Summary
本协议描述了细胞培养系统的制作, 允许在导电高分子支架上播种干细胞, 用于体外电刺激和随后的体内植入干细胞种子支架, 使用微创技术。
Abstract
干细胞治疗已成为一种令人兴奋的中风治疗, 但最佳分娩方法仍不清楚。虽然显微注射技术已用于数十年来交付干细胞的中风模型, 这项技术是有限的能力, 缺乏操作前的干细胞注射。本文详细介绍了一种利用导电高分子支架进行干细胞输送的方法。利用导电高分子支架对干细胞进行电刺激会改变干细胞的基因, 包括细胞存活、炎症反应和突触重塑。电预处理后, 支架上的干细胞移植 intracranially 在大脑中动脉闭塞大鼠模型中。该协议描述了一个强大的技术, 通过导电高分子支架操作干细胞, 并创造了新的工具, 以进一步发展干细胞为基础的治疗。
Introduction
中风是世界上第二大死因, 也是美国第五大死亡原因。尽管有这些高死亡率, 中风康复治疗目前仍然是一个挑战, 目前尚无可行的医疗选项1。目前大约有300项临床试验涉及缺血性中风, 其中只有40的人利用干细胞。以前的研究表明, 干细胞疗法对中风修复有有益的影响2,3。由移植的人神经祖细胞 (hNPCs) 释放的脑源性神经营养因子 (BDNF) 和 thrombospondin-1 (THBS-1) 等分泌因素表明, 通过与增加突触形成, 血管生成, 树突状分支和新的轴突投射, 以及调节免疫系统4,5,6。然而, 干细胞的最佳分娩方法仍然是难以捉摸的。
成功的干细胞传递到大脑仍然是一个挑战。目前, 注射用水凝胶和高分子脚手架系统已被引入, 以提供干细胞。这些分娩方法保护干细胞移植期间, 并提供保护免受严酷的中风后环境, 包括宿主的炎症反应和缺氧条件7,8,9,10. 然而, 最常用的材料是惰性的, 这限制了连续调制 (即, 电刺激) 的细胞11的使用。电刺激是影响分化、离子通道密度和干细胞突起生长的一个提示12。与惰性聚合物相比, 导电聚合物可以携带电流, 允许电刺激和操纵干细胞2。然而, 电刺激调节神经营养因子释放 (即, BDNF 和 THBS-1) 的精确机制仍未得到充分探讨。
在本协议中, 我们描述了构建一个细胞培养系统的步骤, 该体系由导电高分子支架、聚吡咯 (聚吡咯) 组成,允许体外电刺激。由于细胞培养系统的制作方式, 随后将干细胞种子支架植入到周围梗死皮层是可能的。对于这个系统, 我们在植入前的短时间内, 在支架上电先决条件干细胞。继电刺激后, 携带细胞的导电高分子支架成功地植入 intracranially 使用微创方法。
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Protocol
所有干细胞和动物程序均经斯坦福干细胞研究监督委员会和斯坦福大学实验室动物护理管理小组 (SCRO-616 和 APLAC-31909) 批准。
1. ITO 玻璃的蚀刻
- 在玻璃的导电面上放置一个掩蔽剂, 制备铟锡氧化物 (ITO) 覆盖的玻璃滑块。
注: 大多数商用透明胶带可用作掩蔽剂。- 用刀片去掉多余的面具, 只留下玻璃上覆盖的最终 ITO 设计所需的形状。
- 将 5% (v/v) 的硝酸和 45% (v/五) 的 HCl 在一个通风罩内的玻璃烧杯中组合, 准备蚀刻溶液。
- 使用热板和温度计, 以确保蚀刻溶液的温度保持在摄氏70摄氏度。
- 一旦蚀刻溶液达到70摄氏度, 将屏蔽 ito 玻璃滑入溶液中2分钟, 以去除多余的 ITO 层。
注: 胶带掩蔽保护 ITO 层从接触酸性溶液。 - 从解决方案中取出幻灯片, 并用去离子 (DI) H2O 冲洗它。
- 小心地取下面罩, 用万用表测量电阻, 以确保其余的 ITO 完好无损。所需蚀刻区域的读数应约为0Ω。
2. 吡咯溶液的制备
- 在1000毫升玻璃瓶中, 将70克 dodecylbenzenesulfonate 钠 (NaDBS) 溶于600毫升的 DI H2O。
- 一旦 NaDBS 溶解, 添加14毫升 0.2 M 吡咯和386毫升的 DI H2O 的解决方案。
- 用铝箔覆盖溶液, 贮存在4摄氏度。
3. 在 ITO 玻璃上电镀聚吡咯
- 将吡咯溶液加热到室温, 直到 NaDBS 完全 redissolved。
注意: 这需要大约15到20分钟。 - 将25毫升的吡咯溶液倒入烧杯中。
- 将蚀刻 ITO 玻璃与万用表连接, 将滑块浸入吡咯溶液中。
- 确保0Ω电阻的一侧朝向铂网参考电极。
- 使用万用表 (电流控制在3毫安/cm2 4 小时) 上, 应用电流启动 ITO 表面上的聚吡咯电镀。
- 将 ITO 玻璃从万用表中取出, 并在 DI H2O 中洗涤电镀-聚吡咯, 以除去残留表面活性剂。
- 用剃刀刀片轻轻地将电镀聚吡咯板从 ITO 玻璃中分离出来。
- 在室温下贮存聚吡咯板。
4. 烷的制备
- 使用刮刀和重量盘, 混合18克的基础剂与2克固化剂, 并倒入两个10厘米 x 8 厘米玻璃模具的混合物。
- 使用真空室从模具中取出气泡 15-20 分钟。
- 将模具放置在70摄氏度烤箱中3小时。
- 冷却后, 使用平铲, 从模具中取出。
5. 制作体外电刺激室
- 高压釜的金属板 (WxL, 2.5 厘米 x 12.5 厘米) 和流量阀在120°c 1 小时。
- 使用会议厅幻灯片作为模板, 剪切两个片。
注: 在细胞室内有两个相邻正方形的切口, 其中一条为细胞室的周长。另一条是该会议厅外围的轮廓。- 切出内部的细胞室, 使它是方形的形状和匹配的细胞室。确保两片的整体形状是长方形的, 并与会议厅的滑动相匹配。
- 将材料从下至上分层: (1) 金属板、(2) (不带切口)、(3) 聚吡咯板 (垂直于的)、(4) (带切口) 和 (5) 单元格室.
- 在完全对齐后, 将设备夹紧。
- 切割两个60厘米的金属线, 用银糊将一根电线连接到聚吡咯板的每一端, 从腔体外凸出。确保电线足够长, 可以从设备延伸到孵化器的外部。
- 一旦银糊固化, 加强和密封的电线连接与环氧树脂。
- 使用万用表记录电阻, 以确保每个腔内的应用领域相同。
- 植入时, 取下导线;松开细胞室和硅烷, 然后将它们与导电支架分开。植入支架的尺寸约为1毫米 x 3 毫米 x 0.25 毫米。
6. 聚吡咯上的人神经祖细胞 (hNPCs) 的电镀
- 在紫外线照射下将组装的房间消毒2小时。
- 1小时后, 旋转组装腔90°。
- 灭菌后, 将聚吡咯的表面涂上800µL 的涂层衬底, 并使基体在 5%CO 2 为 1 h 的孵化器中的聚吡咯板上凝固。
- 1小时后, 从室中取出上清, 用1毫升的 DPBS + 钙和镁轻轻冲洗每井。
注意: 避免用力清洗聚吡咯表面, 因为这会导致涂层衬底脱落。 - 使用新鲜的细胞培养基, 机械分离培养细胞用于与室从组织培养板与温和的吹打。
注: 细胞在离解时应为 90-100% 汇合。 - 用离心 8000 x g 收集 hNPC 颗粒5分钟。
- 使用 hemocytometer, 在10万个单元格/cm2的卷上计数和并用重悬单元格。
- 将10万个单元格放入每个腔室 (10万个单元格/cm2在1毫升介质中)。
- 返回室到孵化器在37°c 在 5% CO2.
7. 电刺激 hNPCs
- 在将细胞放进腔室后的某一天, 使用波形发生器将电刺激应用于细胞。
- 在刺激之前, 从每个腔室中清除旧介质, 并补充800µL 的新鲜培养基。
- 在媒体被改变后, 将分庭放回孵化器, 将导线从孵化器中延伸出来, 并将它们连接到波形发生器上。
- 在±400 mV 中使用100赫兹1小时的方波信号对细胞进行刺激。
- 在刺激以后, 去除导线和孵化室在37°c 设置的孵化器在 5% CO2的另一天。
- 根据制造商的协议, 进行后续的生物分析, 包括细胞活力和定量的实时聚合酶链反应 (qRT PCR)。
8.体内聚吡咯植入术
- 对 T 细胞缺损的成年雄性裸鼠 (NIH-RNU 230, 30 克) 进行远端大脑中动脉 (dMCA) 闭塞中风模型, 如前所述2。一周后 dMCA 闭塞进行植入术。
- 在手术前的某一天, 将氨苄西林 (1 毫克/毫升) 给笼水中的老鼠。
- 麻醉在诱导腔内使用 0.5-3% 毫克/千克的异氟醚进行吸入。
- 通过缺乏脚趾捏反射反应来证实大鼠麻醉。
- 当动物在麻醉下, 继续监测其膜的颜色, 呼吸模式, 直肠温度每15分钟。
- 一旦麻醉被证实, 在老鼠的眼睛上涂抹人工泪以防止干燥。
- 通过使用无菌手套和无菌手术悬垂13确保在本过程中保持无菌技术。在不育的领域内保持无菌手术器械。
- 当老鼠被麻醉时, 在左皮层上方钻一个减压。打开硬脑膜。
- 用微薄的外科针从大脑中取出硬脑膜。
- 将导电支架从体外系统移植到大鼠皮层。
注: 对于我们的实验, 我们在 hNPC 电镀后3天内将支架植入体外。- 把植入物主要放在半影皮质内侧的中风病灶。
- 脚手架放置后, 放置 surgicel 在植入物上以防止皮肤闭合的运动。
- 缝合伤口闭合, 皮下注射丁丙诺啡锶1毫克/千克剂量的大鼠, 以管理与立体定向手术和 dMCA 闭塞有关的疼痛。
- 当它恢复知觉时, 把老鼠放在康复笼里。
- 不要让动物在无意识的时候无人看管。
- 不要把动物和别人放在一起, 直到它完全获得知觉。
- 每天监测动物的疼痛症状, 包括体重下降, 减少食物/水摄入量, 减少梳理/蓬乱大衣, 减少/增加自发活动, 异常姿势, 脱水/皮肤 tenting, 凹陷的眼睛, 隐藏, 自我残害,快速呼吸, 张开嘴呼吸, 抽搐, 颤抖, 震颤和发声。
- 每天监视动物, 直到看起来他们正在进食、饮酒、梳洗、发胖;然后每周体重增加。
- 早期 euthanization 通过 co2吸入和二次确认 euthanization (以确保动物不会复活, 由于正常的氧气供应后 CO2吸入) 将发生的任何动物似乎不吃, 饮酒和开始手术后体重增加;出现在痛苦中;或似乎无法完成的行为测试, 由于大于预期的运动皮质赤字。
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Representative Results
图 1中显示的示意图代表了 hNPCs 和潜在下游应用程序的电刺激的总体工作流。目前干细胞治疗的一个局限是干细胞暴露在一个严酷的后移植环境中, 包括炎症和缺血性疾病。这些困难的条件可能限制其治疗效果14,15。使用导电支架保护 hNPCs 免受这种环境的侵害, 可以通过电预处理增加 hNPCs 治疗的益处。这种干细胞输送技术的第一步是使用电镀方法开发导电脚手架2,16。用 hNPCs 对支架的生物相容性和优化电预处理特性进行了表征。控制被定义为在组织培养板上生长的静态干细胞。
对各种电压进行评估, 以确定电刺激的安全性, 并最大限度地提高预适应效果。为确保每个腔内的应用领域相同, 用万用表测量了装配腔的电阻率 (欧姆、Ω), 约为 10 kΩ, resistivity≈3Ωm)。根据商业供应商的数据, hNPCs 在正常的培养系统中没有明显的细胞毒性。有或不暴露于电刺激的 hNPCs 染色细胞活性测定 (活: 绿色;已死: 红色) (图 2)。这些结果表明, hNPCs 是可行的后, 电刺激 (±400 mV, 100 赫兹为1小时)。为了验证细胞生存能力的测定, 我们使用刃天青检测进行细胞生存能力测试。结果也表明电刺激对 hNPCs 无明显的细胞毒性作用。
我们以前的在体内数据表明, 从 hNPCs (SD56, 来自胚胎干细胞的 npc) 释放的分泌因子, 暴露于电刺激, 改善了中风后的恢复2。为进一步探讨 hNPC (阿鲁娜生物医学、胚胎干细胞衍生的 npc)、BDNF 和 THBS-1 的脑卒中康复中已知重要的候选因素。这些因素已被广泛研究, 因为它们的作用在神经元生长和增加细胞间相互作用的17,18。为了研究电刺激对 bdnf 和 THBS-1 转录变化的影响, qRT PCR 进行了包括 bdnf 和 THBS-1 基因的 GAPDH 作为管家基因。根据制造商的协议, 大约1µg 的总 RNA 被反向转录成 cDNA。采用ΔΔCt 方法对聚吡咯 hNPCs hNPCs 中的基因表达与电刺激暴露的聚吡咯进行了比较, 计算了规范化的折变比。统计分析显示, 在电刺激依赖 (p ≤0.01) 的组间 BDNF 和 THBS-1 的基因表达有显著 upregulations (图 3)。这些数据表明, 优化是可能的最大化 hNPC 的功效, 没有明显的细胞死亡。
图 1.体外用于电刺激的导电高分子支架系统。(a)滑动室放在聚吡咯板的顶部。(B)示意图显示了在聚吡咯表面镀 hNPCs的体外电刺激室的制作。流动阀用于将滑动室、聚吡咯、金属板等放在一起。分庭的(C)图像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.hNPCs 或无电刺激的细胞活力测定。(A)条形图, 演示用 Calcein 染色的活细胞。所提供的数据均为 S.D.;n = 4。(B)使用刃天青进行细胞生存能力测定。条形图显示电刺激对 hNPCs 无细胞毒性作用;n = 4。(C)电刺激治疗前后细胞活力测定的图像。绿色信号指示活细胞 (Calcein), 而红色信号表示死细胞 (EtHD-1)。ES 表示电刺激。显示或不存在电刺激的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.基因表达随电刺激而改变.条形图显示 BDNF 的基因表达式的褶皱变化(A)和 THBS1 (B)在 hNPCs (** 表明电预处理与所有其他组的统计学意义, p < 0.01, 误差条表明 S.D.; n = 4, 单向方差分析).阴性表明细胞在正常组织培养板上培养的控制。显示或不存在电刺激的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
越来越多的证据表明干细胞作为一种新型中风疗法的前景。这一承诺导致了一项重大的努力, 以推进干细胞治疗到床边至少40正在进行或完成的临床试验。中风病病理学提供了一种独特的神经紊乱, 使自己的干细胞治疗, 因为在急性侮辱后, 没有神经退行性的过程, 以防止恢复。干细胞增强脑卒中恢复的确切机制尚不清楚。血管生成、synaptogenesis 和突触重塑都被证明是重要的。当移除 BDNF 和 THBS-1 等突触形成的重要分子时, 中风恢复被削弱6,19。在许多动物模型20,21中, hNPCs 改善了中风后的功能恢复。hNPCs 效应的机制仍未得到充分理解, 对这些细胞的理想传递方法是未知的。通过开发一个系统, 允许一个控制从 hNPCs 释放的重要分子, 你可以帮助区分积分恢复机制和优化干细胞治疗。
成功的细胞传递到大脑仍然是一个挑战。目前, 一些技术已经开发使用不同的生物材料脚手架系统提供干细胞, 以改善干细胞的生存和整合9,10。然而, 由于这些材料的惰性特性, 在移植后很难调节干细胞。
本文介绍了一种使用聚吡咯支架电操作 hNPCs 转录的方法, 如 BDNF 和 THBS-1 在我们的 qRT PCR 数据中所示。我们以前的研究表明, 在电刺激暴露后 hNPCs VEGFA 表达的增加改善了中风后的功能恢复2。在这里, 我们表明, 额外的神经营养因子, 如 BDNF 和 THBS-1 也调制后, 暴露在电刺激在不同的 hNPC 细胞线, 表明我们的系统可以用于许多细胞线。
在体外电刺激室的制作过程中, 金属丝与聚吡咯板完全连接, 使用银漆和环氧树脂是至关重要的。如果这种连接不健全, 它会导致不同的电场, 即使有相同的参数。此外, 有时介质会在脚手架系统装配后泄漏。为了解决这一问题, 可以使用真空润滑脂密封的聚吡咯板之间的空间, 小心不适用于细胞播种表面。由于聚吡咯板的非透明性, 限制了用标准光镜检查细胞的融合是有限的。
本协议中描述的方法的优点是允许对 hNPCs 进行调制, 以帮助确定细胞的机械变化。目前, 还没有使用传统的水凝胶或惰性脚手架系统来进行电调制。使用聚吡咯脚手架进行电刺激后, hNPCs 可以不从聚合物表面去除到体内模型中。开发方法进一步研究干细胞应用的疾病模型, 使我们能够更好地设计平移应用。电子预适应方法, 由导电聚合物系统, 可以适用于不同的细胞类型, 并允许更好地理解电刺激对细胞的影响。优化单元格体外然后不进行进一步操作 (如传代或移除) 的能力允许在体内疾病状态 (如中风) 中测试这些体外操作。最终目的是利用新的技术, 如描述的导电高分子支架, 以促进中风治疗和提高对中风恢复机制的理解。
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Disclosures
在这项工作中, 作者没有任何利益冲突要申报。
Acknowledgments
我们感谢卡蒂 Andreasson 博士 (斯坦福大学神经学和神经科学系) 使用 qRT PCR 机。这项工作得到了国立卫生研究院资助 K08NS098876 (P.M.G.) 和斯坦福医学院院长的博士后奖学金 (狐臭) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
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