Détection de détergent-sensibles aux Interactions entre les protéines membranaires

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole pour la détection de détergent sensible des interactions entre les protéines de la membrane à l’aide de liaison du récepteur tri, SORTILINE, pour la première boucle luminale de la protéine de transport du glucose, GLUT4, à titre d’exemple.

Résumé

Notre capacité d’explorer les interactions protéine-protéine est la clé pour comprendre la réglementation connexions dans la cellule. Cependant, détection d’interactions protéine-protéine dans bien des cas est associée à des défis importants expérimentales. En particulier, les récepteurs tris interagissent avec leur cargaison de protéines dans la lumière des compartiments membranaires souvent de façon sensible à détergent, ce qui rend inutilisable le co-immunoprécipitation de ces protéines. La liaison de la SORTILINE récepteur tri au transporteur du glucose que GLUT4 peut servir d’exemple de luminal de faibles interactions entre les protéines membranaires. Nous décrivons ici un essai rapide, simple et peu coûteux pour valider l’interaction entre SORTILINE et GLUT4. Pour cela, nous avons conçu et synthétisé chimiquement le peptide myc-le tag correspondant à l’épitope SORTILINE liaison potentielle dans la partie luminale de GLUT4. SORTILINE Taggé six histidines a été exprimé dans les cellules de mammifères et isolé de lysats de cellules à l’aide de perles de Cobalt. SORTILINE immobilisé sur les perles est incubée avec la solution de peptide à différentes valeurs de pH, et la substance éluée a été analysée par Western Blot. Ce dosage peut être facilement adapté pour étudier d’autres interactions de protéine-protéine de détergent-sensible.

Introduction

GLUT4 est une protéine de transport du glucose qui est exprimée principalement dans les cellules de graisse et le muscle squelettique où il intervient dans l’effet de l’insuline sur post-prandiale sang glucose dégagement¹. Une protéine très stable, GLUT4 est réglementée au niveau post-traductionnelle. En l’absence d’insuline, GLUT4 est largement exclus de la membrane plasmique (donc faible perméabilité basale pour le glucose) et est localisée principalement à l’intérieur de la cellule en petites vésicules insulino-sensible (IRVs) et le réseau trans-Golgi (TGN) qui est susceptible de représenter le compartiment donneur IRV. Après l’administratio....

Protocole

1. manipulation du Peptide

1. Conception et commande du peptide
   1. Choisir la séquence souhaitée du peptide et ajouter une balise, telle que de l’épitope myc (EQKLISEED) à ses deux N - ou extrémité C-terminale.
   2. Vérifier la solubilité prévue du peptide dans l’eau, à l’aide de peptide solubilité calculatrice http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Si la solubilité est faible, essayez d’ajouter une autre balise hydrosoluble pour modifier l’équilibre des charges.
      NOTE : Nous avons utilisé le peptide correspondant à la première boucle luminale (fll) de GLUT4 taggés l’épitope myc (caractères gras) à l’extrémité N terminale (Myc-fll-GL....

Résultats

Lysats ont été préparés à partir de 3 t 3 L1 cellules transfectées stablement avec SORTILINE-myc/His⁵ et à partir des cellules WT 3 t 3 L1, utilisés comme contrôle négatif. Les deux lysats ont été incubées avec des perles de cobalt à pH 6 ou pH 8 et lavés. Perles avec les protéines immobilisées sont ensuite incubées dans la solution de Myc-fll-Glut4. Après lavages prudents, protéines liées aux talons sont élués avec 0,25 M Imidazole. Les échantillons ont été soumis.......

Discussion

SORTILINE est un récepteur évolutionnaire protéine conservée de multi-ligand qui est impliqué dans les deux la signalisation à la membrane plasmique et intracellulaire tri événements^6,7. Cependant, la recherche de ligands de la SORTILINE authentique (dont certains sont des protéines de la membrane luminale ou intégrale) est compliquée comme l’interaction de la SORTILINE avec certains de ses partenaires de liaison semble être sensible aux détergents. Par conséquen.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma	P8849	pour une utilisation dans la purification de la protéine de marquage histidine
Saline tamponnée au phosphate  ;	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Seringue à insuline U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Kit de dosage des protéines	Pierce	23228
Tampon de lavage	Boston BioProducts	BP-234	Pour la purification des protéines His-tag HisPur
Résine de cobalt	Thermo Scientific	89964
Tampon d’échantillon de tricine	Bio-Rad	161-0739	avec FDS, il faut ajouter du bMercaptaethanol
Elution  ; Tampon	Boston BioProducts	BP-236	pour la purification des protéines His-tag avec 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine gels préfabriqués 10-20 %  ;	Bio-Rad	456-3115	Pour la séparation des peptides et des petites protéines
Tris/Tricine/SDS tampon courant  ;	Bio-Rad	161-0744
Tampon de transfert	Boston BioProducts	BP-190	Ajouter 20 % de méthanol
Membrane nitrocellulosique  ; 0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Sérum bovin Albumine	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc	anticorps Signalisation cellulaire	2272
Peptide	de lapin Genscipt		personnaliser la commande
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374