision Plus Protein 双色标准蛋白 | BioRad | 161-0374 |
参考文献
- Bogan, J. S. Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes. Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).
- Kandror, K. V., Pilch, P. F. The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers. Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).
- Pa....
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重印与许可
