Summary
Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.
Abstract
La possibilità di differenziare le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) in epatociti-come le cellule (HLCs) offre nuove opportunità per studiare gli errori innati di metabolismo epatico. Tuttavia, per fornire una piattaforma che supporta l'identificazione di piccole molecole che potenzialmente può essere utilizzato per trattare la malattia del fegato, la procedura richiede un formato di impostazioni cultura che è compatibile con migliaia di composti di screening. Qui, descriviamo un protocollo utilizzando condizioni di cultura completamente definita, che consentono la differenziazione riproducibile delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Forniamo anche un esempio di utilizzo della piattaforma ai composti di schermo per la loro capacità di abbassare l'apolipoproteina B (APOB) prodotta dagli epatociti iPSC-derivato generati da un paziente di ipercolesterolemia familiare. La disponibilità di una piattaforma che è compatibile con la scoperta della droga dovrebbe consentire ai ricercatori di identificare approcci terapeutici per le malattie che colpiscono il fegato.
Introduction
Successo nell'identificazione di farmaci che possono essere utilizzati per indirizzare una malattia rara si basa sullo sviluppo di analisi che può essere utilizzato per lo screening. Ipotesi o schermi basati su destinazione (inversa farmacologia) sono utili, ma richiedono una dettagliata comprensione delle basi molecolari della malattia. Fenotipici schermi (farmacologia classica) evitano la necessità di una comprensione dettagliata delle vie biochimiche, ma invece si basano sullo sviluppo di modelli che rispecchiano esattamente la patofisiologia della malattia. Nonostante l'entusiasmo per gli approcci basati su target, analisi delle droghe first-in-class approvato dalla FDA rivelano che schermi fenotipici sono state molto più successo1. L'obiettivo generale di questo metodo è di stabilire una piattaforma per high throughput screening che può essere utilizzato per identificare piccole molecole per il trattamento della malattia epatica metabolica. Diversi modelli in vitro sono stati descritti compreso epatociti primari, cellule del tumore epatico e di cellule progenitrici del fegato2. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli hanno dei limiti, e c'è bisogno di nuovi modelli che possono ricapitolare con precisione la patofisiologia delle carenze metaboliche del fegato nella cultura. Recentemente, le cellule staminali pluripotenti umane combinate con gene editing hanno offerto l'opportunità di modellare anche il più raro di malattie rare in cultura senza la necessità di accesso pazienti direttamente3. Mentre l'uso di paziente-specific iPSCs come uno strumento per scoprire piccole molecole per il trattamento delle malattie del fegato è concettualmente ragionevole, ci sono soltanto alcuni rapporti che dimostrano la fattibilità di questo approccio4. Tuttavia, recentemente abbiamo stabilito una piattaforma che utilizzato epatociti iPSC-derivati per identificare con successo farmaci che possono essere riproposto per il trattamento delle carenze nel metabolismo del fegato5.
Questo protocollo viene illustrato il processo di differenziazione umana iPSCs dell'epatocita-come le cellule in piastre da 96 pozzetti e il loro utilizzo per lo screening di una libreria di piccole molecole. Viene inoltre descritto l'analisi dell'endpoint utilizzando ipercolesterolemia come un esempio di malattia epatica metabolica. Questo approccio dovrebbe essere utile per studiare il ruolo e l'applicazione di piccole molecole nel contesto della malattia infettiva del fegato, malattia epatica metabolica, tossicità dei farmaci e altri disturbi del fegato.
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Protocol
1. la cultura dell'essere umano ha indotto le cellule staminali pluripotenti indotte
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Rivestimento di altre matrici adatti a coltura hPSC o ricombinante umano proteina di fusione di E-caderina Fc (E-cad-Fc) 6
- Diluire E-cad-Fc a 15 μg/mL con soluzione fisiologica Phosphate-Buffered di Dulbecco contenente calcio e magnesio (DPBS (+)).
- Cappotto piatti di coltura del tessuto di sospensione 100 mm con 5 mL di diluito E-cad-Fc e incubare a 37 ° c per almeno 1 h. substrato di rimuovere e sostituire con 5 mL di terreno (ad es., mTeSR1 di cui d'ora in poi come M-medium)7.
Nota: Il terreno di coltura utilizzato in questo protocollo è preparato seguendo protocolli pubblicati7. Tuttavia, parecchie altre preparazioni di media sono state descritte, o sono disponibili in commercio, che sono probabilmente compatibile con la procedura. - Recuperare una fiala di iPSCs crioconservati da azoto liquido. Scongelare a 37 ˚ c, fino a quando rimane un cristallo di ghiaccio. Pipettare delicatamente le cellule in una provetta conica sterile di 15 mL contenente 4 mL di M-terreno.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. eliminare il surnatante e Risospendere delicatamente cellule con 5 mL di terreno completato con 10 µM di Y-27632, un inibitore selettivo della chinasi di proteina Rho-collegata, arrotolato-arrotola contenente (ROCK).
- Togliere la soluzione di M dal punto 1.1.2 e trasferire 5 mL di cellule da passo 1.1.4 a piatti di coltura del tessuto E-cad-Fc-coated 100 mm sospensione.
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Mantenere iPSCs umane nella cultura
- Una volta iPSCs raggiungere intorno 80% confluency, rimuovere il terreno di coltura e lavare una volta con calcio e magnesio libero DPBS (-). Aspirare il DPBS (-) e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di EDTA 0.02% per coprire le piastre, quindi incubare fino a 3 min a temperatura ambiente.
Nota: Confluenza di 80%, il piatto dovrebbe contenere circa 2 x 107 celle. È importante di non invadere le cellule e per garantire che le cellule conservano una morfologia indifferenziata. La pluripotenza delle cellule può essere determinato mediante colorazione con indicatore delle cellule staminali Tra-1-60 o equivalente8. - Non appena le cellule cominciano a rilasciare, rimuovere la soluzione di EDTA 0.02% e inondare il piatto con 10 mL di M-medio e rilasciare le cellule. Facilitare il distacco delle iPSCs pipettando delicatamente.
Nota: Il tempo medio di incubazione per le cellule staccare è circa 3 min, ma questo deve essere determinato empiricamente per ciascuna riga di iPSC. Le cellule devono essere rilasciate come piccoli cluster contenente circa 5-10 iPSCs per ogni cluster. - Trasferire 1/10 delle cellule sospese per fresco piatto di coltura del tessuto sospensione di rivestite con 100 mm di E-cad-Fc contenente 5 mL di M-medio. Incubare le colture a 37 ˚ c sotto il 4% O25% CO2 e cambio medio giornaliero.
Nota: Anche se iPSCs ordinariamente sono coltivate in condizioni fisiologiche di ossigeno per promuovere la pluripotenza, iPSCs possono anche essere coltivate utilizzando ossigeno ambientale.
- Una volta iPSCs raggiungere intorno 80% confluency, rimuovere il terreno di coltura e lavare una volta con calcio e magnesio libero DPBS (-). Aspirare il DPBS (-) e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di EDTA 0.02% per coprire le piastre, quindi incubare fino a 3 min a temperatura ambiente.
2. differenziazione delle iPSCs umane per Hepatocyte-come le cellule in piastre da 96 pozzetti
Nota: Questa sezione descrive la differenziazione delle iPSCs in un formato che è compatibile con lo screening. Utilizzando questo approccio, è possibile indurre iPSCs umane per differenziare e formare degli epatociti-come le cellule in 20 giorni. Mentre questo è adatto per la maggior parte dei saggi, la lunghezza della cultura può essere estesa per migliorare la maturazione delle cellule.
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Rivestimento piastre di coltura del tessuto 96 pozzetti con matrice della membrana basale ridotto fattore di crescita
- Preparare il brodo diluendo la matrice a 2 mg/mL con mezzo di coltura tissulare DMEM/F12 sterile ghiacciata. Dividere la matrice in 250 aliquote del μL e conservare a-80 ˚ fino a quando richiesto. Chill 10ml di DMEM/F12 su ghiaccio per 30 min. recuperare un 250 μL aliquotare di 2 mg/mL di brodo di matrice e disgelo sul ghiaccio.
- Combinare la matrice con 10 mL di DMEM/F12 freddo mescolando delicatamente con una pipetta pre-refrigerata per ottenere la concentrazione finale di 0,05 mg/mL.
- Trasferire 100 μL di matrice diluito in ciascun pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per almeno 1 h. scartare la matrice e sostituire con 50 μL di M-medium per pozzetto. Conservare a 37 ° C, 4% O25% CO2 fino a quando necessario.
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Cellule di piastra per differenziazione
- Fino a quando le cellule si avvicinano 80% confluenza della coltura iPSCs sulle piastre di 100 mm. Assicurarsi che la piastra contiene circa 2 x 107 cellule. Determinare i numeri di cellulare di citometro a flusso delle cellule o un emocitometro.
Nota: Con esperienza, la qualità delle cellule iPSCs può essere giudicata da microscopia; Tuttavia, quasi il 98% delle cellule dovrebbe esprimere marcatori di pluripotenza come l'epitopo di TRA-1-60 quando misurati mediante FACS o immunostaining. È importante che le cellule rimangono attivamente divisione e non sono invasi. - Per raccogliere le iPSCs da ogni 100 mm di spessore, aspirare il terreno di coltura e sciacquare con 5 mL di DPBS (-). Sostituire il risciacquo con 3 mL di soluzione di distacco delle cellule (per esempio, accutase) e incubare per circa 2 min a 37 ° C,24% O 5% CO2.
Nota: È importante seguire il distacco delle cellule da microscopia. Non eccessivamente digest con accutase. L'obiettivo è quello di rilasciare le cellule come piccoli grappoli con trattamento minimo. - Non appena le cellule iniziano a staccare, raccolto con l'aggiunta di 7 mL di M-terreno. Pipettare diverse volte per dissociare le colonie di cellule in piccoli grappoli di intorno 3-6 celle (Figura 1A).
- Raccogliere le iPSCs in una provetta sterile di 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5ml M-medio.
- Distribuire uniformemente le cellule in piastre da 96 pozzetti rivestite con matrice di pipettaggio 50 μL di cellule in sospensione in ciascun pozzetto. Per impostare ogni piastra a 96 pozzetti, utilizzare una piastra di 100 mm di iPSCs con celle al circa 80% confluency, che contiene circa 5 x 106 cellule per la differenziazione di installazione. Utilizzare una pipetta multicanale per accelerare questo processo. Coltura le cellule durante la notte a 37 ° c, 4% O25% CO2.
Nota: È importante che un numero uguale di cellule è depositato in ogni pozzetto per garantire differenziazioni riproducibile.
- Fino a quando le cellule si avvicinano 80% confluenza della coltura iPSCs sulle piastre di 100 mm. Assicurarsi che la piastra contiene circa 2 x 107 cellule. Determinare i numeri di cellulare di citometro a flusso delle cellule o un emocitometro.
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Indurre la differenziazione delle cellule
- Esaminare le piastre da 96 pozzetti da microscopia per garantire che le cellule coprono almeno il 70% della superficie di ogni singolo bene. Se la copertura è inferiore al 70%, sostituire il mezzo con mezzo fresco e incubare per altre 24 h a 37 ˚ c,24% O 5% CO2.
Nota: Incubando le cellule per più di 48 h dopo il placcaggio senza indurre differenziazione comunemente riduce l'efficienza della differenziazione. La differenziazione si verifica anche utilizzando ossigeno ambientale, anche se l'efficienza può essere interessato. - Per 1 giorno per giorno 2 di differenziazione, sostituire il terreno di coltura con RPMI supplementato con 2% B27 (senza insulina), 20 ng/mL FGF2 activina A 100 ng/mL e 10 ng/mL BMP4. Aggiungere 100 μL di mezzo ogni pozzetto e incubare a 37 ° c, in ambiente O25% CO2 con un cambio medio giornaliero per 2 giorni.
Nota: Trattare con un numero elevato di piastre da 96 pozzetti richiedono l'uso di una pipetta assistita o robot. 12 canali e 96 pipette sono ideali per il cambio medio giornaliero. - Per giorno 3 al giorno 5 di differenziazione, Sostituisci il terreno di coltura con RPMI completato con 2% B27 (senza insulina) e 100 ng/mL Activin A. Culture cellule a 37 ˚ c, in ambiente O25% CO2 con cambio giornaliero medio per 3 giorni.
- Giorno di differenziazione 5, prima di sostituire con terreno di coltura fresco, delizia ogni bene con 100 μL 0,02% di soluzione di EDTA per 30 s, quindi rimuovere e sostituire con terreno di coltura fresco.
Nota: Se la differenziazione di endoderma è efficiente, il monostrato di differenziazione delle cellule è incline al peeling dalla piastra. Un breve trattamento con una soluzione di EDTA 0.02% aiuta ad alleviare distacco cellulare. Questo trattamento non influenza la differenziazione di epatociti. - Per la differenziazione tra 6 giorni a 10, sostituire il terreno di coltura con RPMI / 2% B27 (con insulina) completati con 20 ng/mL BMP4 e 10 ng/mL FGF2 e incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per 5 giorni con cambio medio giornaliero. Questa fase induce le cellule a differenziarsi in cellule progenitrici epatiche.
- Per la differenziazione tra 11 giorni al 15, sostituire il terreno di coltura con RPMI / 2% B27 (con insulina) completati con 20 ng/mL HGF. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per 5 giorni con cambio medio giornaliero.
- Per la differenziazione tra i giorni 16 a 20, è necessario sostituire il terreno di coltura con un mezzo di coltura cellulare dell'epatocita (HCM) completato con 20 ng/mL di Oncostatin M (OSM). Incubare le cellule a 37 ˚ c, in ambiente O25% CO2 con cambio medio giornaliero per 5 giorni.
Nota: La riproducibilità della differenziazione tra singoli pozzetti in modo efficiente può essere determinata misurando il livello relativo di albumina, AFP o APOB secernuta nel mezzo di ELISA (Vedi 3.2).
- Esaminare le piastre da 96 pozzetti da microscopia per garantire che le cellule coprono almeno il 70% della superficie di ogni singolo bene. Se la copertura è inferiore al 70%, sostituire il mezzo con mezzo fresco e incubare per altre 24 h a 37 ˚ c,24% O 5% CO2.
3. piccola molecola Screening
Nota: Quanto segue descrive la procedura utilizzata per identificare i composti che possono essere utilizzati per abbassare il livello di APOB nel mezzo dell'epatocita-come delle cellule derivate da ipercolesterolemia familiare iPSCs. Una descrizione del modello e suo uso nell'identificazione di farmaci ipocolesterolemizzanti è stata descritta in dettaglio in precedenza5,9. Nell'esempio corrente, sono stati proiettati 1.000 composti dalla libreria Collection Compound South Carolina (SC3). Ogni composto è stato testato ad una concentrazione di 2 μg/mL.
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Trattamento di iPSC - derivati epatociti con piccole molecole
- Diluire la libreria principale composta per generare piastre delle scorte di lavoro con composti ad una concentrazione di 20 μg/mL in 2% DMSO e conservare a-20 ˚ c.
- Preparare abbastanza piastre da 96 pozzetti degli epatociti iPSC-derivati per consentire ogni composto da testare.
Nota: Il numero di composti che saranno proiettati a dettare il numero di piastre da 96 pozzetti necessari. In generale, un singolo dovrebbe essere ben preparato per ogni composto, oltre a ulteriori pozzi per eventuali campioni di controllo. Ultraperiferiche pozzetti della piastra sono comunemente evitati per ridurre la possibilità di effetti di bordo che può corrompere l'interpretazione. Risultati di ricerca trovati possono essere identificati utilizzando il metodo di punteggio z senza la necessità di utilizzare la replica. Se replica è inclusi, è più opportuno utilizzare il test t. - Al completamento di differenziazione (Vedi 20, giorno 2.3.7), sostituire il terreno di coltura con 100 μL di HCM frescoaddizionata di 20 ng/mL di Oncostatin M. Incubare a 37 ° c, 4% O25% CO2 per esattamente 24 h. recuperare il terreno di coltura in un fresco piastra a 96 pozzetti e conservare a-20 ˚ c. Utilizzare questo esempio per calcolare il livello di APOB nel medium prima dell'aggiunta di droga.
- Aggiungere 90 μL di fresco HCM addizionata di 20 ng/mL di Oncostatin M in ciascun pozzetto. Aggiungere 10 μL di ogni composto dallo stock di lavoro dopo la miscelazione di pipettaggio. Aggiungere DMSO allo 0,2% per il controllo pozzi per abbinare la concentrazione finale nei campioni trattati e incubare a 37 ° c, ambiente O25% CO2 per esattamente 24 h. il terreno di coltura di raccogliere e conservare a-20 ˚ c. Utilizzare questo esempio per determinare il livello di APOB dopo trattamento con composti.
- Opzionale - le cellule restanti possono essere elaborate per immunostaining, attuabilità delle cellule o le analisi dei livelli di mRNA usando approcci standard.
Nota: Questo schermo è stato progettato per identificare farmaci che ha avuto un rapido effetto sui livelli di APOB. Tuttavia, a seconda del modello di malattia, le analisi a valle o meccanismo di azione della droga, può essere utile per il trattamento del campione per più giorni.
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Determinare i livelli di APOB da ELISA
- Determinare la concentrazione di apolipoproteina B (APOB) da entrambi i pre- e post-droga campioni trattati usando un kit di sviluppo di APOB ELISA umano seguendo protocolli del produttore.
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Preparare le seguenti soluzioni
- Tampone di lavaggio, composto di 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7,4. Conservare a 4 ° c fino all'utilizzo.
- Tampone di incubazione, è composto da 0.05% Tween 20 e 0,1% albumina di siero bovino (BSA) in PBS, pH 7,4. Conservare a 4 ° c fino all'utilizzo.
- Preparare l'anticorpo APOB (mAB 20/17) diluendo a 2 µ g/mL in PBS, pH 7,4. Aggiungere 100 μL di anticorpo diluito per pozzetto e incubare a 4 ˚ c durante la notte.
- Rimuovere l'anticorpo delle placche di dosaggio e lavare ogni ben due volte con 200 μL di PBS, pH 7,4.
- Aggiungere 200 µ l/pozzetto di 0.05% Tween 20, 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS, pH 7.4 e incubare su una piattaforma d'agitazione per 1 h a temperatura ambiente.
- Preparare una curva standard di 8 punti usando 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7.4 con le seguenti concentrazioni di APOB: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL e 50 ng/mL.
- Diluire i campioni di prova 1:4 con 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7.4.
- Dopo 1 h di blocco con tampone di incubazione, scartare il buffer e lavare le piastre di dosaggio cinque volte con 200 μL di 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7,4.
- Rimuovere qualsiasi buffer di lavaggio residua completamente e trasferire 90 µ l dei campioni diluiti e gli standard APOB per le piastre di dosaggio. Incubare a temperatura ambiente in un agitatore per 1 h.
- Scartare il campione e lavare con 200 μL 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4 per pozzetto. Ripetere i lavaggi per un totale di 5 volte. Aggiungere 100 μL per pozzetto di mAB LDL 11-biotina 1:1,000 diluito in 0.05% Tween 20 e 0.1% BSA in PBS, pH 7,4. Incubare a temperatura ambiente su una piattaforma d'agitazione per 1 h.
- Gettare il reagente e lavare con 200 µ l per bene il tampone di lavaggio 5 volte. Aggiungere 100 μL per pozzetto di anticorpo streptavidina-HRP (1:1, 000 diluizione mediante tampone di incubazione), poi incubare a temperatura ambiente su una piattaforma d'agitazione per 1 h.
- Gettare il reagente e lavare con 200 μL 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.4 per pozzetto. Ripetere i lavaggi per un totale di 5 volte. Completamente rimuovere il tampone di lavaggio residua delle placche di dosaggio e aggiungere 100 μL per pozzetto di tetrametilbenzidina (TMB) e incubare a temperatura ambiente per 8 min.
- Senza rimuovere il substrato TMB, direttamente aggiungere 100 μL per pozzetto di soluzione di arresto (HCl 1N).
- Determinare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di piastra.
- Una curva standard può essere stabilita, utilizzando il metodo di quattro parametri di regressione logistica, poi utilizzato per definire la concentrazione di APOB in ogni esempio10.
- Esaminare il pre-droga: post-droga rapporto di APOB in ogni campione per identificare i composti con il potenziale per abbassare APOB livelli nel mezzo.
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Representative Results
Generazione degli epatociti - come cellule: Figura 1 descrive l'intervallo di tempo dei cambiamenti che si verificano durante la differenziazione delle iPSCs umane dell'epatocita-come le cellule. La cultura di iPSCs su E-Cad-Fc fornisce circa 2mm colonie di diametro che esprimono il marcatore di pluripotent OCT4 (Figura 1A-B). La morfologia delle cellule cresciute su una matrice di E-caderina saranno leggermente diversa da quelle coltivate su altre superfici. Essi tendono ad avere una morfologia appiattita con una maggiore superficie citoplasmatica (Figura 1A). Anche se le cellule staminali pluripotenti umane possono essere coltivate in modo efficiente su un numero di differenti matrici11, la cultura del iPSCs su una matrice di E-caderina è creduta di aumentare l'omogeneità della popolazione delle cellule pluripotenti e permette senza enzima manipolazione delle cellule durante il passaggio12. Tuttavia, diverse matrici alternative, tra cui matrice della membrana basale, laminine, vitronectina e fibroblasti embrionali del mouse (MEF), possono essere utilizzati anche per mantenere iPSCs umane e tutto dovrebbe essere compatibile con la procedura descritta13. In tutti i casi, la pluripotenza delle cellule può essere confermata da Tra-1-60 o equivalente8.
Per avviare la differenziazione, la iPSCs dovrebbero essere raccolti come piccoli grappoli (Figura 1A). All'inizio della differenziazione, le cellule placcate dovrebbero coprire circa l'80% della superficie della piastra. Dopo 5 giorni di trattamento con fattori di crescita, le cellule esprimono proteine che sono tipicamente espressi nell'endoderma definitivo come SOX17 e FOXA2 (Figura 1B). In questa fase, oltre il 90% delle cellule esprimono in genere questi marcatori. Dopo 5 giorni più di differenziazione, l'endoderma Converte un destino epatico e oltre FOXA2, le cellule esprimono HNF4a, che possono essere identificati per tutto il resto del processo di differenziazione (Figura 1B). Come le cellule adottare un destino epatico, i controlli devono riguardare la superficie del piatto come un monostrato. Dopo l'aggiunta di HGF, le cellule cominciano ad esprimere proteine che si trovano negli epatociti fetali tra cui AFP (Figura 1B). Le goccioline del lipido possono essere osservate all'interno del citoplasma delle cellule. Al completamento di differenziazione, le cellule adottano una morfologia cuboidale con un nucleo contenente i nucleoli prominenti e un grande citoplasma con più gocce lipidiche. Un sottoinsieme delle cellule dell'epatocita-come sarà multi-nucleato. La maggior parte delle cellule esprimono un vasto repertorio di proteine dell'epatocita comprese albumina (Figura 1B)14.
Schermo alta velocità effettiva utilizzando ipercolesterolemia come un modello di malattia: Ipercolesterolemia riflette una concentrazione eccessiva di bassa densità della lipoproteina-colesterolo (LDL-C) nel siero. Nell'ipercolesterolemia familiare (FH), l'aumento del livello del siero LDL-C è dovuta principalmente alla mutazioni nel ricevitore della lipoproteina a bassa densità (LDLR) che media l'assorbimento di LDL-C per lo sdoganamento dagli epatociti. Precedentemente abbiamo descritto la generazione di iPSCs da un paziente con ipercolesterolemia familiare omozigote e il loro utilizzo nella generazione di epatociti che rispecchiava la malattia epatica del paziente nella cultura9. È stato dimostrato che queste cellule potrebbero essere utilizzate con successo come una piattaforma per la scoperta di nuovi farmaci. Quando è stata proiettata una biblioteca di ~ 2.500 droghe, si è constatato che i glicosidi cardiaci ha avuto un'inaspettata capacità di abbassare LDL-C in epatociti iPSC-derivato, epatociti umani primari ed in topi con fegatini umanizzati. Inoltre, all'esame record medici pazienti, abbiamo trovato che i livelli sono caduto il colesterolo in pazienti che sono stati prescritti un glicoside cardiaco per il trattamento di malattie cardiache. Questi studi hanno confermato che gli epatociti iPSC-derivato potrebbero essere utilizzati con successo nelle schermate per identificare terapie.
Al fine di fornire una piattaforma che è compatibile con lo screening, è importante che le differenziazioni sono riproducibili e che la variazione di un pozzetto a altro è ridotto al minimo. La figura 2 Mostra i risultati di immunostaining su ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per rilevare HNF4a e albumina al giorno 20 di differenziazione. Come si può vedere nella figura, la distribuzione di queste proteine dell'epatocita è simile in tutti i pozzetti.
La componente proteica centrale di LDL-C è APOB. Qui, abbiamo usato iPSCs alla schermata per APOB abbassamento composti fornire un esempio di utilizzo di epatociti iPSC-derivati per piccola molecola screening (Figura 3A). APOB può essere misurata facilmente in soluzione da ELISA. Dal momento che ELISA può essere eseguita su un numero elevato di campioni, può essere utilizzato come base per uno schermo. L'idoneità di qualsiasi test per screening ad alta resa migliore è determinato usando una misura chiamata il fattore Z (o Z')15. Questo parametro statistico calcola l'efficacia di un test per distinguere tra i campioni di controllo positivi e negativi. Un test con un fattore di Z > 0,5 è considerato compatibile con un schermo15. Come si può vedere in Figura 3B, la Z' del dosaggio APOB = 0,73, che conferma l'idoneità di utilizzo della piattaforma per la scoperta di nuovi farmaci.
Identificazione di composti che hanno la capacità di abbassare i livelli APOB nel terreno di coltura di iPSC - derivato di epatociti: per determinare se la piattaforma possa essere utilizzata per identificare nuove molecole che influenzano i livelli APOB, abbiamo proiettato 1.000 piccole molecole dalla collezione Compound South Carolina (SC3) rappresentante impostare Lite (RSL). Il RSL è stato generato dal centro di South Carolina MUSC per scoperta terapeutica e include composti che sono strutturalmente diversi e riflettono la libreria principale.
La post-droga: rapporto di pre-somministrazione di APOB è stato determinato per ciascun composto (Figura 3) e identificazione dei successi è stata realizzata da z-score analisi (Figura 3D)16. In questo caso, sono state considerate piccole molecole che ridotte APOB con uno z-score ≤-2.0 come potenziali hit. Quando lo screening 1.000 piccole molecole, il numero di potenziali hit con uno z-score ≤-2.0 è solitamente relativamente gestibile. Tuttavia, quando lo svolgimento di uno schermo più grande, ci sarebbe si basano su un punteggio più conservatore di ≤-3.0, basato sulla regola 3-sigma, per aumentare la fiducia nei potenziali bersagli. In questo esempio, abbiamo identificato 24 potenziali hit con un rapporto APOB che variava da 0,86 a 0,44 (Figura 4A). Un'analisi secondaria è stata effettuata su campioni quadruplicate (n = 4 ripetizioni biologiche) di escludere composti che hanno avuto un impatto negativo sulla vitalità cellulare e di determinare quali composti potrebbero abbassare riproducibile APOB nel mezzo. Dei composti originali 24 candidati, quattro sono stati trovati per essere riproducibile (p ≤ 0.05) (Figura 4B-C). Su ulteriore studio, 2 di questi composti sono stati trovati per negativamente influenzare attuabilità delle cellule, suggerendo che la riduzione osservata APOB era probabilmente un essere una conseguenza di perdita delle cellule. I restanti due composti sarebbero considerati buoni candidati per gli studi di follow-up.
Figura 1 : Graduale differenziazione epatica di umano iPSCs. (A) Morfologia delle colonie di iPSC immediatamente prima della vendemmia (pannello di sinistra) e iPSCs dopo aver raccolto le cellule per differenziazione (pannello di destra) - dopo il trattamento di accutase, le cellule devono essere dissociate in 3-6 cellule/cluster. Barra della scala = 50 µm. (B) condizioni di tabella visualizzando cultura in ogni fase di differenziazione (superiore). Immunostaining (pannelli inferiori) è stata effettuata per identificare l'espressione del marcatore in ogni fase di differenziazione. Pannelli mostrano OCT4 e DAPI macchiato i nuclei in iPSCs, SOX17 e FOXA2 in endoderma definitivo, HNF4a e FOXA2 in cellule progenitrici epatiche, HNF4a e AFP in immaturi dell'epatocita-come le cellule, e HNF4a e albumina in relativamente maturo dell'epatocita-come le cellule. Scala bar = 100 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Omogenea differenziazione epatica delle iPSCs umane in piastre da 96 pozzetti. Immunostaining è stato effettuato su ogni singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenenti gli epatociti iPSC-derivati al giorno 20 di differenziazione per rilevare (A) albumina e (B) HNF4a. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Selezione di piccola molecola usando epatociti umani iPSC-derivate. (A) descrizione schematica dell'approccio utilizzato per identificare i composti che possono ridurre i livelli di sadas nel mezzo degli epatociti iPSC-derivato. (B) del grafico che mostra i risultati di un test ELISA per rilevare il livello di APOB nel mezzo di 87 pozzi (n = 87) degli epatociti iPSC-derivato (blu) e/o indifferenziato iPSCs (arancione). Questi dati sono stati utilizzati per calcolare un fattore di Z (Z' = 0,73). (C) grafico che mostra il post-droga: pre-droga rapporti della concentrazione di APOB nel terreno di coltura di epatociti iPSC-derivati trattati per 24 h con 998 composti dal set di RSL3 SC. Z-score dei dati presentati in (C) (D) di grafico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Convalida del primario hits. (A) tabella risultati composti identificati nella schermata principale come in grado di ridurre APOB. (B, C) Bar grafici che mostrano l'impatto dei composti su post-droga: rapporto di concentrazione di APOB pre-farmaco (B) e la vitalità cellulare (C) negli epatociti iPSC-derivati trattati con composti nell'analisi di follow-up. Barre di errore riflettono ± SEM (n = 4 ripetizioni biologiche); * p ≤ 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Obiettivo basata scoperta di nuovi farmaci, dove vengono identificate piccole molecole che influenzano l'attività di una proteina specifica, è stato al centro di molti sforzi di selezione esistente. Anche se questo approccio ha fornito numerosi prodotti farmaceutici, schermi basati sull'inversione di un fenotipo, la farmacologia classica, hanno avuto più successo nell'individuazione di composti di first-in-class che sono stati clinicamente efficace1. Uno svantaggio di scoperta della droga fenotipica è che essa si basa sulla disponibilità di modelli di malattia appropriato. Questo può essere una sfida quando non sono disponibili modelli di cellulare della malattia, o quando comune specie animali di ricerca non riescono a ricapitolare i sintomi clinici. Tuttavia, la capacità di generare iPSCs dalle cellule somatiche del paziente ha fornito nuove opportunità alle malattie dell'uomo modello nella cultura3. Per alcune malattie, come le malattie genetiche rare, i pazienti possono essere pochi in numero e difficili da accedere e consenso. Tuttavia, con l'avvento dell'ingegneria di genoma, è relativamente semplice per introdurre mutazioni nel genoma della iPSC, rendendo possibile modellare anche il più raro delle malattie rare.
Una volta iPSCs sono in mano, è necessario produrre un tipo di cella appropriata in cui si manifestano i sintomi della malattia. Ad esempio, malattie che colpiscono la funzione neurale possono richiedere la generazione di neuroni o cellule gliali17, considerando che quelle che colpiscono il fegato potrebbe essere necessario epatociti9,18 o cellule epiteliali biliari per studiano19, 20 , 21. tale requisito introduce una serie di avvertimenti quando si considera l'uso di iPSCs per scoperta della droga. In primo luogo, è importante capire la base cellulare della malattia. Questo può essere impegnativo, soprattutto quando le cellule adottano caratteristiche basate su posizione o ambiente. Questo potrebbe essere vero per gli epatociti che presentano differenze nei profili di espressione genica e la funzione enzimatica che dipendono dalla loro posizione all'interno del lobulo epatico. In secondo luogo, il lavoro con tutte le celle in isolamento può impedire lo studio delle malattie che riflettono una perturbazione di struttura del tessuto come la cirrosi, comunicazione cellula-cellula come malattia neuromuscolare o coloro che sono influenzati da infiammazione come infiammatorie malattie intestinali.
Per studiare l'affezione epatica, diversi gruppi di ricerca sono descritti protocolli per generare dell'epatocita-come le cellule da iPSCs13,22,23,24,25. Mentre la maggior parte di questi protocolli sono efficiente, la limitazione della tecnica è che le cellule non completamente ricapitolano la funzione degli epatociti freschi. Ciò significa che è importante determinare se le cellule generate dal iPSCs display le funzioni necessarie per valutare l'impatto di una determinata mutazione. Tra i geni di cui espressione non corrisponde pienamente che trovato in epatociti freschi sono quelli che codificano proteine CYP45025,26. Molte di queste proteine hanno un ruolo nel metabolismo del farmaco e la risposta di xenobiotici. Questo è importante quando si considera la progettazione di una schermata perché molti farmaci richiedono la generazione di metaboliti attivi, e questo potrebbe essere influenzato in epatociti iPSC-derivato. Gli sforzi per migliorare la qualità degli epatociti sono stati attivamente perseguiti27. Nonostante gli avvertimenti, parecchi studi hanno dimostrato che iPSCs derivate da pazienti con gli errori innati di metabolismo epatico sono utilizzabili con successo per generare dell'epatocita-come le cellule che rispecchiano la patofisiologia della malattia nella cultura9 , 18 , 28 , 29.
Per gli schermi avere successo, è importante garantire la differenziazione omogenea degli epatociti dalle iPSCs. Quando differenziazioni in piastre da 96 pozzetti non riescono a produrre gli epatociti di alta qualità, è più comunemente dovuta sia per la scarsa qualità delle iPSCs parentale o cultura di iPSCs in condizioni sub-ottimali. Pluripotenza delle iPSCs deve essere mantenuta con cura da coltura in un mezzo di alta qualità con variazioni giornaliere come descritto nel protocollo 1.2. La densità delle cellule pluripotenti nella piastra di coltura dovrebbe essere controllata con attenzione, perché se le cellule diventano sopra confluenti tendono a perdere la pluripotenza e differenziare spontaneamente. Troviamo anche che coltivando le cellule in concentrazioni fisiologiche ossigeno promuove la pluripotenza ed è utile per alcune fasi di differenziazione. Tuttavia, se l'equipaggiamento appropriato non è disponibile, è ancora possibile utilizzare ossigeno ambientale sia coltura le cellule pluripotenti e indurre la differenziazione. Ti consigliamo di definire ordinariamente la pluripotenza delle iPSCs stock misurando l'espressione di marcatori di pluripotenza multipli inclusi OCT-3/4, NANOG e TRA-1-60 prima di eseguire ampie differenziazioni indipendentemente dalle condizioni di cultura. Inoltre abbiamo osservato che quando le cellule formano endoderma ad alta efficienza, hanno una tendenza a peal dalla superficie delle piastre come strati delle cellule. Abbiamo trovato che brevemente trattando l'endoderma iPSC-derivate cellule con 0,02% di soluzione di EDTA possono contribuire a ridurre il distacco delle cellule. Infine, la concentrazione ottimale di cellule necessarie per differenziazioni efficiente possa differire tra le linee di iPSC e possa avere un impatto distacco cellulare. Per questo motivo, è importante determinare empiricamente la concentrazione di cellule necessarie per differenziazioni efficiente, specialmente quando si lavora con una nuova cultura di iPSC.
In sintesi, abbiamo descritto un protocollo di differenziazione graduale che genera dell'epatocita-come le cellule da iPSCs compatibili con gli schermi chimici. L'epatocita-come le cellule sono prodotte come strati monomolecolari in piastre da 96 pozzetti, e il processo è efficiente e riproducibili. Dimostriamo la fattibilità di composti per la loro capacità di abbassare i livelli di APOB nel terreno di coltura di screening. Il formato di differenziazione è compatibile con saggi multipli tra cui ELISA, qRT-PCR e alto contenuto imaging. Crediamo che il campo troverete l'approccio utile per identificare potenziali terapie e per l'identificazione farmacologica delle vie che interessano la differenziazione degli epatociti e funzione nei future applicazioni5,30.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 a Sad). Vorremmo ringraziare il Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Ran Jing per i loro contributi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
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