Summary
Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.
Abstract
Mastocytes (STM), dans le cadre du système immunitaire, joue un rôle clé dans la défense de l’hôte contre plusieurs agents pathogènes et à l’initiation de la réponse immuno-allergique. L’activation de la PSC via la mise en réseau de surface IgE lié au récepteur de haute affinité IgE (FcεRI), ainsi que par le biais de la stimulation de plusieurs autres récepteurs, initie la montée de la libre niveau2 + Ca intracellulaire ([Ca2 +]i) qui favorise la libération de médiateurs inflammatoires et allergiques. L’identification des constituants moléculaires impliquées dans ces voies de signalisation est cruciale pour comprendre la régulation de la fonction de MC. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l’isolement du type murin du tissu conjonctif MCs par lavage péritonéal et culture du MCs péritonéales (PMC). Cultures de MCs de divers modèles de souris knock-out par cette méthodologie représentent une approche utile pour l’identification des protéines impliquées dans les voies de signalisation de MC. En outre, nous décrivent également un protocole pour la seule cellule Fura-2 imagerie comme une technique importante pour la quantification du Ca2 + signalisation au MCs. basés sur la Fluorescence suivi de [Ca2 +]j’ai est un fiable et communément utilisé approche étude de Ca2 + signalisation des événements, y compris entrée magasin fonctionnant de calcium, qui est d’une importance capitale pour l’activation du MC. Pour l’analyse de dégranulation MC, nous décrivons un β-hexosaminidase test de libération. Le montant de la β-hexosaminidase libérée dans le milieu de culture est considéré comme un marqueur de dégranulation pour tous les trois différents sécrétoires sous-ensembles décrit dans MCs. β-hexosaminidase peut facilement être quantifié par sa réaction avec un substrat de colorigenic dans un test colorimétrique plaque de microtitration. Cette technique hautement reproductible est rentable et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Dans l’ensemble, le protocole fourni montre un rendement élevé de MCs exprimant des marqueurs de surface MC typiques, affichant des caractéristiques morphologiques et phénotypiques typiques de MCs et démontrant des réponses hautement reproductibles à sécrétagogues Ca2 +- tests d’imagerie et de la dégranulation.
Introduction
MCs jouent un rôle de premier plan au cours de la réponse immunitaire innée et acquise. Plus précisément, MCs participent à la mise à mort des agents pathogènes, tels que les bactéries et les parasites et aussi dégradent les peptides endogènes potentiellement toxiques ou des composants de venins (pour examen voir Galli et al. 20081). Le rôle physiologique de la PSC dans l’immunité innée et adaptative fait l’objet de débats houleux. Par conséquent, les nombreux écarts de données dans les études réalisées avec différents modèles de souris déficientes en MC nécessitent une réévaluation systématique des fonctions immunologiques de MCs au-delà allergie2. Mature MC est principalement localisés dans les tissus et les organes comme la peau, des poumons et intestins et se trouvent habituellement qu’en petit nombre dans le sang. MCs dérivent de précurseurs hématopoïétiques, tels que les progéniteurs de MC et terminer leur différenciation et maturation dans les micro-environnements de presque tous les tissus vascularisés1. T-cell-facteur dérivé de l’interleukine (IL) -3 favorise sélectivement la viabilité, la prolifération et la différenciation d’une population de pluripotentes de souris MCs de leurs progéniteurs hématopoïétiques3. Stem cell factor (SCF) est produite par des cellules structurelles dans les tissus et joue un rôle crucial dans le développement, survie, migrations et fonction4MC. Les propriétés de la PSC individuels peuvent différer selon leur capacité à synthétiser et stocker diverses protéases ou les protéoglycanes. Chez la souris, le MCs dits du tissu conjonctif-types se distinguent des muqueuses MCs selon leur localisation anatomique, la morphologie et contenu de l’héparine et protéases5.
Selon MCs, une augmentation de libre cytosolique Ca2 + ([Ca2 +]i) est indispensable pour la dégranulation et la production des eicosanoïdes, ainsi que pour la synthèse de cytokines et l’activation de facteurs de transcription en réponse à l’antigène et divers sécrétagogues6. Une cible majeure en aval de ces stimuli est phospholipase C, qui hydrolyse la phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycérol (DAG) et inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG active la protéine kinase C et IP3 libère des ions de Ca2 + du réticulum endoplasmique. L’appauvrissement de ces magasins active influx de Ca2 + par la membrane plasmique Ca2 + voie, menant à le pour entrée de calcium exploités (SOCE) de stocker. Ce processus est évoqué à travers l’interaction du Ca2 +-capteur, stromales interaction molécule-1 (Stim1), dans le réticulum endoplasmique avec Orai17 , ainsi que par le biais de l’activation du récepteur transitoire potentiels canonique (TRPC) canal protéines (pour examen, voir Freichel et al. 20148) dans la membrane plasmique.
Afin d’étudier le rôle physiologique de ces canaux, plusieurs pharmacologique (application de bloqueurs des canaux calciques) ou les approches génétiques sont généralement utilisés. Dans ce dernier cas, suppression de l’expression des protéines est obtenue en ciblant l’ARNm (précipitation) ou la modification de l’ADN génomique globale ou spécifique aux tissus9 suppression d’un exon codant un pore formant la sous-unité d’un canal (knockout). La disponibilité d’un bloqueur avec suffisamment de précision pour que ces canaux est limitée. En outre, l’approche knockdown exige un contrôle minutieux de son effectivité en utilisant, par exemple., Western blot de l’analyse et est entravée par l’absence d’anticorps spécifiques de la protéine ciblée canal dans de nombreux cas. Ainsi, l’utilisation de modèles de souris knock-out est toujours considérée comme l’étalon-or pour une telle analyse. Un modèle préféré in vitro pour l’étude des fonctions de MC est culture de PMC peut être isolé ex vivo comme une population en pleine maturité (par opposition à différencier les MCs in vitro de, par exemple., cellules de moelle osseuse)10 . Par rapport à la moelle osseuse provenant de MCs (BMMCs), qui sont aussi couramment utilisées pour étudier la fonction MC in vitro, la stimulation des FcεRI et bêta-hexosaminidase libération est augmentée 8 fois et 100 fois dans PMC, respectivement. Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement et culture des PMC murine, qui permet d’obtenir après que 2 semaines de culture un nombre élevé de pure du tissu conjonctif type MCs, suffisantes pour une analyse ultérieure.
Malgré les récents progrès dans l’élaboration et l’application des indicateurs de calcium génétiquement encodé, leur utilisation est encore limitée par les difficultés de livraison de gènes aux cellules cibles, en particulier, dans les cellules hautement spécialisés comme MCs cultivés primaires. En outre, ce groupe d’indicateurs fluorescents pour [Ca2 +]je mesures manque encore ratiométrique colorants avec une plage dynamique élevée. Pour ces raisons, la méthode préférée pour ratiométrique [Ca2 +]je mesure est toujours l’utilisation du colorant fluorescent « Fura-2 »11.
Actuellement, la plus couramment utilisée approche pour l’évaluation de l’activation de MC et dégranulation est la mesure de l’activité β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, un médiateur allergique, est l’un des composants de granule MC est publié conjointement avec l’histamine dans une proportion constante du MCs12. Β-hexosaminidase peut être mesuré facilement et avec précision par le biais de sa réaction avec un substrat spécifique, ce qui produit une quantité mesurable d’un produit de colorigenic qui est facilement détectable dans un dosage colorimétrique de la microplaque. Dans cet article, une application de cette technique d’analyse de dégranulation PMC en réponse à divers stimuli est signalée.
Agrégation des récepteurs haute affinité IgE plasmiques (FcɛRI) active dans MCs, une voie de signalisation intracellulaire versatile, conduisant à une libération du contenu des granules sécréteurs dans l’espace extracellulaire environnant. En plus de l’antigène spécifique, beaucoup d’autres stimuli peut activer MCs pour libérer un éventail varié d’immunomodulateurs médiateurs, comme complément anaphylatoxines (e.g., C3a et C5a)13, l’endothéline de peptide vasoconstricteur 1 (ET1)14 , bien que de nombreuses substances cationiques et médicaments provoquant des réactions pseudoallergic (e.g., icatibant)15 en se liant à MRGPRX216. Des voies de signalisation intracellulaire impliqué dans MCs MRGPR induite par la dégranulation sont mal caractérisés par rapport à la signalisation intracellulaire induite par le FcɛRI ; ces voies n’a commencé à étudier intensivement pendant les dernières d’années quelques17 après l' identification de récepteurs16. Dans une large mesure, les canaux ioniques de la membrane plasmique impliqués dans l’entrée de calcium suivie d’une stimulation MRGPRX2 restent à être compris. Par conséquent, le présent article se concentre également sur la signalisation calcique intracellulaire et dégranulation de MCs stimulée par les agonistes de la MRGPR.
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Protocol
Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux directives de la législation allemande pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (officiellement approuvé par le Conseil régional de Karlsruhe).
1. PMC isolement et culture par Lavage intrapéritonéale
| 1 | Glace |
| 2 | seringues de 10 mL |
| 3 | Aiguilles de 27 G |
| 4 | Aiguilles de 20 G |
| 5 | Épingles et bloc de mousse de styrol |
| 6 | Tubes de prélèvement (Tubes de centrifugeuse en plastique de 50 mL) |
| 7 | éthanol à 70 % |
| 8 | Milieu RPMI (pré réfrigérés et gardé sur glace) |
| 9 | PMC moyen : Milieu RPMI + 20 % FCS (sérum de veau foetal) + 1 % solution de pénicilline streptomycine (Strep-Pen) |
| 10 | Tamponnée au phosphate de Dulbecco saline - SPD (sans Ca2 + , Mg2 +) |
| 11 | Flacons de culture (25 cm) |
| 12 | Facteurs de croissance des solutions de stock (IL-3 : 1 μg/μL ; EFC : 2,5 μg/mL) |
| 13 | Pipettes sérologiques (10 mL) |
| 14 | Pointes de pipettes stériles (20-200 µL) |
| 15 | Hémocytomètre |
| 16 | Centrifugeuse de paillasse |
| 17 | Ciseaux et pinces |
| 18 | CO2 chambre pour souris |
| 19 | Ouvrir capot stérile |
| 20 | Hotte stérile fermé |
| 21 | Incubateur de cellules (37 ° C et 5 % CO2) |
| 22 | Pipettes de transfert (20-200 µL) |
Tableau 1 : Matériaux pour l’étape 1.
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Isolement des PMC par lavage intrapéritonéale
- Avant l’isolement cellulaire, préparer les documents énumérés au tableau 1.
- Utiliser 8 à 14 semaines des souris mâles pour l’isolement de PMC. Euthanasier une souris par inhalation de CO2 et de confirmer la mort par la perte des réflexes. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 % et fixez-le sur un bloc de mousse à l’aide de goupilles (dorsale vers le bas). Enlever la peau ventrale de la souris à l’aide de ciseaux de bord émoussé. Éviter d’endommager la cavité péritonéale.
NOTE : Nous utilisons généralement ce protocole pour les souris avec un bagage génétique de la souche C57BL/6N. - Injecter 7 mL du milieu RPMI glacé et 5 ml d’air dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 mL équipée d’une aiguille de 27 G. Enfoncer l’aiguille soigneusement le péritoine et perforer pas d’organes. Utilisez un endroit dans la région de la graisse dans l’épididyme pour réduire le risque d’une perforation d’organe.
- Après l’injection, secouer la souris pendant 1 min détacher des cellules péritonéales dans le milieu RPMI. Ne pas secouer la souris trop fortement, pour éviter d’endommager les organes internes et la contamination de la cavité péritonéale par le sang.
- Réutiliser la seringue de 10 mL en l’équipant d’une nouvelle canule 20 G. Déplacer les organes internes d’un côté en inclinant le bloc de mousse et en tapant doucement sur le banc pour faciliter l’aspiration moyenne de l’autre côté. Insérer une aiguille de 20 G, en biseau vers le haut et aspirer du liquide dans l’abdomen, doucement et lentement (~0.5 mL/s) pour éviter l’obstruction par les organes internes. Recueillir autant de liquide que possible (en général 5 à 6 mL).
- Retirer l’aiguille de la seringue et transférer la suspension de cellules recueillies dans un tube de prélèvement sur la glace. Jeter un tube échantillon s’il y a contamination de sang visible.
- Centrifuger les tubes avec la suspension de cellules à ~ 300 x g pendant 5 min. Sous hotte stérile aspirer le surnageant. Pour chaque souris, combiner les granules d’échantillon dans 4 mL de froid (4 à 10 ° C) PMC moyen et transférer la suspension cellulaire dans un ballon de culture de2 de 25 cm. Ajouter les facteurs de croissance IL-3 et SCF à la concentration finale 10 ng/mL et 30 ng/mL, respectivement. Placer la fiole contenant les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5 % CO2) et incuber pendant environ 48 heures jusqu'à la prochaine procédure.
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Culture PMC
- Jour 2 (~ 48 h après l’isolement) : changement moyen
- Pour supprimer les cellules surnageants et non adhérents (érythrocytes et les cellules mortes), aspirez le milieu du flacon en plaçant une pointe de pipette Pasteur au bord du ballon et en tenant le ballon presque horizontalement. Ajouter 4 mL de milieu de PMC préchauffé par souris. Ajouter les facteurs de croissance IL-3 (10 ng/mL) et SCF (30 ng/mL). Placer la fiole contenant les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5 % CO2).
- Jour 9 : Cell Division
- Transférer la suspension cellulaire du flacon de culture cellulaire dans un tube à centrifuger en plastique 50 mL. Laver le ballon trois fois avec tampon phosphate salin de 10 mL préchauffée Dulbecco (37 ° C) (SPD), recueillant la suspension cellulaire avec des cellules individuelles dans les même 50 mL plastique centrifuger tube. Compter la concentration cellulaire par un hémocytomètre et calculer le nombre total des cellules.
- Centrifuger la suspension cellulaire à ~ 300 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Récupérer le culot dans préchauffé PMC moyen (37 ° C) pour obtenir la cellule concentration 1 x 106 cellules/mL. Transférer la suspension cellulaire à un nouveau flacon de culture 25 cm2 . Jeter la vieille fiole avec fibroblastes adhérant au fond.
- Ajouter les facteurs de croissance IL-3 (10 ng/mL) et SCF (30 ng/mL) et placer la fiole contenant les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5 % CO2).
- Jours 12 à 15 : mesures de cellules
- Si toutes les expériences avec la stimulation des récepteurs FcɛRI sont prévues, pré-traiter les cellules pendant la nuit avec 300 ng/mL d’IgE anti-DNP dans le milieu de culture standard. Procéder à l’étape 2 ou 3.
- Jour 2 (~ 48 h après l’isolement) : changement moyen
2. mesure de Concentration de Calcium libre intracellulaire fluorimétrique en PMC
- Avant les mesures, préparer les documents énumérés dans le tableau 2. Également, préparer une installation d’imagerie consistant en : Microscope inversé à Fluorescence ; Objectif : 40 X / 1.3 huile ; Fura 2 jeu de filtres ; Caméra CCD ; Source lumineuse d’excitation ; Programme d’Acquisition de l’imagerie ; Système d’application de solution d’alimentés par gravité.
| 1 | PMC (âgés de 12 à 15 jours) 1 x 106 cellules/mL |
| 2 | Concanavaline A |
| 3 | Fura-2 AM |
| 4 | Solution à 20 % Pluronique F-127 |
| 5 | Lamelles de verres ronds ; ø 25 mm ; N ° 1 |
| 6 | Solution mère de DNP-HSA (albumine de sérum de dinitrophénol-homme) |
| 7 | Solution d’anti-DNP-anticorps (IgE) |
| 8 | Plaque de fond plat (12 puits) |
| 9 | Composé en solution stock 48/80 |
| 10 | Couvrir bien imagerie Chambers |
| 11 | Hémocytomètre |
| 12 | Pipettes de transfert (20-200 µL) |
Tableau 2 : Matériaux pour l’étape 2.
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Fura-2 préparation d’imagerie
- Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajuster la concentration en cellules à 1 x 106 cellules/mL. Diviser les colonies PMC de pipetage doucement (3 à 5 fois) la suspension cellulaire avec une pointe de pipette de 1 mL.
- Préparer un Ca2 +-contenant HEPES solution saline tamponnée (Ca2 +- HBSS) composée de 135 mM NaCl, KCl 6 mM, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES et 12 mM de glucose. Ajuster le pH à 7,4 avec 3 M de NaOH.
- Préparer la concanavaline A lames revêtues par pipetage 1 goutte de solution de la concanavaline A (0,1 mg/mL en H2O) sur chaque 25 mm ronde couvercle en verre sous hotte stérile. Laisser les gouttes sur les lamelles pendant au moins 1 min, puis retirer la majeure partie de la solution avec une pipette et laisser sécher à l’air les lamelles pour 45 min. Enfoncez doucement les lamelles de la concanavaline A traité sur le caoutchouc d’imagerie chambre (voir Table des matières) jusqu'à ce que ils attachent pour obtenir microscopie imagerie chambres.
NOTE : Diapositives de la Poly-L-Lysine enduite peuvent être utilisés comme une alternative. - Dissoudre le colorant fluorescent Ca2 + Fura-2 AM (1 mM) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver cette solution à l’abri de la lumière.
- Diluer la Fura-2 solution AM dans Ca2 +- HBSS à une concentration finale de 5 µM afin de préparer le « tampon de chargement ». Supplément 5 µL/ml de Pluronique 20 % F-127 dans le DMSO.
- Mix 500 µL du tampon « chargement » avec 500 µL de la suspension cellulaire PMC. Déposer le mélange dans la chambre d’imagerie et incuber les cellules pendant 20 à 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Mettre en place la système d’application avec des solutions différentes selon le protocole de stimulation de gravité. Compléter la seringue 1 avec 40 mL de solution de Ca2 +- HBSS, seringue 2 avec 40 mL de Ca2 +- HBSS solution contenant 100 ng/mL DNP, seringue 3 avec 40 mL de Ca2 +- HBSS solution contenant 50 µg/mL composé 48/80, seringue 4 avec 40 mL de en théorie Ca2 +-gratuit-solution HBSS et de seringues 5 ml 40 de nominalement Ca2 +-gratuit-solution HBSS contenant 2 µM thapsigargine.
- Préparer un objectif à immersion à huile de grande ouverture 40 X en plaçant une petite goutte d’huile à immersion à ce sujet.
- Monter le système de demande sur la scène du microscope inversé. Equipez la chambre d’imagerie avec les cellules chargées du système de demande et le fixer pour empêcher tout mouvement pendant l’enregistrement. Allumez la lumière transmise et concentrer les cellules.
- Rincer les cellules trois fois avec Ca2 +- HBSS tampon à l’aide du système d’application gravitaire.
- Incuber les cellules de Ca2 +- HBSS pendant 5 min pour Fura-2 dé-estérification AM.
- Rincer les cellules une fois de plus avant de commencer l’imagerie, pour supprimer les éléments potentiellement fuite colorant fluorescent.
-
Imagerie cellulaire
- Démarrer le programme d’acquisition d’imagerie en mode acquisition physiologique. Ouvrez la fenêtre Paramètres et ajuster la mise au point et le temps d’acquisition optimal (qui devraient être les mêmes pour l’excitation avec 340 nm et 380 nm et généralement comprise entre 50 et 150 ms).
NOTE : Minimiser l’exposition du Fura-2 cellule chargé de toute la lumière pour éviter le photoblanchiment du colorant. - Image d’une image de référence et marquer les cellules comme des régions d’intérêt (ROI). Marquer le dernier ROI dans une zone où aucune cellule est présents et le définir comme arrière-plan.
- Terminer l’installation et démarrer la mesure avec une fréquence d’acquisition 5 s.
Remarque : Les cellules sont alternativement allumés avec l’excitation lumineuse de 340 nm et 380 nm et la fluorescence émise (> 510 nm) seront recueillies à l’aide de la caméra CCD. Les images de fluorescence signaux F340 nm et F380 nm ainsi que le ratio (F340 nm/F380 nm) seront affichera dans trois fenêtres. Les graphiques de l’évolution temporelle de l’intensité de la fluorescence des ROIs individuelle signifient valeurs seront affichées en continu. - Ajouter des solutions au numéro cycle approprié selon la conception de l’expérience :
- Élévation de mesure induite par l’antigène [Ca2 +]j’ai, comme illustré à la Figure 2A, 2 b, s’applique la solution seringue 2 après cycle 20 et arrêt d’enregistrement après cycle 150.
- Pour mesurer l’élévation induite par le composé 48/80 [Ca2 +]i,tel qu’illustré en Figure 2C, appliquer la solution de seringue 3 après cycle 20 et arrêt d’enregistrement après cycle 150.
- Pour mesurer l’élévation de [Ca2 +]j’ai évoqué par SOCE, comme illustré dans la Figure 2D, appliquer la solution de seringue 4 après cycle 10, appliquer la solution de seringue 5 après cycle 70, appliquer la solution de seringue 4 après cycle 120, appliquer la solution de seringue 1 après cycle 150 et arrêter l’enregistrement après cycle 220.
- Après avoir terminé la mesure, convertir les résultats dans une table de rapport contenant les intensités mesurées pour les longueurs d’onde excitation avec et sans correction de fond, tant que les valeurs de ratio avec et sans correction de fond pour chaque ROI et chaque point de temps de mesure. Dans le programme d’acquisition, consécutivement Appuyez sur les boutons : « début de coupe », « sélectionner tout », « convertir tous », « mesures de physiologie », « Ok, « Ok ». Enregistrez les fichiers comme les tables et les piles de l’image pour l’analyse hors ligne.
- Démarrer le programme d’acquisition d’imagerie en mode acquisition physiologique. Ouvrez la fenêtre Paramètres et ajuster la mise au point et le temps d’acquisition optimal (qui devraient être les mêmes pour l’excitation avec 340 nm et 380 nm et généralement comprise entre 50 et 150 ms).
3. bêta-hexosaminidase sortie mesure en PMC
| 1 | PMC (âgés de 12 à 15 jours) 1 x 106 cellules/mL |
| 2 | Solution d’anti-DNP-anticorps (IgE) |
| 3 | Solution mère de DNP-HSA |
| 4 | Composé en solution stock 48/80 |
| 5 | Ionomycine |
| 6 | Plaque à 96 puits, fond en forme de v |
| 7 | Plaques à 96 puits, fond plat |
| 8 | Tubes à centrifuger en plastique (15 mL) |
| 9 | Pipettes sérologiques |
| 10 | Incubateur de cellules (37 ° C et 5 % CO2) |
| 11 | Centrifugeuse de paillasse |
| 12 | Lecteur de microplaques pour les mesures de densité optique |
| 13 | Pipette multicanaux (20 – 200 μL) |
| 14 | Hémocytomètre |
Tableau 3 : Matériaux pour l’étape 3.
- Avant les mesures, préparer les documents énumérés au tableau 3.
NOTE : β-hexosaminidase libéré de MCs après leur stimulation hydrolyse p-nitrophényl-acétyl-D-glucosamine (pNAG) en p-nitrophénol et N-acétyl-D-glucosamine. Le montant de la β-hexosaminidase dans l’échantillon est proportionnel à la quantité de p-nitrophénol qui sera formé. Dans un environnement de pH élevé de « Solution d’arrêt », p-nitrophénol existe sous la forme entièrement déprotoné p-nitrophenolat et peuvent être détectée par sa lumière absorbance à 405 nm. - Préparer une solution de Tyrode contenant 130 mM NaCl, KCl 5 mM, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM de glucose et BSA 0,1 %. Ajuster le pH à 7,4 avec 3 M de NaOH.
- Préparer la solution de lyse en ajoutant un volume de 1 % de Triton X-100 à une solution de Tyrode.
- Préparer la solution d’arrêt composée de glycine de 200 mM et ajuster le pH à 10,7 avec NaOH.
- Préparer la solution de pNAG (2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside de 4-nitrophényle) en dissolvant pNAG en acide citrique 0,4 M à une concentration finale de 4 mM.
- Calculer la quantité de cellules nécessaires pour le dosage (effectuer le test en double exemplaire). Utiliser 200 000 cellules par puits. Utiliser 2 puits comme témoins négatifs (solution Tyrode sans n’importe quel sécrétagogues comme DNP ou composé 48/80) et 2 puits comme témoins positifs (solution Tyrode avec 10 µM ionomycine) pour chaque génotype.
- Transférer les cellules dans un tube à centrifuger en plastique 15 mL, réglez le volume à 15 mL avec une solution de Tyrode et centrifuger à 200 g pour 4 min. Retirez le surnageant avec une pipette Pasteur et remettre en suspension les cellules dans une solution de Tyrode à 2 x 106 cellules par millilitre.
- Transférer 100 µL de la suspension de cellules / puits d’une plaque à 96 puits fond V bien. Ajouter 25 µL de solution de contrôle ou de stimulation dans chaque cupule (selon le schéma de pipetage illustré à la Figure 3A). Incuber les cellules pendant 45 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Arrêter la réaction en plaçant la plaque 96 puits sur la glace pendant 5 min. Puis, centrifuger la plaque à 4 ° C pendant 4 min à 120 x g. Transférer 120 µL du liquide surnageant à l’aide d’une pipette multicanaux pour une plaque à 96 puits à fond plat et placez-le sur la glace. Soigneusement éviter de toucher les granules cellulaires, mais totalement aspirer le surnageant.
- Ajouter 125 µL de tampon de lyse à des granulés de la cellule. Incuber les granules cellulaires pendant 5 min à température ambiante et remettre en suspension après l’incubation par répétées de pipetage (environ 5 fois).
- Pipetter 25 µL de la solution de pNAG (4 mM) dans les puits requis d’une nouvelle plaque de 96 puits à fond plat. Ajouter 25 µL de chaque surnageant à la solution de pNAG préparés ainsi que 25 µL de chaque lysat cellulaire.
- Incuber les lots de réaction pendant 1 h à 37 ° C. Après l’incubation, distribuer 150 µL de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.
- Analyser la plaque avec un lecteur de microplaques à l’aide d’un cadre à double longueur d’onde à 405 nm avec référence 630 nm pour la soustraction automatique en arrière-plan. Dans le programme d’acquisition, cochez la case « Référence » et dans le menu élément du programme « Absorbance », sélectionnez « 630 nm » dans la liste déroulante. Si la densité optique des échantillons est trop élevée, préparer une dilution appropriée de la sonde avant remesurage.
- Calculer le pourcentage de la β-hexosaminidase libération selon l’équation suivante :
où liberté [%] est le pourcentage de version bêta-hexosaminidase spécifique, un [surnageant] est l’arrière-plan corrigé absorption du liquide surnageant, et un [lysat] est l’arrière-plan corrigé d’absorption de la cellule correspondante lysate.
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Representative Results
PMC ont été isolées de 3 souris de type sauvage (C57BL/6N) par lavage intrapéritonéale et plus cultivées dans un milieu RPMI supplémenté avec 20 % de FCS et 1 % Pen-Strep en présence de facteurs de croissance (IL-3 à 10 ng/mL) et le SCF à 30 ng/mL sous stérile humidifiée conditions à 37 ° C et 5 % de CO2. Le milieu a été changé 2 et 9 jours après l’isolement cellulaire. La morphologie de la cellule a été analysée à l’aide de transmission lumière imagerie DIC (voir Figure 1A, B). Le contraste de la cellule et la granularité a démontré la viabilité cellulaire bonne. Après 2 semaines de mise en culture dans ces conditions, une population homogène de 1,5 x 107 cellules a été obtenue. Analyse en cytométrie en flux des cellules colorées conjointement avec les anticorps anti-IgE conjugué FITC et anticorps Anti-c-Kit avec PE a révélé 98,6 % des cellules de positif FITC positif et 99,8 % PE (Figure 1C). 98,5 % des cellules cultivées avaient un double positif pour FITC et PE (Figure 1C), montrant des caractéristiques typiques des MCs matures.
Outre l’analyse fonctionnelle des cellules obtenues, fluorimétrique [Ca2 +]je mesures à l’aide d’indicateur fluorescent Fura-2 ont été effectuées. Fura-2 cellules chargées étaient allumées alternativement avec 340 nm et une excitation 380 nm lumière chaque 5 s et fluorescence > 510 nm a été enregistrée à l’aide d’une caméra CCD. Le ratio de la fluorescence (F340/F380) a été constamment surveillé. Application de DNP (100 ng/mL) à PMC incubé durant une nuit avec 300 ng/mL d’IgE anti-DNP évoquée par une élévation marquée du [Ca2 +]j’ai niveau, qui a diminué lentement jusqu'à son maximum la moitié pendant plusieurs minutes (Figure 2A, B). Variabilité des réponses des cellules était relativement faible (Figure 2A, B). Stimulation des récepteurs MRGPRB2 50 µg/ml de composé 48/80 suivant le même protocole de temps a également considérablement augmenté [Ca2 +]i dans PMC Fura-2-chargé avec une amplitude moyenne très proche de la réponse (Figure 2C). Pour l’analyse de la SOCE dans PMC, un protocole de « rajout » a été appliqué : 10 cycles après le début de la mesure, externe Ca2 + a été supprimé et au cours de cycles thapsigargine 70 – 120, (2 µM), un inhibiteur du réticulum endoplasmique ATPase, a été appliqué pour l’appauvrissement de la couche de Ca2 + intracellulaires et pour une activation maximale de SOCE. La transitoire [Ca2 +]j’ai élévation reflète la libération de Ca2 + des Ca2 + des réserves intracellulaires dans un nominalement Ca2 +-gratuit solution bain (Figure 2D). La restauration de la concentration externe Ca2 + 2 mm après que cycle 150 a entraîné une augmentation importante dui niveau de [Ca2 +] en raison de l’influx de Ca2 + à travers les canaux SOCE (Figure 2D). Cette composante de la réponse de Ca2 + est fortement inhibée en présence de 10 µM GSK 7975A, connu comme un bloqueur CRAC, tandis que la libération de Ca2 + des Ca2 + des réserves intracellulaires sont demeurés inchangés (Figure 2D ).
Dans la prochaine étape, nous avons testé l’aptitude des CMP isolé dégranulation après réticulation des récepteurs de haute affinité FcɛRI ou la stimulation des récepteurs MRGPRB2. À cette fin, un test de libération ß-hexosaminidase a été réalisé. Les cellules ont été ajoutés à une plaque de fond en V 96 puits (2 x 105 cellules/puits) et stimulés selon le schéma illustré à la Figure 3A pendant 45 min à 37 ° C. La plaque a été centrifugée et après élimination du surnageant, les pellets sont lysées. Le contenu de la ß-hexosaminidase de surnageants individuels et pellet lysats a été analysé par leurs réactions avec pNAG pendant une 1 h d’incubation à 37 ° C. La quantité de produits de la réaction a été détectée par colorimétrie et le pourcentage de la ß-hexosaminidase libéré a été calculé (voir la Figure 3B). La libération spontanée est très faible (1 %), alors que les réponses à des stimuli de dégranulation forts tels que 10 µM ionomycine et composé 48/80 à 50 µg/mL étaient plus 40 % et 60 %, respectivement. Dégranulation des réponses à la stimulation de la DNP ont été dose-dépendante sur des concentrations allant de 10 à 300 ng/mL. Ensemble, ces données indiquent clairement un bon état fonctionnel de CMP isolés.
Figure 1 : Caractérisation des primaires cultivés murine wild type PMC effectuée à l’aide de l’analyse DIC microscopie et écoulement cytometry. (A, B) Images représentatives obtenues à l’aide de 20 X plasDIC objectif de PMC cultivés dans des flacons en plastique de 25 cm2 1 h après l’isolement de cellules par voie intrapéritonéale lavage (A) et le jour 9 de culture (B). Barres d’échelle dans la droite coin inférieur indique 100 µm. (C) écoulement cytometry analyse des PMC (12jours cultivés selon le protocole décrit ci-dessus) Co colorées avec l’anticorps anti-IgE conjugué avec l’Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et Anti-c-kit anticorps conjugué avec la phycoérythrine (PE). La parcelle de densité cellulaire est divisée en quatre quadrants : Q1, PE ci-dessus autofluorescence niveau/FITC sous le niveau de l’autofluorescence ; Q2, PE ci-dessus autofluorescence niveau/FITC au-dessus du niveau d’autofluorescence ; Q3, PE ci-dessous autofluorescence niveau/FITC sous le niveau de l’autofluorescence ; Q4, PE ci-dessous autofluorescence niveau/FITC au-dessus du niveau d’autofluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Enregistrement de [Ca2 +] j’ai Fura-2 chargé PMC isolés de souris de type sauvage. [Ca 2 + ]j’ai présenté dans le rapport de fluorescence F340/F380. (A) les traces représentatives de [Ca2 +]j’ai décours temporel des PMC individuels (n = 38) stimulés par DNP (100 ng/mL). (B) durée de DNP (100 ng/mL)-évoquée [Ca2 +]j’ai élévation. Chaque point de données indique les valeurs moyennes obtenus à partir des cellules individuelles 38 illustrées dans Panneau de A. Le PMC prétraités du jour au lendemain avec 300 ng/mL d’IgE anti-DNP. (C) évolution temporelle des moyennes d’induite par le composé 48/80 [Ca2 +]j’ai élévation dans PMC (n = 60). (D) évolution temporelle des moyennes de [Ca2 +]je change au cours intracellulaire Ca2 +-stocker épuisement induit par application de 2 µM thapsigargine (Tg) nominalement Ca2 +-solution, suivie du magasin sans opéré des influx de calcium après rajout de 2 mM de Ca2 + dans la solution du bain dans le groupe témoin (n = 44) du CMP (carrés noirs) et en présence de 10 µM de GSK 7975A dans la solution du bain (cases bleues) (n = 41). En B, C et D, les barres d’erreur afficher l’erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Bêta-hexosaminidase libérer des mesures multipuits colorimétriques effectuées avec PMC isolés de souris de type sauvage. (A) schéma de Stimulation de la plaque à 96 puits pipetage pour effectuer le test de la bêta-hexosaminidase ; les résultats sont présentés dans le panneau que b. « Spontan » correspond au pipetage de Solution Tyrode sans l’ajout de n’importe quel sécrétagogues ; IM = ionomycine ; CP 48/80 = composé 48/80. (B) Bar graph pourcentage illustrant des ß-hexosaminidase libération dans des conditions basales (Spont), après stimulation par l’ionomycine (IM), albumine de sérum humain dinitrophénol (DNP) et composé de 48/80 (Cp 48/80) avec concentrations indiquées. Le test a été réalisé en double exemplaire ; barres d’erreur afficher l’erreur-type de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Modèles de MC peuvent servir avec succès pour étudier la dégranulation de MC, chimiotactisme, adhérence, aussi bien quant à élucider les voies de transduction signalisation intracellulaire impliqués dans l’activation MC. Certains chercheurs utilisation humaine MCs modèles, tels que des lignées immortalisées (LAD2 et HMC1) ou MCs humaines dérivées de cordon de sang des cellules progénitrices (CD133 +) et les cellules souches du sang périphérique (CD34 +). D’autres préfèrent les rongeurs MC modèles, tels qu’immortalisés (leucémie basophile de rat RBL - 2H 3 MC line) ou primaire cultivées (souris OS-moelle osseuse MCs BMMCs, PMC) modèles. Murines MCs primaires peuvent être utilisés pour analyser la fonction de MC dans nombreux modèles de souris « knock out », qui sont l’approche de l’étalon-or à l’exploration des fonctions physiologiques de certains gènes et protéines codées. Le déficit d’outils pharmacologiques de sélectivité suffisante et d’activité rend cette méthode particulièrement précieux pour l’étude des mécanismes de transduction du signal par MC activation18. PMCs murins sont du phénotype du tissu conjonctif qui présente une morphologie mature et granularité élevée. Ils ne répondent pas seulement bien à réticulation d’antigène de FcεRI comme BMMCs, mais sont également activées par les agonistes de plusieurs récepteurs additionnels tels que l’endothéline 1 ou 48 composé. Toutefois, le rendement de la PMC est généralement beaucoup plus faible comparativement à celle des BMMCs et n’est généralement pas suffisant pour effectuer un transfert Western ou une autre technique qui requiert un grand nombre de cellules. Plusieurs techniques ont été décrites pour l’isolement et la purification de PMC. Par exemple, la centrifugation en gradient de Percoll a été signalée à céder une grande pureté des cellules19; Toutefois, le nombre de cellules obtenus avec cette technique est habituellement relativement faible. Dans le protocole décrit ici, l’étape la plus critique est l’aspiration de la suspension cellulaire de la cavité péritonéale. Éviter la contamination de l’échantillon de sang et en aspirant le montant maximal des moyens possibles sont essentiels afin d’obtenir un nombre élevé de PMC de haute pureté. Avec certaines souches de souris, un nombre maximal de PMC est uniquement obtenu par un raccourci (11 – 12 jours) période de culture. Partant de ces cellules dans les conditions de culture pour un temps plus long ne conduit qu’à une réduction du nombre de cellules.
Dans la présente étude, les auteurs décrivent un protocole simple pour l’isolement des MCs matures qui permet d’obtenir une population très pure de la MC de la cavité péritonéale de la souris. Les cellules obtenues sont caractérisées par une grande homogénéité et présentent des caractéristiques typiques de MC, comme l’expression des récepteurs de marqueurs spécifiques (KIT et FcεRI). Ces cellules montrent clairement la caractéristique de MC pour la dégranulation et augmenter leur [Ca2 +]j’ai en réponse à l’activation de FcɛRI et MRGPR.
MC de signalisation est étroitement lié au niveau dei [Ca2 +] déterminé par libération de Ca2 + des réserves intracellulaires et Ca2 + entrée via les canaux de la membrane plasmique. [Ca2 +] j’ai élévation active un complexe de voies de signalisation intracellulaire cette dégranulation déclencheur MC. Comme dans d’autres cellules non excitables, la Ca2 + afflux voie principale dans la MCs est la SOCE activé par l’épuisement du Ca2 +-stocke. L’identification des canaux impliqués dans cette voie de signalisation est cruciale pour comprendre la régulation de la fonction de MC. Pour l’identification des constituants moléculaires de la voie de la SOCE, la technique de microfluorometric utilisant Ca2 + indicateurs fluorescents et l’approche électrophysiologique « patch clamp » ont joué un rôle de premier plan. Cependant, élévation du [Ca2 +]j’ai niveau est la somme de la libération de Ca2 + et SOCE. Pour distinguer ces deux phases de mobilisation de Ca2 + , le protocole « Ca2 + rajout » (pour examen voir Bird et al. 200820) a été précédemment mis au point. Dans ce protocole, la solution saline externe est passée d’un contenant de normal [Ca2 +]o (1 à 2 mM) à un nominalement Ca2 +-solution sans. Dans ces conditions, les cellules sont traitées avec thapsigargine de vider Ca2 + magasins et ainsi activer complètement SOCE. En l’absence d’extracellulaire Ca2 +, traitement thapsigargine évoque la [Ca2 +]j’ai augmentation transitoire, reflétant une libération d’ions Ca2 + de Ca2 + intracellulaires. Le rajout d’extracellulaire Ca2 + entraîne une augmentation de [Ca2 +]i représentant la SOCE. Dans cet article, nous présentons l’utilisation réussie de cette approche pour la caractérisation de SOCE en MCs. Pour surveiller les [Ca2 +]j’ai modifications, Fura-2 a été utilisé comme un indicateur de calcium. Dans sa forme acétoxyméthyl, Fura-2 peut facilement être chargés dans PMC. L’utilisation de ce colorant ratiométrique permet la comparaison non seulement les amplitudes de [Ca2 +]j’ai altitudes, mais aussi les écarts de basale [Ca2 +]i , qui est particulièrement important pour l’analyse de type sauvage/knockout cellules. Par rapport aux colorants fluorescents génétiquement encodés, un des principaux inconvénients du Fura-2 est son accumulation élevée dans différents organites cellulaires, assurant ainsi la contamination de la fluorescence cytoplasmique.
L’imagerie de Fura-2 nécessite une technique de double excitation. En règle générale, il est techniquement plus facile à utiliser que la technique de double d’émission qui requiert non seulement l’utilisation d’une source lumineuse déclenchée mais en outre la participation d’une roue de filtre ou un séparateur d’image dans le trajet optique de l’émission. Le protocole décrit peut être utilisé pour l’imagerie de Ca2 + d’autres cellules non excitables.
Une fonctionnalité clé des MCs est leur teneur élevée des granules sécréteurs denses aux électrons, qui sont remplis de grandes quantités de médiateurs et substances immunomodulatrices. MC activation conduit à une rapide libération de granules préformés composés. Plusieurs approches pour analyser MC dégranulation in vitro sont disponibles, y compris la détection de la sérotonine radioactive, la détection de l’histamine en utilisant des anticorps (ELISA) et la détection d’une augmentation de l’utilisation de surface de la membrane plasmique mesures de capacité électrophysiologiques « patch clamp » unicellulaires. Dans le présent document, nous décrivons une application pratique de l’analyse à l’aide de puits multiples détection colorimétrique de l' in vitro relâché β-hexosaminidase. Cette analyse est basée sur la capacité des β-hexosaminidase d’hydrolyser la borne N-acétyl-D-hexosamine résidus de N-acétyl-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase est publié conjointement avec l’histamine, mais aussi avec les autres médiateurs telles que la cathepsine D ou TNF et peut donc servir d’un corrélat de dégranulation de plusieurs types de vésicules sécrétrices dans MCs12,22.
Dans la technique décrite, PMC ont été stimulés à 37 ° C avec différents sécrétagogues, suivies d’une estimation des surnageants, mais aussi des granules de β-hexosaminidase contenu par leurs réactions avec le substrat de la β-hexosaminidase. Comme substrat, 4-Nitrophenyl N-acétyl-β-D-glucosaminide a été utilisé. Il est hydrolysé en N-acétyl-D-glucosamine et p- nitrophénol. La quantité de p- nitrophénol a été quantifiée par colorimétrie de l’absorbance légère à 405 nm. Dans certaines modifications de la ß-hexosaminidase version essai, 4-methylumbelliferil-N-acétyl -bêta- glucosamine est utilisé comme substrat. Après hydrolyse enzymatique, la substance génère un composé de manière fluorométrique détectable. Nous avons exprimé l’étendue de la dégranulation en pourcentage de la libération, normalisé au contenu total. Cela nous a permis d’éviter la variabilité introduite par le nombre de cellules différentes et leur contenu granulaire entre diverses préparations de cellules. Nous ne pas soustraire une libération spontanée (observée en l’absence de sécrétagogues MCs) du nette dégranulation stimulée, puisqu’une libération spontanée a été signalée séparément en raison de son importance comme indicateur de la viabilité de la MC. Pour éviter la grande variabilité dans les résultats de titrage, il est important de séparer soigneusement les surnageants et granulés après centrifugation des cellules stimulées. Il est également essentiel pour éviter la formation de toutes les bulles dans les plaques multipuits avant d’effectuer les mesures colorimétriques. Inconvénient de la méthode décrite est que le résultat est représenté non pas comme une valeur absolue, mais sous forme de pourcentage du médiateur libéré.
Contrairement aux méthodes de détection directe de libéré la sérotonine ou l’histamine, le test signalé est beaucoup plus rentable et ne nécessite aucun équipement spécialisé. En outre, la technique décrite est très reproductible, ne doit pas être effectuée dans un laboratoire radioactif et ne nécessite pas l’achat d’anticorps coûteux. Donc, ça pourrait être une excellente alternative aux techniques plus coûteux et plus difficiles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait Julia Geminn d’assistance technique dans la préparation de cellules de mât et de culture. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche Collaborative transrégional (TR-SFB) 152.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
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