Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.
Abstract
Stammzell-Therapie ist als eine spannende Schlaganfall therapeutische aufgetaucht, aber die optimale Versandart bleibt unklar. Während die Technik der Mikroinjektion jahrzehntelang verwendet wurde, um Stammzellen in Takt Modelle liefern, wird diese Technik durch die mangelnde Fähigkeit der Stammzellen vor der Injektion zu manipulieren begrenzt. Dieses Dokument beschreibt eine Methode mit einem elektrisch leitfähigen Polymer Gerüst für Stammzell-Lieferung. Die elektrische Stimulation von Zellen mit einem leitfähigen Polymer Gerüst verändert die Stammzelle Gene, die in Zelle überleben, entzündliche Reaktion und synaptischen Umbau. Nach der elektrischen Vorkonditionierung, sind die Stammzellen auf dem Schafott intracranially in einem Rattenmodell distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion transplantiert. Dieses Protokoll beschreibt eine leistungsfähige Technik um Stammzellen über ein leitfähiges Polymer Gerüst zu manipulieren und schafft ein neues Tool zur Stammzell-Therapie weiter zu entwickeln.
Introduction
Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Trotz dieser hohen Todesraten bleiben Behandlungen für Schlaganfall Erholung derzeit eine Herausforderung mit derzeit keine praktikable medizinische Möglichkeiten1. Derzeit gibt es über 300 klinische Studien, die der Umgang mit ischämischen Schlaganfällen, von denen nur 40 Stammzellen nutzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Stammzell-Therapien eine positive Wirkung auf Schlaganfall Reparatur2,3 haben. Parakrine Faktoren wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Thrombospondin-1 (THBS-1) von transplantierten menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) freigegeben haben verbesserte Funktionelle Wiederherstellung durch Mechanismen verbunden mit einer Zunahme gezeigt. Synapse, Bildung, Angiogenese, dendritische Verzweigung und neue axonalen Projektionen sowie modulieren das Immunsystem4,5,6. Die optimalen Methoden der Stammzellen bleiben jedoch schwer.
Erfolgreiche Stammzell-Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit, wurden injizierbaren Hydrogel und Polymere Gerüst-Systeme eingeführt, um Stammzellen zu liefern. Diese Liefermethoden schützen Stammzellen während der Transplantation sowie bieten Schutz vor der rauen nach Schlaganfall-Umgebung, einschließlich des Gastgebers Entzündungsreaktion und hypoxischen Bedingungen7,8,9 , 10. jedoch die am häufigsten verwendeten Materialien sind inert, die schränkt die Verwendung von kontinuierlichen Modulation (d.h. elektrische Stimulation) der Zellen11. Elektrostimulation ist ein Stichwort, der Differenzierung, Kanal Ionendichte und Neurit Auswuchs der Stammzellen12beeinflusst. Im Vergleich zu inerten Polymeren können leitfähige Polymeren tragen ein aktueller erlaubt für elektrische Stimulation und Manipulation von Stammzellen2. Der genaue Mechanismus, durch den elektrischer Stimulation Neurotrophic Factor Release (z.B. BDNF und THBS-1) moduliert, ist jedoch noch nicht vollständig erforscht.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um ein Zellkultursystem bestehend aus leski leitfähiges Polymer Polypyrrol (PPy), die für in-vitro- elektrische Stimulation ermöglicht zu konstruieren. Aufgrund der Art und Weise, in der das Zellkultursystem hergestellt wird, ist die spätere Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst auf der Peri-Infarkt Kortex möglich. Für dieses System Voraussetzung wir elektrisch Stammzellen auf dem Gerüst für einen kurzen Zeitraum vor der Implantation. Im Anschluss an elektrische Stimulation wird das leitfähige Polymer Gerüst tragen die Zellen erfolgreich implantiert intracranially mit einer minimal-invasive Methode.
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Protocol
Alle Stammzellen und tierischen Verfahren wurden von Stanfords Stem Cell Research Oversight Committee und von Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (SCRO-616 und APLAC-31909) genehmigt.
(1) Ätzen von ITO-Glas
- Vorbereiten der Indium-Zinn-Oxid (ITO)-überdachte Objektträger indem man einen Maskierung-Agent über die leitende Seite des Glases.
Hinweis: Die meisten kommerziellen transparente Bänder können als Maskierung Agent verwendet werden.- Entfernen Sie die überschüssige Maske mit einer Klinge, so dass nur die gewünschte Form des endgültigen ITO Design auf dem Glas abgedeckt.
- Kombinieren Sie 5 % (V/V) von Salpetersäure und 45 % (V/V) von HCl in ein Becherglas in einer Dampfhaube, Radierung Lösung vorzubereiten.
- Verwenden Sie eine Herdplatte und ein Thermometer, um sicherzustellen, dass die Temperatur der Radierung Lösung bei 70 ° c gehalten wird
- Sobald die Radierung Lösung 70 ° C erreicht, legen Sie die maskiert-ITO-Glas-Folie in die Lösung für 2 Minuten, um die überschüssige ITO-Schicht zu entfernen.
Hinweis: Masking Tape schützt die ITO-Schicht vor der Exposition gegenüber sauren Lösung. - Entfernen Sie die Folie aus der Lösung und spülen Sie ihn mit entionisiertem (DI) H2O.
- Entfernen Sie vorsichtig die Maske und Maßnahme Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass die verbleibenden ITO intakt ist. Auslesen von den gewünschten geätzten Bereich sollte ungefähr 0 Ω.
2. Vorbereitung des Pyrrol-Lösung
- Lösen Sie in einem 1000-mL-Glasflasche 70 g Natrium-Dodecylbenzenesulfonate (NaDBS auf) in 600 mL DI H2O.
- Wenn die NaDBS aufgelöst ist, fügen Sie 14 mL 0,2 M Pyrrol und 386 mL DI H2O der Projektmappe hinzu.
- Die Lösung mit Alufolie abdecken und bei 4 ° c Lagern
(3) Galvanik von Polypyrrol auf ITO Glas
- Erwärmen Sie die Pyrrol-Lösung auf Raumtemperatur, bis NaDBS voll Bodensatz ist.
Hinweis: Dies dauert etwa 15 bis 20 Minuten. - Gießen Sie 25 mL der Pyrrol-Lösung in ein Becherglas.
- Das geätzte ITO-Glas mit einem Multimeter verbinden und die Folie in die Pyrrol-Lösung eintauchen.
- Stellen Sie sicher, dass die Seite mit 0 Ω Widerstand gegen die Bezugselektrode Platin Netz zeigt.
- Wenden Sie einen elektrischen Strom um Galvanisierung von Wiedersehen auf der ITO-Oberfläche mit einem Multimeter (aktuell bei 3 mA/cm2 für 4 Stunden kontrolliert) zu initiieren.
- Entfernen Sie das ITO-Glas aus der multimeter und waschen galvanisiert-Wiedersehen in DI H2O, passives Tensid zu entfernen.
- Lösen Sie sanft die galvanisiert PPy Platte aus dem ITO Glas mit einer Rasierklinge.
- Lagern Sie die PPy Platte bei Raumtemperatur.
4. Vorbereitung der Polydimethylsiloxan (PDMS)
- Mit einem Spatel und eine Schüssel wiegen, 18 g des Basis-Agents mit 2 g härter mischen und den Teig in zwei 10 cm x 8 cm Glasformen.
- Entfernen Sie die Luftblasen aus den Formen mit einer Vakuumkammer für 15-20 Minuten.
- Legen Sie die Formen in einem 70 ° C Backofen für 3 h.
- Sobald Sie abgekühlt, einem Spatel flach die PDMS aus den Formen entfernen.
5. Herstellung von In-vitro- Elektrostimulation Kammer
- Autoklaven die Metallplatten (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) und den Fluss Ventile bei 120 ° C für 1 Stunde.
- Schneiden Sie eine Kammer-Folie als Vorlage verwenden, zwei Stücke von PDMS.
Hinweis: Einteiler des PDMS dient als der Rand der Zelle Kammer mit Ausschnitten von zwei angrenzenden Quadrate von innerhalb der Zelle Kammer. Das andere Stück PDMS ist eine Gliederung der Kammer Perimeter.- Schneiden Sie das innere Zelle Kammer damit es quadratisch ist geformt und entspricht der Form der Zelle Kammer. Sicherstellen Sie, dass die allgemeine Form der beiden Stücke von PDMS rechteckig ist und der der Kammer-Folie entspricht.
- Schicht der Materialien wie folgt von unten nach oben: (1) Metall-Platte, (2) PDMS (ohne Ausschnitte), (3) PPy Platte (senkrecht zur PDMS), (4) PDMS (mit Ausschnitten) und (5) Zelle Kammer.
- Klemmen Sie den Apparat zusammen, sobald sie vollständig ausgerichtet ist.
- Schneiden Sie zwei 60 cm Stücke aus einem Metalldraht und mit Silberpaste einen Draht an jedem Ende der PPy Platte befestigen, die von außen der Kammer ragt. Stellen Sie sicher, dass die Kabel lang genug sind, um aus der Vorrichtung an der Außenseite der Inkubator zu verlängern.
- Sobald die Silberpaste geheilt ist, zu verstärken und die Drahtverbindung mit Epoxidharz zu versiegeln.
- Notieren Sie den Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass das angewandte Feld das gleiche in jeder Kammer ist.
- Entfernen Sie für die Implantation die Kabel; muss die Zelle Kammern und PDMS und dann sie getrennt von dem leitenden Gerüst. Die Dimension der implantierten Gerüste ist ca. 1 x 3 x 0,25 mm.
6. plating menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) auf Wiedersehen
- Sterilisieren Sie die zusammengesetzten Kammern unter UV-Licht für 2 Stunden.
- Nach 1 Stunde, drehen Sie den versammelten Kammern 90°.
- Nach Sterilisation Mantel der Oberfläche der PPy an der Unterseite der Kammer mit 800 µL eines Substrats, Beschichtung und das Substrat, auf Wiedersehen-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C um 5 % CO2 für 1 h zu festigen.
- Entfernen Sie nach 1 Stunde den überstand von Kammern und sanft Spülen mit 1 mL des DPBS + Ca + Mg pro Bohrloch.
Hinweis: Vermeiden Sie, waschen die Oberfläche des PPy mit Nachdruck als die Ablösung des Substrats Beschichtung dadurch. - Trennen Sie mit Frischzellen-Media, mechanisch kultivierte Zellen für den Einsatz mit den Kammern aus einer Gewebekultur-Platte mit sanften pipettieren.
Hinweis: Zellen sollte 90-100 % Zusammenfluss bei Dissoziation. - Sammeln Sie hNPC Pellets mit Zentrifugation bei 8000 X g für 5 Minuten.
- Mit einer Hemocytometer, zählen und Aufschwemmen der Zellen bei einem Volumen von 100.000 Zellen/cm2.
- Platte 100.000 Zellen in jeder Kammer gut (100.000 Zellen/cm2 in 1 mL der Medien).
- Zurück Kammern zum Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
7. die elektrische Stimulation von hNPCs
- Einen Tag nach der Aussaat verwenden die Zellen auf die Kammern einen Wellenform-Generator elektrischen Stimulation der Zellen anwenden.
- Vor Stimulation auch jede Kammer alte Medien entnehmen und mit 800 µL frische Medien ergänzen.
- Nachdem die Medien geändert werden, setzen Sie die Kammern wieder in den Inkubator, erweitern Sie die Drähte aus dem Inkubator und bringen Sie sie zu einem Waveform-generator
- Wenden Sie die Stimulation auf die Zellen mit einem Rechtecksignal bei ±400 mV mit 100 Hz für 1 h.
- Entfernen Sie nach der Stimulation die Kabel und inkubieren Sie die Kammern für einen weiteren Tag im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2eingestellt.
- Führen Sie nachfolgende biologische Analyse einschließlich Zellviabilität und quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) nach der Hersteller-Protokolls.
8. in Vivo PPy Implantation
- Führen Sie distale mittlere zerebrale Arterie (dMCA) Okklusion Schlaganfall Modelle auf T-Zell-defizienten Erwachsene männlichen nackte Ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) wie zuvor beschrieben2. Durchführen Sie Implantation einer Woche Post-dMCA Okklusion.
- Geben Sie einen Tag vor der Operation Ampicillin (1 mg/mL), die Ratten in ihrem Käfig Wasser.
- Betäuben Sie die Ratte in eine Induktion Kammer mit 0,5 - 3 % mg/kg Isofluran per Inhalation verabreicht.
- Bestätigen Sie Anesthetization der Ratte durch einen Mangel an Zehe Prise reflex Antwort.
- Während das Tier in Narkose ist, weiterhin seine Membran Farbe, Atmung und rektale Temperatur überwachen alle 15 Minuten.
- Sobald Anesthetization bestätigt wurde, gelten Sie künstliche Tränen in Augen der Ratte um Trockenheit zu verhindern.
- Sicherstellen Sie, dass aseptischer Technik während dieses Verfahrens beibehalten wird, mithilfe von sterilen Handschuhen und ein steriles op-Tuch-13. Halten Sie sterile chirurgische Instrumente in einem sterilen Bereich.
- Während die Ratte unter Narkose ist, Bohren Sie ein kraniektomien oberhalb der linken Cortex. Öffnen Sie die Dura.
- Die Dura Mater aus dem Gehirn mit einer Mikro-dünne chirurgische Nadel zu entfernen.
- Implantat-leitfähige Gerüste aus in-vitro- System auf die Ratte Kortex.
Hinweis: Für unsere Experimente implantiert wir Gerüste von in-vitro- Tag 3 nach hNPC Beschichtung.- Legen Sie das Implantat in erster Linie auf der Halbschattenphase Kortex medial der Schlaganfall-Läsion.
- Nachdem das Gerüst platziert ist, legen Sie Surgicel über dem Implantat, Bewegung mit Haut-Verschluss zu verhindern.
- Naht die Wunde geschlossen und subkutan injizieren die Ratten mit Buprenorphin SR in einer Dosierung von 1 mg/kg, die Schmerzen im Zusammenhang mit der stereotaktischen Chirurgie und dMCA Okklusion zu verwalten.
- Legen Sie die Ratte in einem Käfig Erholung, wie es das Bewusstsein wiedererlangt.
- Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt während er bewusstlos ist.
- Legen Sie das Tier mit anderen nicht, bis es vollständig Bewusstsein erlangt hat.
- Beobachten Sie Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen einschließlich Körper Gewichtsverlust, verminderte Essen/Wasseraufnahme, reduzierte Pflege/ungepflegten Mantel, spontane Aktivität verringert/erhöht, abnorme Körperhaltung, Dehydrierung/Haut Zelten, eingefallenen Augen, versteckt, Selbstverstümmelung, schnelle Atmung, offenen Mund atmen, Zuckungen, Zittern, Tremor und Vokalisation.
- Beobachten Sie die Tiere täglich bis es erscheint, dass sie essen, trinken, Pflege, und Gewichtszunahme; und dann wöchentlich nach Gewicht zu gewinnen.
- Frühen Euthanization über CO2 Inhalation und eine sekundäre Bestätigung des Euthanization (um sicherzustellen, das Tier wird nicht durch normale Versorgung Post CO2 Sauerstoffinhalation wieder beleben) erfolgt für jedes Tier, das scheint nicht zu essen, trinken und Gewichtszunahme nach dem ersten chirurgischen Eingriff; erscheint in Schmerz; oder erscheint nicht in der Lage, die Verhaltensstörungen Tests durch eine größer als motorische Kortex Defizit erwartet abgeschlossen.
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Representative Results
In Abbildung 1 gezeigten Schaltplan repräsentiert den gesamten Arbeitsablauf der elektrischen Stimulation des hNPCs und mögliche downstream-Anwendungen. Eine Strombegrenzung in Stammzell-Therapie ist, dass Stammzellen nach Transplantation Umgebungen einschließlich Entzündungen und ischämischen Bedingungen ausgesetzt sind. Diese schwierigen Bedingungen wahrscheinlich begrenzen ihre therapeutische Wirksamkeit14,15. Die Verwendung von leitfähigen leski, hNPCs aus diesem Umfeld zu schützen kann hNPCs therapeutische Vorteile durch elektrische Vorkonditionierung ergänzen. Der erste Schritt in diese Stammzellen-Lieferung-Technik ist die Entwicklung einer leitfähigen Gerüst mit einer galvanischen Ansatz2,16. Wir zeichnen sich die Gerüste Biokompatibilität und elektrische Vorkonditionierung Eigenschaften mit hNPCs optimiert. Kontrollen wurden definiert als unstimulierte Stammzellen auf einer Gewebekultur Platte gewachsen.
Verschiedene Spannungen wurden ausgewertet, um die Sicherheit der elektrischen Stimulation zu bestimmen und die preconditioning Wirksamkeit zu maximieren. Um sicherzustellen, dass das angewandte Feld gleichen in jeder Kammer, wurde der Widerstand der versammelten Kammer mit einem Multimeter gemessen (Widerstände (Ohm, Ω) der Kammern waren ca. 10 kΩ und resistivity≈3 Ωm). Nach der kommerziellen Anbieter haben die hNPCs verwendet keine signifikante Cytotoxizität in normalen Kultur Systeme gezeigt. hNPCs mit oder ohne Belastung durch elektrische Stimulation waren voller Flecken mit Zelle Lebensfähigkeit Assays (Live: grün; Dead: rot) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hNPCs nach der elektrischen Stimulation (±400 mV, 100 Hz für 1 h) lebensfähig waren. Um die Zelle Lebensfähigkeit Assay zu überprüfen, haben wir die Zelle Lebensfähigkeit Tests mit einem Resazurin-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen auch keine signifikanten Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs.
Unsere bisherigen in-Vivo -Daten zeigten, dass Parakrine Faktoren veröffentlicht von hNPCs (SD56, abgeleitet aus embryonalen Stammzellen NPCs) mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation die Erholung nach Schlaganfall2verbessern. Um weiter zu erforschen Kandidat Faktoren bekannt, dass Schlaganfall Erholung wichtig sein, die freigegeben werden aus hNPC (Biomedizinische Aruna, NPCs aus embryonalen Stammzellen abgeleitet), wurden BDNF und THBS-1 bewertet. Diese Faktoren wurden wegen ihrer Rolle in der neuronalen Auswuchs ausgiebig untersucht und Steigerung der Zell-Zell-Interaktionen17,18. Um die Wirksamkeit der Elektrostimulation auf Transkriptom Änderungen für BDNF und THBS-1 zu untersuchen, wurde qRT-PCR durchgeführt, einschließlich BDNF und THBS-1 Gene mit GAPDH als Zimmermädchen gen. Ca. 1 µg Gesamt-RNA wurde umgekehrt in cDNA laut Protokoll des Herstellers transkribiert. Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch ΔΔCt Methode vergleicht Genexpression in hNPCs auf Wiedersehen und hNPCs auf Wiedersehen mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation berechnet. Statistische Analyse zeigte deutliche Upregulations in der Genexpression von BDNF und THBS-1 zwischen Gruppen, die elektrisch Stimulation abhängig (p ≤0.01) waren (Abbildung 3). Diese Daten deuten darauf hin, dass Optimierung ist möglich, hNPC Wirksamkeit ohne signifikante Zelltod zu maximieren.
Abbildung 1 . In-vitro- leitfähigen Polymer Gerüst System für elektrische Stimulation. (A) eine Folie Kammer auf Wiedersehen Platte platziert ist. (B) der Schaltplan zeigt die Herstellung von in-vitro- Elektrostimulation Kammer mit hNPCs auf der Oberfläche des PPy vernickelt. Flow Ventile dienen zum halten der Folie Kammer, PDMS, Wiedersehen, und Metallplatte zusammen. (C) Bild der Kammer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Zelle Lebensfähigkeit in hNPCs mit oder ohne elektrische Stimulation Assay. (A) Balkendiagramm zeigt live Zelle mit Calcein-am befleckt. Daten, die dargestellt sind Mittelwert ± S.D.; n = 4. (B) Zelle Lebensfähigkeit Assay mit Resazurin. Balkendiagramm zeigt, gab es keine Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs; n = 4. (C) Bilder der Zellviabilität Test vor und nach der Reizstrom Behandlung. Grünes Signal zeigt an lebenden Zellen (Calcein-am), während rotes Signal, abgestorbenen Zellen (EtHD-1 anzeigt). ES gibt elektrischen Stimulation. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Veränderungen der Genexpression mit elektrischer Stimulation. Balkendiagramm zeigt Falten Änderungen in gen Ausdrücken von BDNF (A) und THBS1 (B) in hNPCs (** zeigt statistisch signifikant zwischen elektrisch vorkonditionierten und alle anderen Gruppen, p < 0,01, Fehler Bars zeigen S.D.; n = 4, einfache ANOVA ). Negativer Wert gibt an das Steuerelement wo Zellen auf einem Teller regelmäßige Gewebekultur gezüchtet wurden. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Immer mehr Hinweise hat das Versprechen von Stammzellen als eine neuartige Schlaganfall-Therapie gezeigt. Dieses Versprechen führte eine Hauptbemühung, Stammzell-Therapie um das Krankenbett mit mindestens 40 laufenden oder abgeschlossenen klinischen Studien zu gelangen. Schlaganfall-Pathologie bietet eine einzigartige neurologische Störung, die eignet sich für Stammzell-Therapie, weil nach der akuten Beleidigung gibt es keine Neurodegenerative Prozess, d.h. die Wiederherstellung. Der genaue Mechanismus der Stammzellen erhöht Schlaganfall Erholung bleibt unklar. Angiogenese, Synaptogenese und synaptischen Umbau nachweislich alle wichtig sein. Wenn wichtige Moleküle für Synapse Bildung wie BDNF und THBS-1 entfernt werden, ist Schlaganfall Erholung beeinträchtigt6,19. hNPCs verbesserten funktionellen Erholung nach Schlaganfall in zahlreichen Tiermodellen20,21. Die Mechanismen der hNPCs Wirkung noch nicht vollständig verstanden, und die ideale Versandart für diese Zellen ist unbekannt. Durch die Entwicklung eines Systems, das es erlaubt, wichtige Moleküle, die aus dem hNPCs entlassen zu manipulieren, kann einer helfen die integrale Wiederherstellungsmechanismen differenzieren und optimieren Stammzell-Therapie.
Erfolgreiche Zelle Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit haben eine Reihe von Technologien entwickelt, mit verschiedenen Biomaterial-Gerüst-Systeme liefern Stammzellen um das Überleben und die Integration von Stammzellen9,10zu verbessern. Aufgrund der inerten Eigenschaften dieser Materialien ist es jedoch schwierig, Stammzellen nach ihrer Transplantation zu modulieren.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode mit einem Wiedersehen Gerüst, um das Transkriptom des hNPCs elektrisch zu manipulieren, dargestellt durch die Hochregulierung des BDNF und THBS-1 in unserem qRT-PCR-Daten. Unsere früheren Studie ergab, dass eine Erhöhung VEGFA Expression auf hNPCs nach Belastung durch elektrische Stimulation funktionelle Erholung nach Schlaganfall2verbessert. Hier zeigen wir, dass dieser zusätzliche neurotrophen Faktoren wie BDNF und THBS-1 auch moduliert werden nach Belastung durch elektrische Stimulation in einer unterschiedlichen hNPC Zelllinie zeigen, dass unser System mit zahlreichen Zelllinien verwendet werden kann.
Während der Herstellung der in-vitro- Elektrostimulation Kammer ist es wichtig, dass der Metalldraht komplett mit PPy Platte mit Silberfarbe und Epoxy verbunden ist. Wenn diese Verbindung nicht gesund ist, bewirkt, dass es unterschiedliche elektrische Felder sogar mit den gleichen Parametern. Darüber hinaus können zeitweise Medien nach der Montage das Gerüstsystem austreten. Um dieses Problem zu beheben, kann Vakuum Fett angewendet werden, um den Abstand zwischen dem PDMS und PPy Platte mit Sorgfalt nicht anzuwenden auf die Zelle-säen Oberfläche zu versiegeln. Eine Einschränkung aufgrund der undurchsichtigen PPy Platte ist, dass Check-Cells Konfluenz mit standard Lichtmikroskopie begrenzt ist.
Der Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ermöglicht Modulation des hNPCs um die mechanistischen Änderungen der Zellen zu ermitteln. Derzeit hat elektrische Modulation nicht mit herkömmlichen Hydrogel oder inerten Gerüstsysteme genähert. Nach der elektrischen Stimulation mit dem Wiedersehen Gerüst können die hNPCs ohne Entnahme aus der Polymer-Oberfläche zu einem in-Vivo -Modell geliefert werden. Entwicklung von Methoden, Krankheitsmodelle Stammzell-Anwendungen weiter zu studieren ermöglicht es, besseres Design translationale Anwendungen. Der elektrische preconditioning Ansatz, ermöglicht durch die leitfähige Polymer-System kann auf verschiedene Zelltypen angewendet werden und ermöglicht für ein besseres Verständnis der Auswirkungen der Elektrostimulation auf eine Zelle. Die Möglichkeit, Zellen in Vitro zu optimieren und dann ohne weitere Manipulation (z. B. passagierung oder Entfernung) zur Prüfung von diesen in-vitro- Manipulationen bei in Vivo Krankheitszuständen wie Schlaganfall. Das ultimative Ziel ist, neue Techniken, wie der beschriebenen leitfähiges Polymer Gerüst, Schlaganfall-Therapie und Verbesserung des Verständnisses der Schlaganfall Wiederherstellungsmechanismen zu nutzen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, mit dieser Arbeit zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Kati Andreasson (Abteilung für Neurologie und neurologische Science, Stanford University) für den Einsatz der qRT-PCR-Maschine. Die Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08NS098876 (zu P.M.G.) und der Stanford School of Medicine Dean Postdoctoral Fellowship (, b.o.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
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