Isolering af bughinden-afledte mastceller og deres funktionelle karakterisering med Ca^{2 +}-billedbehandling og degranulering Assays

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere og dyrke murine peritoneal mastceller. Vi også beskriver to protokoller for deres funktionelle karakterisering: en fluorescerende billeddannelse af intracellulære gratis Ca^{2 +} koncentration og en degranulering analysen baseret på kolorimetriske kvantificering af de frigivne β-hexosaminidase.

Abstract

Mast celler (MCs), spiller som en del af immunsystemet, en afgørende rolle i forsvaret vært mod flere patogener og i indledningen af den allergiske immunrespons. Aktivering af MCs via cross-linking for overflade IgE bundet til høj affinitet IgE receptor (FcεRI), samt gennem stimulering af flere andre receptorer, initierer stigningen i de gratis intracellulære Ca^{2 +} niveau ([Ca^{2 +}]_jeg) der fremmer frigivelse af allergiske og inflammatoriske mediatorer. Identifikation af molekylære vælgere involveret i disse signaling veje er afgørende for at forstå reguleringen af MC funktion. I denne artikel vil beskrive vi en protokol til isolering af murine bindevæv type MCs ved peritoneal lavage og dyrkning af peritoneal MCs (PMCs). Kulturer af MCs fra forskellige knockout musemodeller af denne metode repræsenterer en nyttig metode til identifikation af proteiner involveret i MC signalering veje. Derudover vi også beskrive en protokol for enkelt celle Fura-2 imaging som en vigtig teknik til kvantificering af Ca^{2 +} signalering i MCs. fluorescens-baseret overvågning af [Ca^{2 +}]_jeg er en pålidelig og almindeligt anvendte tilgang til studere Ca^{2 +} signalering begivenheder, herunder butik-drevet calcium indrejse, der er af allerstørste betydning for MC aktivering. For analyse af MC degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release assay. Mængden af β-hexosaminidase udgivet i dyrkningsmediet betragtes som en degranulering markør for alle tre forskellige sekretoriske delmængder beskrevet i MCs. β-hexosaminidase kan nemt kvantificeres ved dets reaktion med en colorigenic substrat i en mikrotiter plade kolorimetriske assay. Denne meget reproducerbare teknik er omkostningseffektiv og kræver ingen specialiseret udstyr. Alt i alt den angivne protokol viser et højt udbytte af MCs udtrykker typisk MC overflade markører, viser typiske morfologiske og fænotypiske træk ved MCs, og demonstrere meget reproducerbare svar til secretagogues i Ca^{2 +}- billedbehandling og degranulering assays.

Introduction

MCs spiller en fremtrædende rolle i medfødte og erhvervede immunrespons. Specifikt, MCs deltage i aflivning af patogener, som bakterier og parasitter, og også forringe potentielt giftige endogene peptider eller komponenter af venoms (for anmeldelse Se Galli et al. 2008¹). Den fysiologiske rolle af MCs i medfødte og adaptive immunitet er genstand for heftig debat. Derfor kræver de mange data uoverensstemmelser i undersøgelser udført med forskellige MC-mangelfuld musemodeller en systematisk revurdering af immunologiske funktioner af MCs ud over allergi². Modne MCs er for det meste lokaliseret i væv og organer som hud, lunge og tarmen, og findes normalt kun i små mængder i blodet. MCs skyldes hæmatopoietisk prækursorer, som MC progenitorceller, og fuldføre deres differentiering og modning i microenvironments af næsten alle vaskulariserede væv¹. T-celle-afledte faktor interleukin (IL) -3 fremmer selektivt levedygtighed, spredning og differentiering af musen MCs pluripotente indbyggere fra deres hæmatopoietisk stamfaderen³. Stem cell faktor (SCF) er produceret af strukturelle celler i væv og spiller en afgørende rolle i MC-udvikling, overlevelse, migration, og funktionen⁴. Egenskaberne for individuelle MCs kan variere afhængigt af deres evne til at syntetisere og gemme forskellige proteaser eller proteoglycaner. I mus, de såkaldte bindevæv-type MCs adskiller sig fra slimhinden MCs efter deres anatomiske lokalisering, morfologi og indhold af heparin og proteaser⁵.

I MCs, en stigning på gratis cytosole Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_jeg) er uundværlig for degranulering og produktion af eicosanoider, samt for syntesen af cytokiner og aktivering af transkriptionsfaktorer svar på antigen og forskellige secretagogues⁶. En større downstream mål for disse stimuli er fosfolipase C, som hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverer protein kinase C og IP3 frigiver ioner af Ca^{2 +} fra det endoplasmatiske reticulum. Nedbrydning af disse butikker aktiveres Ca^{2 +} tilstrømning gennem plasmamembran Ca^{2 +} kanaler, fører til at lagre drives calcium post (SOCE). Denne proces er fremkaldt gennem samspillet af Ca^{2 +}-sensor, stromale interaktion molekyle-1 (Stim1), i det endoplasmatiske reticulum med Orai1⁷ samt gennem aktivering af forbigående receptor potentielle kanoniske (TRPC) kanal proteiner (til gennemgang Se Freichel et al. 2014⁸) i plasma membranen.

For at studere anvendes den fysiologiske rolle af disse kanaler, flere farmakologiske (anvendelse af kanal blokkere) eller genetiske metoder typisk. I sidstnævnte tilfælde undertrykkelse af protein udtryk er opnået ved at målrette mRNA (knockdown) eller genomisk DNA redigering med globale eller væv-specifikke⁹ sletning af en exon kodning en pore danner underenhed af en kanal (knockout). En blokering med tilstrækkelig specificitet for disse kanaler er begrænset. Desuden, det knockdown tilgang kræver omhyggelig kontrol af dens effektivisering bruger, fx., vestlige duppes analyse, og hæmmes af utilgængelighed af specifikke antistoffer for målrettede kanal protein i mange tilfælde. Brugen af knockout musemodeller er således stadig betragtes som guldstandarden for en sådan analyse. Foretrukne i vitro model for undersøgelsen af MC funktioner er dyrkning af PMCs, der kan være isolerede ex vivo som en fuldt moden befolkning (i modsætning til skelne MCs i vitro fra, fx., knoglemarv celler)¹⁰ . I forhold til knoglemarven afledt MCs (BMMCs), som er også almindeligt anvendt til at studere MC funktion i vitro, stimulation af FcεRI og beta-hexosaminidase er udgivelse øget 8-fold og 100 i PMCs, henholdsvis. I denne artikel vil beskrive vi en metode til isolering og dyrkning af murine PMCs, som giver mulighed for at få efter 2 uger af dyrkning af et stort antal af ren bindevæv Skriv MCs, tilstrækkelige til yderligere analyse.

Trods de seneste fremskridt i udviklingen og anvendelsen af genetisk kodet calcium indikatorer, er deres forbrug stadig begrænset af vanskeligheder i levering af gener til target-cellerne, specifikt i højt specialiserede celler som primære kulturperler MCs. Desuden, mangler denne gruppe af fluorescerende indikatorer for [Ca^{2 +}]_jeg målinger stadig ratiometric farvestoffer med et højt dynamikområde. Af disse grunde er den foretrukne metode til måling af ratiometric [Ca^{2 +}]_jeg stadig brugen af de fluorescerende farvestof "Fura-2"¹¹.

I øjeblikket mest anvendte almindeligt metode til evaluering af MC aktivering og degranulering er måling af β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk mægler, er en af komponenterne MC granula, der er co-løst med histamin i konstant andel fra MCs¹². Β-hexosaminidase kan let og præcist målt gennem dets reaktion med et specifikt substrat, som producerer en målelig mængde af et colorigenic produkt, der let kan påvises i en mikrotiterplade kolorimetriske assay. I denne artikel rapporteres en anvendelse af denne teknik til analyse af PMCs degranulering som svar på en lang række stimuli.

Sammenlægning af høj-affinitet plasmalemmal IgE receptor (FcɛRI) aktiveres i MCs en alsidig intracellulære signalvejen, fører til en frigivelse af sekretoriske granulet indhold i det omgivende ekstracellulære rum. Ud over den specifikke antigen, mange andre stimuli kan aktivere MCs for at frigive en alsidig vifte af immunmodulerende mæglere, som supplerer anaphylatoxins (fx., C3a og C5a)¹³, vasokonstriktor peptid endothelin 1 (ET1)¹⁴ , som godt som mange kationiske stoffer og stoffer provokere pseudoallergic reaktioner (fx., icatibant)¹⁵ ved binding til MRGPRX2¹⁶. Intracellulær signalering veje involveret i MRGPR-induceret MCs degranulering karakteriseres dårligt i forhold til FcɛRI-medieret intracellulær signalering; disse veje kun begyndte at blive intensivt undersøgt i løbet af de sidste par år¹⁷ efter receptor identifikation¹⁶. I vid udstrækning, fortsat plasma membran Ionkanaler involveret i calcium post efterfulgt af MRGPRX2 stimulation skal forstås. Derfor, denne artikel fokuserer også på intracellulære calcium signalering og degranulering af MCs stimuleret med MRGPR agonister.

Protocol

Alle dyr procedurer blev udført Ifølge tysk lovgivning retningslinjer for pleje og brugen af forsøgsdyr (officielt godkendt af det regionale råd for Karlsruhe).

1. PMC isolering og dyrkning af Intraperitoneal Lavage

1	Ice
2	10 mL sprøjter
3	27 G nåle
4	20 G nåle
5	Styrofoam blok og pins
6	Indsamling rør (50 mL plastik centrifugeglas)
7	70% ethanol
8	RPMI Medium (Pre kølet og opbevares på is)
9	PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (føtalt kalveserum) + 1% Penicillin Streptomycin løsning (Pen-Strep)
10	Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning - DPBS (uden Ca2 + og Mg2 +)
11	Kultur kolber (25 cm)
12	Vækstfaktorer lager løsninger (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Serologisk pipetter (10 mL)
14	Pipetter tips sterile (20 – 200 µL)
15	Hemocytometer
16	Bænk Centrifuge
17	Saks og pincet
18	CO2 afdeling for mus
19	Åbne steril hætte
20	Lukket steril hætte
21	Celle inkubator (37 ° C og 5% CO2)
22	Overføre pipetter (20 – 200 µL)

Tabel 1: Materialer til trin 1.

1. PMC isolation af intraperitoneal lavage
   1. Forud den celle isolation, udarbejde de i tabel 1anførte materialer.
   2. Bruge 8 til 14 uger gamle mandlige mus til PMC isolation. Aflive en mus af CO₂ indånding, og bekræft død ved tab af reflekser. Spray musen med 70% ethanol og ordne det på en skum blok ved hjælp af stifter (dorsale side ned). Fjerne den ventrale hud af musen bruger stump kant saks. Undgå at beskadige bughulen.
      Bemærk: Vi bruger typisk denne protokol for mus med en C57BL/6N stamme genetiske baggrund.
   3. Injicere 7 mL iskold RPMI medium og 5 ml luft i bughulen bruger en 10 mL sprøjten udstyret med en 27 G kanyle. Skubbe nålen omhyggeligt i bughinden og ikke perforere enhver organer. Bruge et sted i regionen i epididymis fedt for at reducere risikoen for et orgel perforering.
   4. Efter injektion, ryste musen til 1 min at løsrive peritoneal celler i RPMI medium. Ryst ikke musen også kraftigt for at undgå skader på indre organer og forurener bughulen med blod.
   5. Genbruge 10 mL sprøjte ved at udstyre det med en ny 20 G kanyle. Skift de indre organer til den ene side ved at vippe skum blok og forsigtigt trykke det på bænken at gøre mellemlang aspiration lettere fra anden siden. Indsætte en 20 G kanyle, facet op og Opsug væsken fra maven blidt og langsomt (~0.5 mL/s) for at undgå tilstopning af de indre organer. Indsamle så meget væske som muligt (typisk 5 – 6 mL).
   6. Fjerne nål fra sprøjten og overføre de indsamlede cellesuspension i en collection tube på is. Kassere et prøveglas, hvis der er synligt blod forurening.
   7. Der centrifugeres rør med cellesuspension ved ~ 300 x g i 5 min. Under en steril hood aspirat supernatanten. For hver mus, kombinere prøve træpiller i 4 mL koldt (4-10 ° C) PMC Medium og overførsel af cellesuspension til en 25 cm² kultur kolbe. Tilføje vækstfaktorer IL-3 og SCF til endelige koncentrationer 10 ng/mL og 30 ng/mL, henholdsvis. Kolben anbringes med cellerne i en inkubator (37 ° C og 5% CO₂) og Inkuber i ~ 48 h indtil den næste procedure.
2. PMC kultur
   1. Dag 2 (~ 48 h efter isolation): Medium forandring
      1. Hvis du vil fjerne Aspirér supernatanten og ikke-tilhænger cellerne (erytrocytter og døde celler), medium fra kolben ved at placere en Pasteur pipette tip på kanten af kolben og holde kolben næsten vandret. Der tilsættes 4 mL pre varmede PMC Medium pr. mus. Tilføje vækstfaktorer IL-3 (10 ng/mL) og SCF (30 ng/mL). Kolben anbringes med cellerne i en inkubator (37 ° C og 5% CO₂).
   2. Dag 9: Celle opdeling
      1. Overføre cellesuspension fra celle kultur kolbe i en plastik 50 mL-centrifugerør. Vask kolben tre gange med 10 mL pre varmede (37 ° C) Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS), indsamle cellesuspension med fritliggende celler i de samme 50 mL plastik centrifugeres tube. Tælle celle koncentration af en hemocytometer, og beregne det samlede antal celler.
      2. Centrifugeres cellesuspension ved ~ 300 x g i 5 min og Opsug supernatanten. Genskab pellet i pre varmede PMC Medium (37 ° C) til at opnå celle koncentration 1 x 10⁶ celler/mL. Overføre cellesuspension til en ny 25 cm² kultur kolbe. Kassér den gamle kolbe med fibroblaster vedhængende til bunden.
      3. Tilføje vækstfaktorer IL-3 (10 ng/mL) og SCF (30 ng/mL), og kolben anbringes med cellerne i en inkubator (37 ° C og 5% CO₂).
   3. Dage 12-15: celle målinger
      1. Hvis eksperimenter med stimulation af FcɛRI receptorerne er planlagt, forbehandle celler natten med 300 ng/mL af IgE anti-DNP i standard næringssubstratet. Fortsæt med trin 2 eller trin 3.

2. fluorometriske intracellulære gratis Calcium koncentrationsmåling i PMCs

1. Før målingerne, forberede de i tabel 2anførte materialer. Også, forberede en Imaging Setup består af: inverteret fluorescens mikroskop; Mål: 40 X / 1.3 olie; Fura 2 Filter Set; CCD kamera; Excitation lyskilde; Imaging erhvervelse Program; Tyngdekraft fodret løsning ansøgningssystem.

1	PMC (12-15 dage gammel) 1 x 106 celler/mL
2	Concanavalin Andersen
3	Fura-2 AM
4	Pluronic F-127 20% opløsning
5	Dæksel glider briller runde; ø 25 mm; No. 1
6	DNP-HSA (dinitrophenol-human serum albumin) stamopløsning
7	Anti-DNP-antistof (IgE) stamopløsning
8	Flad bundplade (12 brønde)
9	Sammensatte 48/80 stamopløsning
10	Dække godt Imaging kamre
11	Hemocytometer
12	Overføre pipetter (20 – 200 µL)

Tabel 2: Materialer til trin 2.

2. Fura-2 imaging forberedelse
   1. Udføre en celletal, ved hjælp af en hemocytometer og justere den celle koncentration til 1 x 10⁶ celler/mL. Split PMCs kolonier af forsigtigt pipettering (3-5 gange) cellesuspension med 1 mL pipette spids.
   2. Forberede en Ca^{2 +}-indeholdende HEPES buffered saltopløsning (Ca^{2 +}- HBSS) sammensat af 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES og 12 mM glukose. PH indstilles til 7.4 med 3 M NaOH.
   3. Forberede concanavalin A belagt dias af pipettering 1 dråbe af concanavalin A løsning (0,1 mg/mL i H₂O) på hver 25 mm runde dækning glas under en steril hætte. Lader dråberne på cover følgesedler for mindst 1 min, så fjerne de fleste af løsningen med en pipette og lad dæksel glider lufttørre for 45 min. Tryk omhyggeligt på concanavalin A behandlet dæksel glider på gummi imaging kammer (Se Tabel af materialer) indtil de lægger for at få mikroskopi imaging kamre.
      Bemærk: Poly-L-lysin belagt dias kan bruges som et alternativ.
   4. Opløse den fluorescerende Ca^{2 +} farvestof Fura-2 AM (1 mM) i dimethylsulfoxid (DMSO). Gemme denne opløsning, beskyttet mod lys.
   5. Fortynd Fura-2 AM stamopløsning i Ca^{2 +}- HBSS til en endelig koncentration på 5 µM for at forberede "loading bufferen". Supplere med 5 µL/mL 20% pluronic F-127 i DMSO.
   6. Mix 500 µL af "loading bufferen" med 500 µL af PMC cellesuspension. Der afpipetteres blandingen i den billeddiagnostiske afdeling og Inkuber celler for 20-30 min. ved stuetemperatur i mørke.
   7. Oprette tyngdekraft fodret ansøgningssystem med forskellige løsninger efter stimulation protokol. Supplere sprøjte 1 med 40 mL af Ca^{2 +}- HBSS løsning, sprøjten 2 med 40 mL af Ca^{2 +}- HBSS løsning indeholdende 100 ng/mL DNP, sprøjten 3 med 40 mL af Ca^{2 +}- HBSS løsning indeholdende 50 µg/mL sammensatte 48/80, sprøjten 4 med 40 mL nominelt Ca^{2 +}-gratis-HBSS løsning, og sprøjten 5 med 40 mL af nominelt Ca^{2 +}-gratis-HBSS løsning indeholdende 2 µM Thapsigargin.
   8. Forberede en 40 X høj-blænde oliebestandighedsobjektet ved at placere en lille dråbe immersionsolie på det.
   9. Montere ansøgningssystemet på scenen i den omvendte mikroskop. Sætte imaging salen med indlæst celler i programmet system og sikre det for at forhindre bevægelse under optagelsen. Tænd den gennemlysning og fokusere cellerne.
   10. Skyl cellerne tre gange med Ca^{2 +}- HBSS buffer ved hjælp af tyngdekraft fodret ansøgningssystem.
   11. Inkuber celler i Ca^{2 +}- HBSS for 5 min til Fura-2 AM nedtrapning esterificering.
   12. Skyl cellerne en gang før start imaging, hvis du vil fjerne alle potentielt lækket fluorescerende farvestof.
3. Celle imaging
   1. Starte programmet imaging erhvervelse i fysiologiske erhvervelse mode. Åbn opsætningsvinduet af, og justere fokus og optimal erhvervelse tid (som bør være ens for excitation med 340 nm og 380 nm og typisk svinger mellem 50-150 ms).
      Bemærk: Minimere eksponeringen af Fura-2 indlæst celle til noget lys til at undgå photobleaching af farvestoffet.
   2. Billedet en reference billede, og Marker cellerne som regioner af interesse (ROI). Markere det sidste ROI i et område, hvor ingen celler er til stede og definere det som baggrund.
   3. Fuldføre opsætningen og start måling med en 5 s erhvervelse sats.
      Bemærk: Cellerne vil være skiftevis belyst med excitation lys 340 nm og 380 nm, og den udsendte fluorescens (> 510 nm) vil blive indsamlet ved hjælp af CCD-kamera. Billeder af fluorescens signaler F340 nm og F380 nm samt ratio (F340 nm/F380 nm) vises i tre vinduer. Diagrammer af tiden løbet af individuelle ROIs fluorescens intensitet betyde værdier vil også løbende vises.
   4. Tilføje løsninger på ordentlig cyklus antallet ifølge design af forsøget:
      1. Til foranstaltning antigen-induceret elevation af [Ca^{2 +}]_jeg, som illustreret i fig. 2, 2B, anvende sprøjte 2 løsning efter cyklus 20, og stop optagelse efter cyklus 150.
      2. For at måle sammensatte 48/80-induceret elevation af [Ca^{2 +}] anvende_jeg,som illustreret i figur 2C, sprøjte 3 løsning efter cyklus 20, og stop optagelse efter cyklus 150.
      3. For at måle elevation af [Ca^{2 +}]_jeg fremkaldt af SOCE, som illustreret i figur 2D, anvende sprøjte 4 løsning efter cyklus 10, anvende sprøjte 5 løsning efter cyklus 70, anvende sprøjte 4 løsning efter cyklus 120, anvende sprøjte 1 løsning efter cyklus 150, og stoppe registreringen efter cyklus 220.
   5. Efter endt måling, konvertere resultaterne til en ratio-tabel, der indeholder de målte intensiteter for både excitation bølgelængder med og uden baggrundskorrektion, såvel som ratio værdierne med og uden baggrundskorrektion for hver ROI og hver gang målepunkt. I programmet erhvervelse fortløbende tryk knapper: "start cutter", "Marker alle", "konvertere alle", "fysiologi målinger", "Ok,"Ok". Gemme filerne som tabeller og billedstakke til off-line analyse.

3. beta-hexosaminidase Release måling i PMCs

1	PMC (12-15 dage gammel) 1 x 106 celler/mL
2	Anti-DNP-antistof (IgE) stamopløsning
3	DNP-HSA stamopløsning
4	Sammensatte 48/80 stamopløsning
5	Ionomycin
6	96-brønd plade, v-formet bund
7	96-brønd plader, flad bund
8	Plast centrifugeglas (15 mL)
9	Serologisk pipetter
10	Celle inkubator (37 ° C og 5% CO2)
11	Bænk Centrifuge
12	Mikrotiter-Pladelæser til optiske densitet målinger
13	Multikanalpipette (20 – 200 μl)
14	Hemocytometer

Tabel 3: Materialer til trin 3.

1. Før målingerne, forberede de materialer, der er anført i tabel 3.
   Bemærk: hydrolyserer β-hexosaminidase frigivet fra MCs efter deres stimulation p-nitrophenylfosfat-acetyl-D-Glukosamin (pNAG) ind i p-nitrofenol og N-acetyl-D-Glukosamin. Mængden af β-hexosaminidase i prøven er proportional med mængden af p-nitrofenol, der vil blive dannet. I en høj pH-værdi miljøet af "stopopløsning", p-nitrofenol eksisterer som fuldt deprotonated p-nitrophenolat og kan påvises ved dets lys absorbans ved 405 nm.
2. Forberede Tyrodes løsning indeholdende 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukose og BSA 0,1%. PH indstilles til 7.4 med 3 M NaOH.
3. Forberede lysis løsning ved at tilføje en 1% volumen af Triton X-100 Tyrodes løsning.
4. Forberede den stopopløsning bestående af 200 mM glycin og ph indstilles til 10,7 med NaOH.
5. Forberede pNAG løsning (4-nitrophenylfosfat 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) løsning ved at opløse pNAG i 0,4 M citronsyre til en endelig koncentration på 4 mM.
6. Beregningen af de celler, der er nødvendige for assayet (udføre analysen i to eksemplarer). Bruge 200.000 PMCs pr. brønd. Bruge 2 brønde som negative kontroller (Tyrodes løsning uden nogen secretagogues som DNP eller sammensatte 48/80) og 2 brønde som positive kontroller (Tyrodes løsning med 10 µM Ionomycin) for hver genotype.
7. Overføre cellerne i en 15 mL plastik centrifugerør, justere lydstyrken på 15 mL med Tyrodes løsning og centrifugeres ved 200 x g 4 min. Fjern supernatanten med Pasteur pipette og resuspend celler i Tyrodes løsning til 2 x 10⁶ celler /mL.
8. Overfør 100 µL af cellesuspension pr. brønd til en 96-brønd V-bund godt plade. Tilsæt 25 µL af enten stimulation eller betjeningsløsning til hver brønd (ifølge pipettering ordningen illustreret i fig. 3A). Inkuber celler for 45 min. ved 37 ° C og 5% CO₂.
9. Reaktionen standses ved at placere den 96-brønd plade i isbad i 5 min. Derefter centrifugeres plade ved 4 ° C i 4 min på 120 x g. Overføre 120 µL af supernatanten ved hjælp af en multikanalpipette til en flad bund 96-brønd plade og placere den på is. Omhyggeligt undgå at berøre celle pellets, men helt Aspirér supernatanten.
10. Tilføj 125 µL af lysisbuffer til celle pellets. Inkuber celle pellets i 5 min ved stuetemperatur og resuspend dem efter inkubation ved gentagne pipettering (ca 5 gange).
11. Der afpipetteres 25 µL af pNAG løsning (4 mM) i de krævede wells af en ny flad bund 96-brønd plade. Tilføj 25 µL fra hver supernatanten til rede pNAG løsning samt 25 µL af hver celle lysate.
12. Inkuber reaktion partier i 1 timer ved 37 ° C. Tilsæt 150 µL stopopløsning til hver brønd reaktionen standses efter inkubation.
13. Analysere pladen med en mikrotiterplade reader bruger en indstilling for dual-bølgelængde på 405 nm med reference 630 nm for automatiske baggrund subtraktion. I programmet erhvervelse kryds "Reference" og vælg i menuen "Absorbans" program element "630 nm" fra drop-down listen. Hvis Ekstinktionen af prøverne er for høj, laves en passende fortynding af sonden før genopmåling.
14. Beregne procentdelen af β-hexosaminidase frigivelse efter følgende ligning:
    
    hvor udgivelse [%] er procent af særlige beta-hexosaminidase udgivelse, en [supernatanten] er baggrunden korrigeret absorption af supernatanten, og en [lysate] er baggrunden korrigeret absorption af den tilsvarende celle lysate.

Representative Results

PMCs blev isoleret fra 3 vildtype mus (C57BL/6N) af intraperitoneal lavage og yderligere kultiveret i RPMI medium suppleret med 20% FCS og 1% Pen-Strep i overværelse af vækstfaktorer (IL-3 ved 10 ng/mL) og SCF på 30 ng/mL i sterilt fugtet betingelser på 37 ° C og 5% CO₂. Mediet blev ændret på dage 2 og 9 efter celle isolation. Celle morfologi blev analyseret ved hjælp af transmission lys DIC imaging (Se figur 1A, B). Celle kontrast og granulering demonstreret god cellernes levedygtighed. Efter 2 uger af dyrkning af disse betingelser, blev der opnået en homogen population af 1.5 x 10⁷ celler. Flow flowcytometri analyse af celler Co farves med anti-IgE antistof konjugeret med FITC og Anti-c-Kit antistof konjugeret med PE afslørede 98,6% af FITC positive og 99,8% PE positiv celler (figur 1C). 98,5% af de dyrkede celler var dobbelt positive for FITC og PE (figur 1C), viser typiske funktioner af modne MCs.

For yderligere funktionel analyse af de opnåede celler, blev fluorometriske [Ca^{2 +}]_jeg målinger ved hjælp af Fura-2 fluorescerende indikator udført. Fura-2 indlæst celler var skiftevis belyst med 340 nm og 380 nm excitations lys hver 5 s og fluorescens > 510 nm blev registreret ved hjælp af en CCD kamera. Forholdet mellem fluorescens (F340/F380) var konstant overvåget. Anvendelse af DNP (100 ng/mL) til PMC inkuberes natten over med 300 ng/mL af IgE anti-DNP fremkaldte en markant udvidelse af den [Ca^{2 +}]_jeg , der langsomt henfaldet til sin halv maksimale over flere minutter (figur 2A, B). Variation af celle svar var relativt lavt (figur 2A, B). Stimulation af MRGPRB2 receptorerne med 50 µg/mL af sammensatte 48/80 med den samme tid protokol steg også betydeligt [Ca^{2 +}]_jeg i Fura-2-loaded PMCs med en meget lignende gennemsnitlige amplitude af svar (figur 2C). For analyse af SOCE i PMCs, en "fornyet tilsætning" protokol blev anvendt: 10 cykler efter begyndelsen af målingen, eksterne Ca^{2 +} blev fjernet, og i løbet af cykler 70-120, Thapsigargin (2 µM), en hæmmer af endoplasmatiske reticulum ATPase, var anvendes for nedbrydningen af intracellulære Ca^{2 +} butikker og for maksimal aktivering af SOCE. Den forbigående [Ca^{2 +}]_jeg elevation afspejles Ca^{2 +} release fra de intracellulære Ca^{2 +} butikker i et nominelt Ca^{2 +}-gratis bad løsning (figur 2D). Genskabe den eksterne Ca^{2 +} koncentration til 2 mM efter cyklus 150 resulterede i en fremtrædende stigning af [Ca^{2 +}]_jeg niveau som følge af Ca^{2 +} tilstrømning gennem SOCE kanalerne (figur 2D). Denne komponent af Ca^{2 +} svar var stærkt hæmmet i overværelse af 10 µM GSK 7975A, kendt som en CRAC blocker, hvorimod Ca^{2 +} release fra de intracellulære Ca^{2 +} butikker forblev uændret (figur 2D ).

I det næste skridt, vi har testet de isolerede PMCs evne til at gennemgå degranulering crosslinking af FcɛRI høj affinitet receptorer eller stimulation af MRGPRB2 receptorerne. Til dette formål, blev en β-hexosaminidase release analyse udført. Cellerne blev tilføjet til en V-bund 96-brønd plade (2 x 10⁵ celler/brønd) og stimuleret ifølge ordningen illustreret i figur 3A i 45 min. ved 37 ° C. Pladen var centrifugeres og efter fjernelse af supernatanten, pellets var mængden. ß-hexosaminidase indhold af individuelle supernatanter og pellet lysates blev analyseret af deres reaktioner med pNAG under en 1 h inkubation ved 37 ° C. Størrelsen af reaktionsprodukter blev fundet kolorimetrisk og andelen af det udgivne ß-hexosaminidase blev beregnet (Se figur 3B). Den spontane release var meget lavt (1%), mens svarene på stærk degranulering stimuli som 10 µM Ionomycin og sammensatte 48/80 på 50 µg/mL blev over 40% og 60%, henholdsvis. Degranulering svar til DNP stimulation blev dosisafhængig over koncentrationsinterval af 10 – 300 ng/mL. Sammen, viser disse data klart en god funktionel tilstand af de isolerede PMCs.

Figur 1 : Karakterisering af primære kulturperler murine vildtype PMCs udføres ved hjælp af DIC mikroskopi og flow flowcytometri analyse. (A, B) Repræsentative billeder fremstillet ved hjælp af 20 X plasDIC mål af PMCs kulturperler i 25 cm² plastik flasker 1 h efter celle isolation af intraperitoneal lavage (A) og på dag 9 af dyrkningsbaserede (B). Skala barer i højre nederste hjørne viser 100 µm. (C) Flow flowcytometri analyse af PMCs (kulturperler 12 dage efter det ovenfor beskrevne protokol) Co farves med anti-IgE antistof konjugeret med Fluorescein isothiocyanat (FITC) og Anti-c-kit antistof konjugeret med Phycoerythrin (PE). Celle tæthed plot er opdelt i fire kvadranter: Q1, PE ovenfor autofluorescence niveau/FITC under autofluorescence niveau; Q2, PE ovenfor autofluorescence niveau/FITC ovenfor autofluorescence niveau; Q3, PE under autofluorescence niveau/FITC under autofluorescence niveau; Q4, PE under autofluorescence niveau/FITC ovenfor autofluorescence niveau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Optagelse af [Ca^{2 +}] _jeg i Fura-2 indlæses PMCs isoleret fra vildtype mus. [Ca ^{2 +} ],_jeg præsenteret som fluorescens F340/F380 ratio. (A) repræsentative spor af [Ca^{2 +}]_jeg tid løbet af individuelle PMCs (n = 38) stimuleres med DNP (100 ng/mL). (B) tid løbet af DNP (100 ng/mL)-fremkaldte [Ca^{2 +}]_jeg elevation. Hvert datapunkt viser middelværdier udvundet 38 individuelle celler illustreret i panelet A. PMCs var forbehandlet natten med 300 ng/mL af IgE anti-DNP. (C) tidsforløb af middelværdier af sammensatte 48/80-induceret [Ca^{2 +}]_jeg elevation i PMCs (n = 60). (D) gang løbet af middelværdier af [Ca^{2 +}]_jeg ændringer under intracellulære Ca^{2 +}-gemme udtynding induceret ved anvendelse af 2 µM Thapsigargin (Tg) i nominelt Ca^{2 +}-gratis løsning, efterfulgt af butik drives calcium tilstrømning efter fornyet tilsætning af 2 mM Ca^{2 +} i Bad løsning i kontrolgruppen (n = 44) af PMCs (sorte firkanter) og 10 µM af GSK 7975A i Bad løsning (blå firkanter) (n = 41). I B, C og D viser fejllinjer standardafvigelsen på middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Beta-hexosaminidase frigive kolorimetriske multi godt målinger foretaget med PMCs isoleret fra vildtype mus. (A) Stimulation ordning af 96-brønd plade pipettering til udførelse af beta-hexosaminidase analysen; Resultaterne præsenteres i panelet B. "lige" svarer til Pipettering af Tyrodes løsning uden tilsætning af nogen secretagogues; IM = Ionomycin; CP 48/80 = sammensatte 48/80. (B) Bar graf illustrerer procentdel af ß-hexosaminidase udgivelse under basale forhold (Spont), efter stimulation med Ionomycin (IM), dinitrophenol-human serum albumin (DNP) og sammensatte 48/80 (Cp 48/80) med angivne koncentrationer. Analysen blev udført i to eksemplarer; fejllinjer Vis standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

MC modeller kan med held anvendes til at studere MC degranulering, chemotaxis, vedhæftning samt belyse intracellulær signalering transduktion veje involveret i MC aktivering. Nogle forskere brug menneskelige MCs modeller, som udødeliggjort linjer (LAD2 og HMC1) eller menneskelige MCs afledt af ledning blod stamceller (CD133 +) og perifert blod stamceller (CD34 +). Andre foretrækker gnaver MC modeller, såsom udødeliggjort (rotte baserig leukæmi RBL - 2H 3 MC linje) eller primære kulturperler (mus knogle-marv-afledte MCs BMMCs, PMCs) modeller. Murine primære MCs kan bruges til at analysere MC funktion i mange "knock-out" musemodeller, som er guld standard tilgang til udforskning af fysiologiske funktioner af bestemte gener og kodet proteiner. Underskud af farmakologiske værktøjer til tilstrækkelig selektivitet og potens gør denne metode særligt værdifulde til undersøgelse af mekanismer af signaltransduktion af MC aktivering¹⁸. Murine PMCs er af bindevæv fænotype, der udviser en moden morfologi og høj nøjagtighed. De reagerer ikke kun godt til antigen crosslinking af FcεRI som BMMCs, men også aktiveres ved agonister flere ekstra receptorer som endothelin 1 eller sammensatte 48. Men udbyttet af PMCs er typisk væsentligt lavere i forhold til BMMCs og er normalt ikke tilstrækkeligt til at udføre en vestlige skamplet eller en anden teknik, der kræver et stort antal celler. Flere teknikker er blevet beskrevet til isolering og oprensning af PMCs. For eksempel, blev Percoll gradient centrifugering rapporteret til at give en høj renhed af celler¹⁹; antallet af celler, der opnås med denne teknik er dog typisk relativt lavt. I protokollen beskrevet her, er den mest kritiske trin aspiration af cellesuspension fra bughulen. Undgå blod kontaminering af prøven og sugning medium muligt maksimal mængde er afgørende for at opnå et højt antal PMCs af høj renhed. Med nogle mus stammer, en maksimal PMC antallet opnås kun ved en forkortet (11-12 dage) dyrkningsbaserede periode. Forlader disse celler i dyrkningsbetingelserne for længere tid fører kun til en reduktion af celle nummer.

I nuværende undersøgelse, vi beskriver en enkel protokol egnet til isolering af modne MCs, der gør det muligt at opnå en meget ren MC befolkning fra mus bughulen. De opnåede celler er karakteriseret ved en høj ensartethed og udviser typiske MC funktioner, som udtryk for specifikke markør receptorer (KIT og FcεRI). Disse celler klart udstille MC kendetegnet for at degranulate og øge deres [Ca^{2 +}]_jeg som svar på FcɛRI og MRGPR aktivering.

MC signalering er tæt relateret til den [Ca^{2 +}]_jeg niveau bestemt af Ca^{2 +} release fra intracellulære butikker og Ca^{2 +} post via plasma membran kanaler. [Ca^{2 +}] _jeg elevation aktiverer et kompleks af intracellulær signalering veje at udløse MC degranulering. Som i andre ikke-overgearet celler, den vigtigste Ca^{2 +} tilstrømning pathway i MCs er SOCE aktiveres af nedbrydningen af Ca^{2 +}-butikker. Identifikation af de kanaler, der er involveret i denne signalvejen er afgørende for at forstå reguleringen af MC funktion. For identifikation af molekylære bestanddele af SOCE vej, microfluorometric teknikken udnytter fluorescerende Ca^{2 +} indikatorer og "patch-klemme" elektrofysiologiske tilgang har spillet en fremtrædende rolle. Udvidelse af [Ca^{2 +}]_jeg niveau er dog summen af Ca^{2 +} release og SOCE. For at skelne disse to faser af Ca^{2 +} mobilisering, var den såkaldte "Ca^{2 +} ny tilføjelse"-protokol (for anmeldelse Se fuglen et al. 2008²⁰) tidligere udviklet. I denne protokol, den eksterne saltopløsning er skiftet fra én, der indeholder normale [Ca^{2 +}]_o (1-2 mM) til et nominelt Ca^{2 +}-gratis løsning. Under disse forhold behandles cellerne med thapsigargin at tømme Ca^{2 +} butikker og dermed fuldt aktivere SOCE. I mangel af ekstracellulære Ca^{2 +}fremkalder thapsigargin behandling transiente [Ca^{2 +}]_jeg højden, afspejler en frigivelse af Ca^{2 +} ioner fra intracellulære Ca^{2 +} butikker. Fornyet tilsætning af ekstracellulære Ca^{2 +} fører til en stigning i [Ca^{2 +}]_jeg repræsenterer SOCE. I denne artikel præsenterer vi en succesfuld udnyttelse af denne tilgang til karakterisering af SOCE i MCs. For at overvåge [Ca^{2 +}]_jeg ændringer, blev Fura-2 brugt som en indikator for calcium. I sin acetoxymethyl form, kan Fura-2 nemt blive indlæst i PMCs. Brugen af dette ratiometric farvestof giver mulighed for sammenligning af ikke kun amplituder af [Ca^{2 +}]_jeg stigninger, men også forskelle i basal [Ca^{2 +}]_jeg niveauer, hvilket er særlig vigtigt for analysere vildtype/knockout celler. Sammenlignet med genetisk kodet fluorescerende farvestoffer, en af de største ulemper ved Fura-2 er dens høje ophobning i forskellige cellulære organeller og dermed forurening af cytoplasmatisk fluorescens.

Fura-2 imaging kræver en dobbelt excitation teknik. Det er typisk teknisk meget lettere at bruge end den dobbelte emission teknik, der kræver ikke kun brugen af en udløst lyskilde, men derudover inddragelse af et filter hjul eller en image splitter i stien udledning lyse. Den beskrevne protokol kan bruges til Ca^{2 +} billeddannelse af andre ikke-overgearet celler.

Et centralt element i MCs er deres høje indhold af elektron-tætte sekretorisk granulat, som er fyldt med store mængder af mæglere og immunmodulerende stoffer. MC aktivering fører til en hurtig frigivelse af præfabrikerede granulet forbindelser. Flere tilgange til at analysere MC degranulering in vitro- er tilgængelige, herunder påvisning af radiolabeled serotonin, histamin påvisning af antistoffer (ELISA) og påvisning af en stigning i plasma membranen overflade ved hjælp af elektrofysiologiske "patch-klemme" celle kapacitans målinger. I det foreliggende papir beskriver vi en praktisk anvendelse i analysen ved hjælp af multi godt kolorimetrisk detektion af in vitro- udgivet β-hexosaminidase. Denne analyse er baseret på β-hexosaminidase evne til at hydrolysere terminal N-acetyl-D-hexosamine rester i N-acetyl-β-D-hexosaminides²¹. Β-hexosaminidase Co frigives histamin men også med andre mæglere som Cathepsin D eller TNF og kan således bruges som en korrelat for degranulering fra flere typer af sekretoriske vesikler i MCs^12,22.

I den beskrevne teknik, blev PMCs stimuleret ved 37 ° C med forskellige secretagogues, efterfulgt af en vurdering af supernatanter samt pellets af β-hexosaminidase indholdet af deres reaktioner med β-hexosaminidase substrat. Som substrat, blev 4-nitrophenylfosfat N-acetyl-β-D-glucosaminide brugt. Det blev hydrolyseret til N-acetyl-D-Glukosamin og p- nitrofenol. Mængden af p- nitrofenol var kolorimetrisk kvantificeres ved lysabsorption ved 405 nm. I nogle ændringer af ß-hexosaminidase release assay, 4-methylumbelliferil-N-acetyl -beta- glucosamin bruges som substrat. Efter enzymatisk hydrolyse genererer stoffet en fluorometrically påviselige stof. Vi gav udtryk for omfanget af degranulering som en procentdel af udgivelsen, normaliseret til den samlede indhold. Dette tillod os at undgå den variation, der er indført af forskellige celle numre og deres granuleret indhold mellem forskellige celle præparater. Vi ikke trække en spontan release (observeret i mangel af MCs secretagogues) fra netto stimuleret degranulering, da en spontan udgivelse var særskilt rapporteret på grund af dens betydning som en indikator for MC levedygtighed. For at undgå høje variabilitet i assay resultater, er det vigtigt at adskille meget omhyggeligt analysere og pellets efter centrifugering af stimuleres cellerne. Det er også vigtigt at undgå dannelsen af nogen bobler i multi godt pladerne inden du udfører de kolorimetriske målinger. En væsentlig begrænsning af de beskrevne metode er, at resultatet er repræsenteret ikke som en absolut værdi, men som en procentdel af de frigivne mægler.

I modsætning til metoder til direkte påvisning af frigivne serotonin eller histamin, rapporterede analysen er meget mere omkostningseffektiv og kræver ingen specialiseret udstyr. Derudover beskrevet teknikken er meget reproducerbare, behøver ikke at være udført i et laboratorium for radioaktivt, og kræver ikke køb af dyre antistoffer. Det kunne derfor være et glimrende alternativ til dyrere og vanskelige teknikker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
Anti-DNP-Antibody	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	X100
4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell Imaging Chamber	Sigma-Aldrich	GBL635051
96-Well plate, v-shaped bottom	Corning	3896
96-Well plates, flat bottom	Greiner Bio-One	655180
Microtiter plate reader with "i-control" software	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
Flat bottom plate	Greiner Bio-One	655180
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62.547.254
Culture Flasks (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometer	VWR	631-0696
Inverted Microscope	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zeiss	440260-9900
HC Filter Set Fura 2	AHF	H76-521
CCD Camera	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatic Light Source	Sutter Instruments	Lambda DG-4
Imaging Acquisition Program	Zeiss	AxioVision 4.8.2
Gravity fed solution application system	Custom Made	4-channel
15 mL Plastic Centrifuge Tubes	Sarstedt	62,554,502
Bench Centrifuge	Heraeus	Megafuge 1.0R