Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Summary

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Abstract

Nossa capacidade de explorar as interações da proteína-proteína é a chave para a compreensão de conexões regulamentares na célula. No entanto, a detecção de interações da proteína-proteína em muitos casos é associada com desafios significativos experimentais. Em particular, classificação de receptores interagem com sua carga de proteína no lúmen dos compartimentos da membrana muitas vezes de forma sensível detergente, fazendo co-imunoprecipitação destas proteínas inutilizável. Ligação da classificação sortilin do receptor para o transportador de glicose que GLUT4 pode servir como um exemplo de fracos luminal interações entre proteínas de membrana. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, simples e barato para validar a interação entre sortilin e GLUT4. Por isso, nós temos projetado e quimicamente sintetizado o peptídeo myc-tag correspondente para o potencial sortilin-ligação epítopo na parte luminal de GLUT4. Sortilin marcado com seis histidines foi expressa em células de mamíferos e isolada de lisados celulares usando grânulos de cobalto. Sortilin imobilizada em grânulos foi incubado com a solução de peptídeo em valores de pH diferentes, e o material eluted foi analisada pela mancha ocidental. Este ensaio pode ser facilmente adaptado para estudar outras interações da proteína-proteína de detergente sensíveis.

Introduction

GLUT4 é uma proteína de transporte de glicose que se expressa predominantemente nas células do músculo esquelético e gordura onde que medeia o efeito da insulina no sangue pós-prandial glicose autorização¹. Sendo uma proteína muito estável, GLUT4 é regulada em um nível pós-traducional. Na ausência de insulina, GLUT4 é em grande parte excluídos da membrana plasmática (daí baixa permeabilidade basal de glicose) e está localizado principalmente no interior da célula em pequenas vesículas insulin-responsivos (IRVs) e rede trans-Golgi (TGN) que é provável que representam o compartimento do doador IRV. Após a administração de insulina, os IRVs se fundem com a membrana plasmática e entregam GLUT4 para o site do seu funcionamento. Isto aumenta a permeabilidade da membrana plasmática de glicose, assim a absorção de glicose do sangue em adipócitos e miócitos esqueléticos aumenta 10 a 40 vezes. Após a retirada da insulina, GLUT4 é interiorizado em endossomos iniciais/classificação e então obtida para TGN onde os IRVs são re-formados. Ambos classificação passos na via de GLUT4, ou seja, recuperação dos periféricos endossomos iniciais para o perinuclear TGN e a formação dos IRVs sobre o doador TGN membranas são ativadas pelo membro da família Vps10p, sortilin, que representa um tipo I proteína transmembranar e um receptor de classificação. De acordo com um modelo, o sortilin funciona como uma proteína transmembrana andaime: liga GLUT4 no lúmen dos endossomos e TGN e recrutas retromer ou Clatrina adaptadores para o lado citoplasmático da doadora membrana através de seu C-terminal^{2, 3}. isso facilita a distribuição de GLUT4 em operadoras vesiculares que translocar GLUT4 entre compartimentos intracelulares.

A interação da cauda citoplasmática de sortilin com retromer e várias proteínas do adaptador tem sido bem documentada. No entanto, a ligação do sortilin GLUT4 (e vários de seus outros ligantes de proteína) tem sido desafiador para provar. Em particular, as tentativas de co-immunoprecipitate sortilin e GLUT4 não foram bem sucedidas, provavelmente devido à natureza de detergente sensível da interação entre estas duas proteínas. Além disso, como uma proteína de transporte típico, GLUT4 tem 12 domínios transmembranares e 6 loops luminal qualquer combinação de que potencialmente pode representar um sítio de ligação a sortilin. Ao mesmo tempo, um grande corpo de evidências indiretas, tais como localização co substancial na célula, cross-linking com DSP membrana permeável e a interação em dois sistema híbrido de levedura sugerem que sortilin pode ligar a GLUT4. Além disso, usando a última abordagem em uma combinação com a alanina digitalização mutagênese, nós determinamos anteriormente que o domínio de Vps10p de sortilin vincula-se principalmente para o primeiro loop luminal de GLUT4. No entanto, a prova de tal interação em células de mamíferos está desaparecido. Aqui, isolamos o sortilin com sua Tag de células transfectadas 3T3-L1 usando resina de cobalto e demonstrado que ele pode interagir com quimicamente sintetizado peptídeo correspondente ao primeiro loop luminal de GLUT4 no pH 6 e pH 8 que se assemelham a meio ácido na CDDP lúmen e ambiente neutro no lúmen das membranas TGN. Nenhuma ligação de peptídeo foi detectada em experimentos de controle onde o extrato preparado a partir de células transfectadas não foi carregado sobre as mesmas contas.

Protocol

1. manipulação do Peptide

1. Design e ordenação do peptide
   1. Escolha a sequência desejada do peptide e adicionar uma marca, como myc epítopo (EQKLISEED) no seu ou N - ou C-terminal.
   2. Verifica a solubilidade prevista do peptide em água, usando peptídeo solubilidade calculadora http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Se a solubilidade é baixa, tente adicionar outra tag solúvel em água, para alterar o equilíbrio de carga.
      Nota: Usamos o peptídeo correspondente ao primeiro luminal loop (fll) de GLUT4 marcados com o epítopo myc (negrito) no terminal N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA que tem "boa" predita solubilidade em água .
   3. Ordem do peptide personalizado pelo menos 75% pureza, que é suficiente para o ensaio e pede o provedor teste de solubilidade. Separe a ordem em pelo menos duas alíquotas em caso de problemas imprevistos com a dissolução do peptide.
      Nota: O Myc-fll-GLUT4 ordenaram-se em duas alíquotas. Sua solubilidade relatada em água ultrapura é ≤ 10 mg/mL.
2. Dissolução do peptide
   Nota: Água ultrapura é o melhor solvente. Se o peptídeo parece não ser solúvel em água, consulte http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html para obter instruções.
   1. Prepare 100 x solução de trabalho do peptide em água ultrapura ou no buffer de escolha, com a concentração de 100 μg/mL.
   2. Separe a solução em alíquotas de 50-100 µ l e armazená-los a-20 ° C.

2. manipulação de células

1. Cultura celular
   1. Use células de tipo selvagem (WT) como um controle negativo e celulas que expressam a proteína do alvo com seis histidines (HisP).
      Nota: Usamos 3T3 L1 pré adipócitos estàvel transfectados com Sortilin-myc/His⁵.
   2. Crescem as células açúcar elevado médio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% de soro de bovino do bezerro, glutamina (2 mM) e penicilina/estreptomicina (5 μg/mL) a 37 ° C em 10% CO₂.
   3. Sente-se quatro pratos de 10cm de células, dois com HisP transfect e transfect os outros dois com controle do plasmídeo (WT). 48 h após a transfeccao, células devem chegar a confluência de 80-90%.
2. Preparação dos lisados celulares
   1. Preparar o tampão de lise (10 mM Hepes, 30 mM de NaCl, 5% de glicerol, 10 mM imidazol, 0,5% Triton X-100 e protease inibidor cocktail sem EDTA, para o isolamento de proteínas com sua Tag, pH 7,4) e mantê-lo em 4 ° c:
   2. Lavar as células três vezes com 10 mL de 1x tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C.
   3. Coloque os pratos no gelo e adicione 500 µ l de tampão de Lise para cada prato. Os lisados celulares usando um raspador de célula da colheita.
   4. O lisado celular de cada prato em um tubo de diferentes 1,5 mL de lugar. Rotule os tubos como pH6-WT, WT-pH8, HisP-pH6, pH8-HisP.
   5. Passe os lisados celulares através de uma seringa com uma agulha 26G cinco vezes acima e para baixo, para lise completa.
   6. Centrifugue os lisados celulares a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
   7. Transferi os sobrenadantes para novos tubos de forma idêntica rotulados.
   8. Analise a concentração da proteína usando o Kit de ensaio do BCA proteína ou outro kit.
   9. Usando do lysis, equalize a concentração de proteína de todos os quatro lysates.
   10. Separar uma alíquota de pequeno (ca. 20 µ l) de cada lisado e mantê-lo a-20 ° C para possíveis experimentos de controle e/ou resolução de problemas.

3. ligação de proteínas com sua tag aos talões de cobalto HisPur

1. Use o tampão de lavagem disponíveis comercialmente ou preparar um (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM de NaCl, imidazol 20 mM, pH 8) e mantê-lo em 4 ° C.
2. Preparar a lavagem do buffer com pH 6 por risonhas lavagem tampão pH 8 com HCl. Mantenha-a 4 ° C.
3. Agite suavemente o frasco dos grânulos cobalto tornar suspensão homogênea.
4. Dispense a 40 µ l de suspensão de grânulos de cobalto em quatro tubos de 1,5 mL marcados como acima (passo 2.2.4).
5. Adicionar 1 mL de tampão de Lise para cada tubo, centrifugar os tubos a 1000 x g durante 5 s. Aspire o sobrenadante e adicionar 40 μL de tampão de lise de grânulos se estabeleceram.
6. Adicione os lisados celulares para tubos correspondentes.
7. Incube os tubos por 90 min a 4 ° C em rotacao do tubo a 20 rpm.
8. Centrifugar os tubos a 1000 x g por 5 s e recolher o sobrenadante. Manter o sobrenadante a 4 ° C.
9. Adicionar 500 µ l de tampão de lavagem de pH 6 ou pH 8 tubos correspondentes e ressuspender os grânulos suavemente.
10. Centrifugar os tubos a 1000 x g durante 5 s e descartar os sobrenadantes.
11. Repita as etapas de 3.9 e 3.10 por quatro vezes.

4. ligação do Peptide à proteína com sua tag imobilizada em grânulos

1. Solução de trabalho x 100 do peptide (etapa 1.2.1), preparar 1 x soluções de trabalho em pH 6 ou tampão de lavagem do pH 8 (alíquotas de dois 100 µ l de cada um, 1 µ g/mL).
2. Adicione 100 μL de solução de peptídeo x 1 para os grânulos lavados com o pH correspondente.
3. Incube os grânulos por 30 min a 4 ° C em rotacao do tubo a 20 rpm.
4. Centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s, recolher o sobrenadante e mantê-lo a-20 ° C.
5. Repita as etapas de 3.9 e 3.10 por quatro vezes.
   Nota: Para diminuir o possível plano de fundo, as etapas a seguir poderiam substituir etapas 4.4 e 4.5.
6. Tome quatro colunas micro com 30 μm de poros, rotulá-los como na etapa 2.2.4 e coloque as colunas em tubos de colheita.
7. Após a conclusão da etapa 4.3, transfira a mistura de incubação em colunas, permitir que a solução passar pela gravidade. Manter o fluxo através da-20 ° C.
8. Passe de 500 µ l de tampão de lavagem com pH 6 ou pH 8 através de colunas correspondentes pela gravidade. Descarte a fluir.
9. Repita a etapa 4.8 quatro vezes.
10. Após a última lavagem, Centrifugar as colunas a 1.000 x g, durante 15 s.

5. eluição de cobalto missanga

1. Amortecedor da amostra do Tricine uso comercial (200 mM Tris-HCl, 40% de glicerol, 2% SDS, 0,04% azul de Coomassie, pH 6,8) e adicionar β-Mercaptoetanol para a concentração final de 2%.
2. Adicione 40 µ l de tampão de amostra Tricine (com β-Mercaptoetanol) para os grânulos lavados e vórtice a amostra.
3. Aquecer as amostras durante 10 minutos a 100 ° C, vórtice novamente, as amostras e centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s.
   Nota: A fim de reduzir a possível ligação inespecífica na eluição, as etapas a seguir poderiam substituir etapas 5.1-5.3.
4. Adicionar 40 μL de tampão de eluição imidazol (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, imidazol 0,25 M) para a lavada de pérolas, vórtex e incubar os tubos à temperatura ambiente por 20 min.
5. Centrifugar os tubos a 3.000 x g por 30 s, recolher o sobrenadante (eluted amostras) e transferi-lo para novos tubos etiquetados.
6. Adicionar 40 μL de tampão de amostra de Tricine para cada tubo, aquecer as amostras durante 10 minutos a 100 ° C, vórtice e centrifugar os tubos a 1.000 x g, durante 5 s.
   Nota: Se forem usadas colunas micro, adicionar o tampão de eluição para os grânulos lavados, incubar por 20 min e coletar a eluição por centrifugação a 8.000 x g por 2 min.
   Nota: As amostras podem ser mantidas a-20 ° C até electroforese é executada.

6. eletroforese e mancha ocidental

Nota: As amostras estão prontas para a separação por SDS-PAGE e mancha ocidental posterior. Segui o protocolo da electroforese do gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) com as seguintes modificações.

1. Use comercialmente disponível de 10-20% Tricine gradientes géis.
2. Em gel, carrega 20 µ l das amostras eluted e 20 µ l de lisados (etapa 2.2.10). Para resolução de problemas, recomenda-se carregar 20 µ l de material não vinculado (passo 3.8) e 10 ng do peptide; antes do carregamento, adicione uma quantidade igual de tampão de amostra Tricine para estas amostras.
3. Realize a eletroforese em comercial Tris/Tricine/SDS executando o tampão (100 mM Tris, Tricine, de 100 mM e 0,1% SDS, pH 8.3).
4. Transferi o material do gel para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 µm usando buffer de transferência (25 mM Tris base, glicina 192 mM, pH 8,4) suplementado com 20% de metanol.
5. Bloquear a membrana com 3% albumina de soro bovino (BSA) por 1h à temperatura ambiente. Usando marcadores de pre-manchado peso molecular como guias, corte a membrana horizontal, borre a parte superior com um anticorpo contra HisP e borre a parte de baixo com um anticorpo contra o epítopo myc para identificar o peptídeo myc-tag.
   Nota: No nosso caso particular, corte da membrana não é necessária uma vez que ambos HisP e Myc-fll-GLUT4 podem ser detectado com um anticorpo anti-myc.

7. análise dos resultados

1. Quantificar a intensidade de todos os sinais de Western blot utilizando um programa de imagem estação ou ImageJ.
2. Normalize o sinal do peptide myc-marcados contra o sinal do HisP em ambos os valores de pH.

Representative Results

Lisados foram preparados a partir 3T3 L1 células transfectadas estàvel com Sortilin-myc/His⁵ e de células de L1 3T3 WT, usadas como um controle negativo. Ambos os lisados foram incubados com grânulos de cobalto em pH 6 ou pH 8 e cuidadosamente lavados. Grânulos com proteínas imobilizadas em seguida foram incubados na solução de Myc-fll-Glut4. Após cuidadosos lavagens, proteínas vinculadas aos talões foram eluídas com 0,25 M de imidazol. Amostras foram submetidas, juntamente com os lysates originais, para SDS-PAGE em um Tricine de 10-20% gel de gradiente seguido pela mancha ocidental com anticorpo anti-Myc que permitiu a detecção de ambos sortilin-myc/His (110 kD) e Myc-fll-GLUT4 (5 kD) (Figura 1) .

Myc-fll-GLUT4 (10 ng) foi carregado na pista primeira do gel como referência. Como a pureza do peptide é apenas 75%, as contaminações são aparentes (bandas superiores). Original lisados celulares do WT e Sortilin-myc/His expressando células contêm várias bandas reconhecidas pelo anticorpo anti-myc. Material isolado de células expressando Sortilin-myc/His é muito mais limpo. Além de algumas bandas inespecíficas menores, tem apenas dois componentes myc-contendo: Sortilin-myc/His e Myc-fll-GLUT4. Peptídeos contaminantes na faixa da primeira não aparecem ligar Sortilin-myc/his. Controle negativo (eluído WT) tem bandas predominantemente não-específica.

GLUT4 passa por compartimentos intracelulares, tais como endossomos e TGN, que têm diferente pH luminal, queríamos avaliar a interação de GLUT4 com sortilin a pH 6 e pH 8 (Figura 2). Densitometria de resultados (não mostrado) não revelou diferenças significativas na relação entre Myc-fll-GLUT4 e Sortilin-myc/His retidos em grânulos em valores de pH diferentes. Assim, concluímos que o GLUT4 tem a capacidade de interagir com o sortilin em ambos os endossomos e TGN.

Figura 1 . Interação do Sortilin-myc/sua com Myc-fll-GLUT4 em grânulos de cobalto. Lysates preparados a partir de células 3T3-L1 WT e células 3T3-L1 estàvel expressando Sortilin-myc/sua (S) estavam passou por cima de grânulos de cobalto, lavadas, incubadas com Myc-fll-Glut4 em pH 8, lavado novamente e eluída com tampão imidazol. Myc-fll-Glut4 (10 ng) foi carregado na pista primeira como uma referência.

Figura 2 . Sortilin-myc/His interage com Myc-fll-GLUT4 no pH 8 e pH 6. Myc-fll-Glut4 foi incubado com material imobilizada em grânulos a pH 6 e pH 8, lavado e eluída com tampão de amostra de glicina. A figura foi adaptada da Pan X., et al³.

Discussion

Sortilin é um receptor de proteína de ligante multi conservada evolucionária que está envolvido em ambos sinalização na membrana plasmática e no intracelular classificação eventos^6,7. No entanto, a busca por ligantes do sortilin o autêntico (alguns dos quais são proteínas de membrana luminal ou integral) é complicada, como a interação do sortilin com alguns dos seus parceiros de ligação parece ser sensível aos detergentes. Portanto, uma fácil e uma abordagem generalizada para estudar interações da proteína-proteína, co-imunoprecipitação, não pode ser facilmente aplicado. Alguns grupos de pesquisa têm usado co-imunoprecipitação para demonstrar a interação entre sortilin e seu potencial ligantes^8,9. No entanto, esses experimentos foram realizados em 0,1% Triton ou em 0,6% CHAPS, que lança dúvidas na integralidade da solubilização de membrana.

Outros pesquisadores estudaram a interação entre sortilin e seus ligantes por ressonância de plasmon de superfície^10,11. Embora a ressonância de plasmon de superfície é, sem dúvida, a melhor abordagem para o problema, requer equipamento caro e quantidades significativas de proteínas recombinantes puras que é caro e demorado.

Aqui, descrevemos uma técnica que, em combinação com outros métodos, tais como o cross-linking e o sistema de dois híbridos de levedura, sugiro fortemente que sortilin pode ligar a GLUT4. O ensaio é rápido e fácil e pode ser facilmente adaptado para outros tamanhos diferentes de peptídeos e proteínas.

Existem alguns passos críticos neste ensaio. O primeiro deles é a solubilidade do peptide na água. Outra é a seleção do controle adequado. Claramente, uma quantidade significativa de material biológico pode interagir com cobalto grânulos através de seu alcance endógena sequências ou não especìfica. Portanto, é essencial para imobilizar nos lysates de grânulos das células WT e células transfectadas com a proteína de interesse, no nosso caso Sortilin-myc/His. Em um delineamento, material ligado aos talões serão diferentes em apenas uma proteína, Sortilin-myc/His, para que um certo grau de vinculação do plano de fundo do peptide talões de controle pode ser tolerado. Ainda, a vinculação do plano de fundo do peptide aos talões pode ser reduzida, aumentando o rigor das etapas lavagem final. O uso de mini colunas para lavar os grânulos pode diminuir fundo vinculação ainda mais.

Devido à natureza do "percurso GLUT4", queríamos ligação endereço de Myc-fll-GLUT4 para sortilin em valores de pH diferentes. Percebemos que o pH no lúmen de início/classificação endossomos podem cair abaixo de 6. No entanto, pH inferior a 6 interrompe a ligação de proteínas com sua Tag de grânulos de cobalto, que podem ser considerados como uma limitação do método.

Isolamento da proteína alvo em grânulos de cobalto a usar o epítopo é preferível a outras etapas de purificação de afinidade, tais como imunoprecipitação com anticorpos específicos, em termos de rendimento e a ligação não-específica. Ainda assim, é completamente possível esse isolamento da proteína alvo em qualquer outro tipo de resina (de preferência, grânulos magnéticos) com controles adequados provará bem sucedida.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8849	for use in purification of histidine tag protein
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Insulin Syringe U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23228
Wash buffer	Boston BioProducts	BP-234	For His-tag protein purification
HisPur Cobalt Resin	Thermo Scientific	89964
Tricine sample Buffer	Bio-Rad	161-0739	with SDS, bMercaptaethanol should be added
Elution  Buffer	Boston BioProducts	BP-236	For His-tag protein purificationwith 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%	Bio-Rad	456-3115	For seperation of peptide and small protein
Tris/Tricine/SDS running buffer	Bio-Rad	161-0744
Transfer Buffer	Boston BioProducts	BP-190	Add 20% methanol
Nitrocellulose membrane  0.45 mm	Bio-Rad	1620115
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647	BSA
Anti Myc antibody	Cell Signaling	2272	Rabbit
Peptide	Genscipt		customize ordering
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374