Summary
Tessutale renale costrutti forniscono una soluzione per la carenza di organi e deleteri effetti della dialisi. Qui, descriviamo un protocollo a micro sezionare murini reni per isolamento di segmenti cortico-midollare. Questi segmenti sono impiantati nei costrutti senza impalcatura cellulare, formando organoids renale.
Abstract
Trapianto di rene è ora una terapia tradizionale per la malattia renale di stadio finale. Tuttavia, con circa 96.000 persone sulla lista d'attesa e solo un quarto di questi pazienti che hanno raggiunto il trapianto, c'è un disperato bisogno di alternative per quelli con mancanza di organi. Al fine di ridurre le conseguenze dannose di dialisi nonché i costi nel complesso sanitari che sostiene, indagine attiva è in corso in cerca di soluzioni alternative al trapianto d'organo. Impiantabili tessutale renale costrutti cellulari sono un tale approccio fattibile per sostituire la perdita di funzionalità renale. Qui, descritto per la prima volta, è il microdissection dei reni murini per l'isolamento di vivere corticomedullary renale segmenti. Questi segmenti sono capaci di rapida incorporazione all'interno senza impalcatura endoteliale-fibroblasto costrutti che consentono rapidi collegamenti con vasculature host una volta impiantato. Reni di topo adulto sono stati prelevati da donatori viventi, seguiti da stereoscopio microdissection ottenere segmenti renale 200-300 µm di diametro. Più costrutti renale furono fabbricati usando segmenti renale primarie raccolte da un solo rene. Questo metodo viene illustrata una procedura che potrebbe salvare il tessuto funzionale renale da organi che altrimenti sarebbe da scartare.
Introduction
Malattia renale cronica (CKD) è una delle attuali sfide importante di sanità pubblica in tutto il mondo1. La prevalenza di CKD negli Stati Uniti è oltre il 14% della popolazione totale, con oltre 600.000 americani soffrono la forma più grave, stadio finale malattia renale (ESRD)2. Le attuali opzioni di trattamento disponibili per quelli con ESRD includono dialisi e trapianto renale. Anche se circa 25.000 pazienti sottopongono a trapianto renale ogni anno, un numero significativo di pazienti vengono aggiunti ogni anno portando a una grande disparità tra quelli in attesa di un organo salva-vita e quelli riceventi trapianto3. Oltre ai suoi effetti negativi gravi sulla longevità e qualità della vita, la dialisi sono associato con un onere finanziario sorprendente. Nel 2014, Medicare pagato crediti ammontano a oltre $ 30 miliardi per ESRD pazienti2. Con un rifornimento limitato dell'organo e nessuna tendenza al ribasso apparente in pazienti che necessitano di dialisi, gli sforzi di ricerca finalizzati ad individuare soluzioni alternative alla dialisi e trapianto sono sempre importanti. Anche un relativamente breve ritardo nella necessità di dialisi aumenta sostanzialmente numero di un paziente di anni di vita di qualità-regolato e produttività mentre rinviando alla dialisi costi4,5,6.
Soluzioni per la perdita di tessuto funzionale, come quella in ESRD, sono attualmente allo studio in ingegneria tissutale e medicina rigenerativa laboratori, con approcci vari ampiamente da basati su impalcatura organoid fabbricazione a organo intero ingegneria utilizzando decellularized strutture dell'organo per l'impianto cellulare7,8,9,10,11. Ricapitolare complesse strutture renali dai reni marginali o scartati solo parzialmente è stato studiato. Infatti, quasi il 20% dei reni procurati per trapianto vengono scartati per vari motivi12,13. Il tessuto renale funzionale da questi presunti innesti potrebbe essere utilizzato e incorporato in uno o molti costrutti tessutale. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di lavorare con questi organi scartati, che utilizzano i reni per la matrice extra-cellulare per tessuto ingegneria fini14,15. Tuttavia, pochi hanno utilizzato il tessuto primario nephronal da reni sani per l'ingegneria dei tessuti fini16,17,18.
Un metodo precedentemente descritto da Kim et al. prevede isolamento di renale "segmenti" da reni sani del ratto, che poi sono stati seminati su impalcature di (PGA) acide poliglicolico per costrutto fabbricazione16. Tuttavia, poche informazioni sono dato per quanto riguarda la metodologia esatta dissezione e segmenti sono stati ottenuti da una combinazione di filtrazione e tritare bene. Descriviamo una modifica del presente protocollo, che analogamente produce segmenti discreti renale con architettura nephronal intatto, ma si basa invece sulle tecniche di microdissezione. Nefrectomie vengono eseguiti su topi adulti viventi, dopo di che i reni sono trasferiti il microscopio di dissezione dove la capsula renale è rimosso, e il tessuto è ulteriormente sezionato. Piccolo calibro 30½ G aghi sono usati come strumenti da taglio e anche come guide aiutando nella dissezione, come l'ago diametro è uguale al diametro del bersaglio dei segmenti renali. I segmenti isolati, in questo caso murini, renali mantengono vitalità nella cultura e incorporano con costrutti cellulari senza impalcatura endoteliale-fibroblasto19. Questi costrutti sono stati utilizzati precedentemente per altri organi, tra cui un pancreas artificiale bio20l'ingegnere.
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Protocol
Tutte le procedure chirurgiche degli animali descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) presso Medical University of South Carolina, prima di qualsiasi animali ambulatori o uso di qualsiasi tessuti animali.
1. murino nefrectomia
- Indossi una maschera chirurgica e protezione bouffant per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Mantenere la sterilità durante il set-up dell'area chirurgica.
- Posto non fenestrate telini chirurgici sul tavolo operatorio.
- Aprire il pacchetto di strumenti sterilizzati nell'autoclave su teli sterili. Gli strumenti necessari per il nephrectomy sono 3 piccoli emostatiche, belle forcipe con i denti, una pinzetta senza denti e forbici iris dritto.
- Posizionare un altro telo chirurgico non fenestrate al centro del tavolo operatorio.
- Preparare 5 mL di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) con calcio e magnesio, completati con 1% di penicillina/streptomicina in una provetta conica sterile 15 mL. Posto questa soluzione sul ghiaccio accanto al tavolo operatorio.
- Ottenere un mouse C57BL/6 di 8-12 settimane vecchio (maschio o femmina) dal complesso di stabulazione degli animali.
- Posizionare il mouse all'interno di una camera di induzione di anestesia e indurre con 3,5% inalato isoflurano. Posizionare un cono di naso del mouse, utilizzando 2% isoflurane per anestesia di manutenzione.
- Monitor per un'adeguata profondità di anestesia periodicamente durante la procedura chirurgica valutando per pedale reflex (pizzico di punta costante).
- Rimuovere tutti i capelli dal torso ventrale utilizzando la crema depilatoria. Sciacquare la zona con acqua distillata per garantire che tutti i capelli sono stato rimosso dall'addome.
- Trasferire il mouse al tavolo operatorio sterile in posizione supina sotto il telo non fenestrate superiore. Tagliare una finestratura2 2 x 2 cm nel drappo solo che ricopre l'addome del mouse.
- Applicare povidone-iodio seguito da etanolo al 70% all'addome usando le sfere di cotone o garza sterile.
- Utilizzando una pinzetta con denti e iris forbici, fare un'incisione della pelle addominale verticale di 3-4 cm parallela alla linea mediana, 0,5 cm a sinistra della linea mediana
Nota: Se il tentativo di rimuovere il rene di destra, questo sarà un'incisione 0,5 cm a destra della linea mediana.- Afferrare il peritoneo con una pinzetta senza denti e incise con forbici iris di entrare nella cavità addominale. Applicare emostatiche ai bordi laterali superiori ed inferiori della pelle e del peritoneo per posizionare lateralmente tensione e migliorare l'esposizione.
- Spostare delicatamente il contenuto intestinale verso il lato destro dell'addome per esporre il rene di sinistra. Posizionare delicatamente la trazione sul rene per elevarlo fuori l'addome.
- Posizionare una pinza emostatica attraverso l'ILO del rene di sinistra. Utilizzare forbici iris al transetto l'uretere e i vasi renali.
- Posizionare il rene di sinistra nel 1% soluzione DPBS penicillina/streptomicina sul ghiaccio.
- Trasferimento nella provetta contenente il rene per la cappa di sterili per coltura. Trasferire il rene dalla provetta conica 15 mL per una capsula di Petri 60mm (Figura 1). Sciacquare due volte con 5 mL DPBS con calcio e magnesio. Mantenere il rene sospeso in 5 mL di DPBS nel piatto 60 mm.
- Preparare un piatto di petri di ulteriori 60 mm con 5 mL DPBS da usarsi durante il protocollo di microdissection.
- Eutanasia il mouse dal thoracotomy e dissanguamento dopo l'acquisizione del rene, secondo un protocollo approvato di animali IACUC.
2. murino rene Microdissection per l'isolamento del segmento renale
- Continuare ad usare una tecnica sterile per questa parte del protocollo, inclusi i guanti sterili, mascherina chirurgica e bouffant per minimizzare il rischio di contaminazione.
- Luogo sterile tende sulla piattaforma microscopio stereo anche per quanto riguarda le aree appena a sinistra e destra del microscopio per avere un campo sterile per strumenti. Inserire fogli di plastica adesive sulle manopole di messa a fuoco del microscopio e spruzzare con etanolo al 70%. Accendere l'Illuminatore doppio collo d'oca per illuminare il palco.
- Apri strumenti sterilizzati (forcipe fine senza denti, manico per bisturi, lama per bisturi #15, due emostatiche dritti, due 30½ hollow-foro aghi di calibro) su teli sterili. Posto la #15 lama sul bisturi ora di gestire e collegare una pinza emostatica per ogni adattatore/mozzo dell'ago per creare strumenti per la dissezione dell'ago per un uso successivo, come mostrato nella Figura 1.
- Spostare i piatti petri-60mm, uno contenente il rene in DPBS e l'altri DPBS unica, dalla coltura del tessuto cappa alla zona di microscopio.
- Porre la capsula di petri 60 mm sotto l'obiettivo e rimuovere il coperchio per esporre il rene. Lasciare il piatto contenenti DPBS al lato sul campo sterile per un uso successivo.
- Spostare il piatto in modo che solo la superficie anteriore o posteriore del rene è in vista (vale a dire, la faccia piatta grande del rene, con l'altra faccia toccare il fondo del piatto). Zoom a 3.2-4x per questa parte della procedura. Usando la mano non dominante, utilizzare una pinzetta senza denti per perforare e pin il rene contro il piatto vicino ai poli inferiori e superiori del rene.
- Mantenere la mano non dominante sul posto per appuntare il rene. Con la mano dominante, è necessario utilizzare la lama #15 per rimuovere lo strato capsulare fibroso traslucido da superficie esposta. Radere la più superficiale 0.5 mm dalla superficie esposta del rene per rimuovere il resto della capsula.
- Usare la lama #15 di sezionare una piramide rovesciata del tessuto dall'area decapsulato, circa 2 mm3 dimensioni. Recuperare la capsula 60 mm solo DPBS e porre la piramide del tessuto nel piatto pulito. Scartare il resto del rene.
- Diminuire l'ingrandimento di 1.5-2.0 X per il resto della dissezione. Utilizzando due strumenti emostato-ago come strumenti da taglio, affettare il frammento di tessuto in pezzi progressivamente più piccoli fino a quando i segmenti di tessuto sono minore o uguale al diametro delle punte dell'ago. Una di 2 mm di tessuto renale3 dimensioni produrrà più di 50 segmenti una volta completamente sezionati.
- Spostare il piatto di 60 mm con segmenti renale alla cappa di coltura del tessuto. Rimuovere DPBS con 1000 µ l pipette. Aggiungere 5 mL DMEM, completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
- Cultura per 3 giorni a 37 ° C in un incubatore o impianto in costrutti cellulari immediatamente.
3. renale segmento cellulare costrutto Fabrication
- Fibroblasti cutanei umani normali cultura (NHDF) e cellule endoteliali microvascolari adipose umane (HAMEC) per diverse settimane ottenere 7,2 x 105 fibroblasti e 1,8 x 105 cellule endoteliali per costrutto desiderato. Nella cappa di coltura tissutale, seme il rapporto appropriato dei fibroblasti alle cellule endoteliali (4:1) in pozzetti, asta-a forma di in stampi di agarosio per formare senza impalcatura pre-vascolare endoteliale-fibroblasto costrutti (SPEC) come precedentemente descritti da Czajka et al. 19.
- Ottenere un emostato sterilizzato, ago 30½ G e una spatola sterile con estremità piatta.
- Rimuovere la maggior parte dei media dalla piastra 60 mm contenenti segmenti renale, facendo attenzione a non aspirare e rimuovere i segmenti renali.
- Dotare le lenti di ingrandimento chirurgiche per visualizzare l'impianto dei segmenti.
- Raschiare la fine della spatola delicatamente lungo la parte inferiore del piatto 60 mm per ottenere 10-15 segmenti, stendere in modo uniforme lungo la punta della spatola. Posizionare la punta della spatola più vicino possibile al labbro del pozzo dove è stato seminato la SPEC.
- Usare uno strumento di ago di pinza emostatica-30½ G in altra mano per spostare ogni singolo segmento dalla punta spatola sul bordo del pozzo. Abbassare delicatamente ogni segmento nel bene usando la punta dell'ago fino a quando leggermente sommerso la sospensione cellulare precedentemente seminato.
- Cultura renale segmento-SPEC in 2:1:1 rapporto di mezzo MGF-2/EGM-2/DMEM (2,5 mL di volume totale). Cambiare ogni 24 ore di coltura per 3 giorni. Rimuovere i costrutti dagli stampi a 72 h e difficoltà o flash-blocco per l'elaborazione.
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Representative Results
Il protocollo descritto produce circa 50 segmenti renale per ogni sezione3 mm 2 piramidale del tessuto renale. I segmenti renali che sono stati elaborati e stampati hanno componenti tubolari e glomerulare in diverse proporzioni (Vedi Figura 2). I segmenti intatti sono stati sottoposti ad un test per determinare la redditività dei diversi segmenti una volta ogni 24 ore per tre giorni. Verde fluorescente calceina-AM è presente con attività dell'esterasi intracellulari, indicativo di cellule viventi. Rosso fluorescente etidio omodimero-1 si vede con perdita dell'integrità della membrana plasmatica. Anche se questi segmenti sono strutture intatte, tridimensionale, analisi significativa penetrazione è apprezzabile con microscopia confocale (Vedi Figura 3).
Segmenti sono stati ulteriormente caratterizzati per uniformità di dimensione utilizzando la stessa analisi di attuabilità delle cellule. Utilizzo di vetrini con depressioni, segmenti sono stati collocati sotto copertura scivola senza forza meccanica posizionato su qualsiasi dimensione dei segmenti. Libero mobile, i segmenti erano imaged 30 minuti dopo il posizionamento nell'analisi di fattibilità/tossicità della cella. Una z-proiezione con dimensioni di passo 10-µm è stata presa attraverso l'intero segmento. La più grande dimensione 'X' e 'Y' sono sono ottenuti e registrate. La dimensione di 'Z' è stata ottenuta calcolando la distanza dal primo all'ultimo visibile fluoroforo. Dato che i segmenti sono approssimativamente cubici, una misura di volume cubico semplice è stata ottenuta e tracciati per confrontare 10 segmenti selezionati in modo casuale da un microdissection esperimento. Volume di (300 µm)3 di destinazione = 0.027 mm3 è mostrato con un pennarello rosso sull'istogramma (Figura 4A). Misure rappresentative 'X' e 'Y' sono mostrate in Figura 4B. Anche se ci sono valori anomali, esistono molti segmenti vicino il volume di destinazione. Ripetere la sperimentazione ha mostrato risultati coerenti (n = 20). Le misurazioni crude (non mostrate qui) mostrano che nella maggior parte dei segmenti, c'è almeno una dimensione misura 200-300 µm. Questo ha implicazioni importanti per le limitazioni di diffusione.
I segmenti renali sono incorporati nei costrutti senza impalcatura endoteliale-fibroblasto e coltivati per 3 giorni. I segmenti renali incorporano con i costrutti cellulari per formare le strutture intatte dal giorno 3 (vedere Figura 5A). I costrutti di mantengono la loro rete pre-vascolare endoteliale, mostrata dall'etichettatura con von Willebrand Factor (Figura 5E). Tuttavia, non sembra che la rete invade il materiale cellulare renale. Cellule epiteliali renali sono etichettate con il Cytokeratin-18 (Figura 5B, verde). Questi costrutti sono stati incubati con albumina FITC-labeled (Figura 5C, grigia) al fine di testare la funzionalità renale in vitro . Mentre c'è residuo albumina trovato lontano i segmenti del tessuto renale incorporato, non ci sono "punti caldi" nella zona di cellule epiteliali tubolari renali, quelli noti per occupare l'albumina che attraversa intra-luminally. Questo è pensato per rappresentare il reuptake di albumina nel costrutto cellulare segmento renale.
Figura 1 : Fotografie rappresentante dal Nephrectomy e renale segmento Microdissection. Un rene murino è rimosso, risciacquato e messo in un piatto di 60 mm e spostato il tavolino del microscopio stereoscopio. Il diametro della punta dell'ago è usato per guidare la dissezione. Emostatiche sono attaccati per suggerimenti per gli strumenti di dissezione ago. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Segmento renale Microdissected. I segmenti renale microdissected contengono proporzioni variabili di glomeruli (angolo inferiore sinistro, basophilic struttura) e tubuli (resto dell'immagine) nella loro disposizione originaria. 10 X immagine, barra della scala come indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Redditività del segmento renale. I segmenti renale microdissected contengono porzioni di tessuto vivo e morto. Principalmente, i segmenti sono viventi e rimangano così nella cultura a 72 h. nota che diversi segmenti sono stati utilizzati per i punti di tempo diversi, come l'analisi di attuabilità sé è tossico per le cellule. 10 X immagini, barre della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Uniformità di Volume del segmento renale. (A) volume cubico in mm3 dall'esperimento di una dissezione del segmento (n = 10). Singoli segmenti sono rappresentati da punti blu, rispetto al punto di colore rosso dell'obiettivo (target volume 0,027 mm3). (B) rappresentante X e Y dimensioni dimensioni del dosaggio di vive-morte, immagine X 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Tessuto-costruita senza impalcatura renale segmento costrutto. (A) Merged immagine mostra incorporazione dei segmenti renale le cellule epiteliali tubolari renali di SPEC. (B) il Cytokeratin 18-positivo (verde). Albumina di FITC-labeled (C) . (D) Hoescht macchia per nuclei. (E) evidenziando la rete prevascular la positività di von Willebrand factor (vWF). 10 X immagini, barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Metodi utilizzati per tessuto renale vivente costrutti variano notevolmente per quanto riguarda sia il tipo delle cellule e biomateriali utilizzati e in molti casi, l'ingegnere sono obsoleti o non ben caratterizzati in letteratura7. Mentre molti stanno usando cellule staminali approcci o ricapitolare i singoli componenti dell'architettura renale in isolamento, è la prospettiva di ricreare artificialmente un intero organo con oltre 26 tipi differenti delle cellule differenziate da sospensioni cellulari travolgente per considerare21. Questo è probabilmente perché altri spostato ad approcci utilizzando segmenti di tessuto renale in applicazioni di ingegneria tissutale. Come descritto in precedenza, precedente lavoro è stato fatto nell'isolamento dei segmenti renale per il seeding su PGA ponteggi16. Tuttavia, la metodologia utilizzata per descrivere l'isolamento di segmenti è stata descritta in dettaglio e i segmenti non sono stati coltivati per qualsiasi periodo di tempo per valutare la redditività. Il metodo descritto qui, insieme con l'utilizzo del test di vitalità cellulare, Mostra che il minimo, porzioni dei segmenti renale sono mantenere vitalità del marchio di 72 h, che non è stata descritta prima. Il metodo ha anche il vantaggio di produrre segmenti con dimensioni abbastanza prevedibile. Inoltre, questi metodi forniscono un approccio clinicamente traducibile per aumentare in mancanza di funzione renale, principalmente dimostrando un metodo fattibile per isolamento di segmenti di tessuto renale primario da organi che altrimenti sarebbero da scartare.
Nello sviluppo del metodo, le sfide più grandi erano, in primo luogo, identificare un oggetto sterile di dimensioni appropriate e secondo, mantenere la sterilità come la procedura coinvolto molti gradini esterno della cappa di cultura cellulare. Punte di aghi 30½ G si è rivelata utile misura così come dispositivi di dissezione. Sterilità è stata una sfida all'inizio della sperimentazione, per lo più relazionati al set-up chirurgico e controllo murino pelliccia.
Limiti della procedura sono legati alla natura tridimensionale dei segmenti di tessuto renale. In una vista al microscopio, le dimensioni del segmento sembra essere all'incirca la dimensione del diametro dell'ago, 0,260 mm. Tuttavia, la dimensione Z non è visibile su uno stereoscopio. Il microdissection è fatto a mano, che a sua volta è un'altra limitazione. In futuro, standardizzazione robotico sarebbe l'ideale. Se la parte piramidale3 di 2 mm di tessuto renale è stata mantenuta con l'orientamento corretto durante la dissezione, dissezione fuori intatti nefroni non sarebbe insondabile. Infine, confrontando questi costrutti al pancreas bio-artificiali, in cui isolotto cellule sono state incorporate nella specifica, si deve riconoscere le differenze principali20. Il rene è funzionalmente e architettonicamente unica dal pancreas e senza dubbio più complessa. Inoltre, le cellule dell'isolotto sono solo un sottotipo di funzionale delle cellule all'interno del pancreas, in contrasto con il conglomerato delle cellule funzionali isolate con segmenti renale in questo metodo. Con architettura e specificamente direzionalità che gioca un grande ruolo nella funzione del rene e in particolare di filtrazione, la mancanza di orientamento uniforme dei segmenti all'interno del costrutto è un'ulteriore debolezza di questa metodologia.
Ricerca in corso è finalizzata alla valutazione del segmento renale e la funzionalità renale costrutto, per chiarire il limite a cui è in corso l'assorbimento di albumina e valutare altre funzioni renali. Futuri esperimenti sugli animali comporterebbe l'impianto dei costrutti renali nella parete della vescica. Incorporare il costrutto in questa struttura corporea altamente vascolare sarebbe consentire rapida anastomosi così come ovviare alla necessità di un sistema di raccolta, con filtrato espellendo direttamente nella vescica. Considerando che la funzionalità in vitro del tessuto renale è estremamente limitato, test in vivo è di vitale importanza. I test solo in vitro attualmente segnalati nella letteratura sono centrati attorno all'albumina l'assorbimento e l'eritropoietina espressione17,22. Questi segmenti di vita del tessuto renale intatto nella sua architettura nativa incorporato nei costrutti con reti endoteliale primitive, che non si basano su qualsiasi stranieri biomateriali, mostrano la promessa verso il rimontaggio del tessuto renale funzionale, biocompatibili .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
NIH istituzionale Postdoctoral Training Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors - Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
References
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