Summary
Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une canulation cisterna magna (MCC), une façon mini-invasive pour livrer les traceurs, les substrats et les molécules de signalisation dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Combiné avec différentes modalités d’imagerie, CMc permet glymphatic système et évaluation dynamique CSF, ainsi que livraison de cerveau à l’échelle des divers composés.
Abstract
Canulation de Cisterna magna (CMc) est une procédure simple qui permet de rejoindre directement le liquide céphalo-rachidien (LCR) sans endommager le crâne ou le parenchyme du cerveau du dispositif. Chez les rongeurs anesthésiés, l’exposition de la dure-mère par dissection non tranchante des muscles de la nuque permet l’insertion d’une canule dans la cisterna magna (CM). La canule, composée par une fine aiguille biseautée ou borosilicaté capillaire, est reliée par un tube en polyéthylène (PE) à une seringue. À l’aide d’un pousse-seringue, molécules peuvent ensuite être injectés au taux contrôlés directement dans le CM, ce qui est en continuité avec l’espace sous-arachnoïdien. De l’espace sous-arachnoïdien, nous pouvons retracer les flux CSF par flot dans l’espace périvasculaire autour des artérioles pénétrantes, où se fait l’échange soluté avec le liquide interstitiel (ISF). CMc peut être effectuée pour les injections aiguës immédiatement après la chirurgie, ou pour l’implantation chronique, avec injection ultérieure dans anesthésiés ou éveillé, se déplaçant librement des rongeurs. Quantification de la répartition du traceur dans le parenchyme du cerveau peut être effectuée par épifluorescence, microscopie 2 photons et l’imagerie par résonance magnétique (IRM), en fonction des propriétés physico-chimiques des molécules injectées. Ainsi, CMc en collaboration avec différentes techniques d’imagerie offre un outil puissant pour l’évaluation de la glymphatic système et la dynamique de la CSF et la fonction. En outre, le CMc peut être utilisé comme un conduit pour une livraison rapide à l’échelle du cerveau de signalisation des molécules et des substrats métaboliques qui ne pouvaient pas autrement traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE).
Introduction
Le liquide céphalorachidien (LCR) baigne le système nerveux central (CNS) dans le système ventriculaire et le long de l’espace sous-arachnoïdien, un espace défini anatomiquement dans continuum avec les ventricules, qui entoure le cerveau et la moelle épinière. Une des fonctions principales du FSC est de fournir un itinéraire pour la compensation des métabolites et des solutés du parenchyme du cerveau. Dédouanement est facilitée via le glymphatic récemment découvert système1, le cerveau analogique au système lymphatique périphérique. Ici, nous décrivons et discuter de la cisterna magna une canulation (MCC), une méthode mini-invasive pour la prestation directe de molécules dans le LCR. CMc est la principale méthode pour l’étude de la fonction glymphatic. En outre, CMc peut également être appliquée pour l’étude de la dynamique de la CSF et pour une livraison rapide, le cerveau à l’échelle des molécules perméable de barrière (BBB) non-hémato encéphalique dans le parenchyme du cerveau, le long de l’espace périvasculaire.
Le CMc exploite les principes physiologiques de la dynamique de mouvement de CSF à travers le système nerveux central pour livrer des molécules de traceur marqué ou de médicaments dans l’espace rempli de CSF de la cisterna magna (CM). Molécules sont injectées dans une canule implantée dans le revêtement membrane durale atlanto-occipitale, que les molécules cm sont ensuite transportés par flux en vrac CSF dans le parenchyme du cerveau via l' espace de paravascular1. Agent traceur ou contraste injecté par l’intermédiaire de la CMc suit le mouvement du FSC, qui permet l’évaluation du mouvement de la CSF et afflux de glymphatic par la quantification des niveaux d’intensité des molécules marquées qui pénètrent dans le parenchyme du cerveau. CMc est compatible avec les différentes techniques d’imagerie, y compris épifluorescence, 2 photons microscopie et imagerie de résonance magnétique (IRM). En outre, cette évaluation peut être effectuée aussi bien in vivo ou ex vivo. Ce qui est important, CMc permet la visualisation du système glymphatic sous anesthésie ou pendant le sommeil naturel, ainsi que chez des animaux éveillés, librement mobiles.
La technique du CMc peut être utilisée pour étudier les différents aspects de la dynamique des fluides dans le LCR, mais s’est avéré particulièrement utile pour étudier le système de glymphatic. Glymphatic activité lecteurs le flot du LCR dans l’espace périartériels via les voies d’eau aquaporin-4 (AQP-4), qui sont attachés au maximum dans la membrane des astrocytes vasculaire habillage endfeet. Le flot permet l’échange de la CSF et le liquide interstitiel (ISF) dans le parenchyme du cerveau. CSF/ISF contenant les solutés et déchets métaboliques est ensuite prélevé le parenchyme du cerveau via le périveineuse espace2,3. En fin de compte, CSF/ISF atteint la périphérie via les vaisseaux lymphatiques dural décrit récemment4,5. Le système glymphatic a été montré indispensable lors du dédouanement de métabolites déchets nocifs tels que les β-amyloïde2. En outre, glymphatic dégagement est altérée dans le vieillissement6, après le traumatisme cérébral lésion7et dans des modèles animaux de diabète8 et9de la maladie d’Alzheimer. Glymphatic activité est notamment dépendent, montrant une activité sensiblement plus élevée pendant le sommeil ou l’anesthésie en comparaison de l’éveil1de l’État. En effet, les jeunes animaux anesthésiés présentent la plus forte activité de glymphatic. Ainsi, experimental quantification de l’activité glymphatic est essentielle lorsque l'on étudie son rôle dans la santé et la maladie.
Plusieurs études ont porté sur la dynamique de CSF et son échange avec le liquide interstitiel (ISF) dans le parenchyme du cerveau. Cependant, les méthodes par lesquelles les molécules marquées sont livrés sont plutôt envahissantes, déclenchement des lésions cérébrales parenchyme et les changements dans la pression intracrânienne (PIC) (voir revue de10). Quelques exemples sont intraventriculaires ou injections intraparenchymateuses impliquent la craniotomie ou forage d’une bavure le trou dans le crâne. Ces procédures ont démontré qu’alter ICP, perturbant ainsi la fonction glymphatic2. Aussi, ces méthodes invasives induisent astrogliosis et augmentent l’immunoréactivité AQP-4 dans la zone de parenchyme endommagée du cerveau et de ses environs11,12. Comme les astrocytes et AQP-4 sont des éléments clés du système glymphatic, le CMc est la méthode de choix pour ses études. Les principaux avantages de CMc par rapport à des procédures plus invasives sont le maintien d’un parenchyme crâne et le cerveau intact, en évitant les altérations de l’ICP et astrogliosis, respectivement. Ainsi, CMc en collaboration avec différents outils d’imagerie ouvre un large éventail de possibilités d’étudier non seulement le système de glymphatic, mais aussi la dynamique et de mécanismes de débit des fluides dans l’homéostasie, ainsi que dans des modèles animaux de maladies neurologiques.
La procédure de canulation (CMc) cisterna magna permet un accès facile et direct à du liquide céphalo-rachidien (LCR). En injectant des molécules différentes (p. ex. des traceurs fluorescents, les agents de contraste MRI), l’expérimentateur peut suivre leur circulation à l’intérieur du compartiment de la CSF et évaluer l’activité du système glymphatic. Le protocole suivant décrit les deux MCC aiguë, d’injections, immédiatement après la chirurgie et l’implantation chronique de la canule, dans lequel l’animal récupère de l’approche chirurgicale pour une injection ultérieure. La différence la plus importante entre l’implantation aiguë et chronique, c’est que l’implantation chronique permet l’étude de l’activité de la glymphatic chez les souris éveillés.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE européenne pour la recherche sur les animaux et ont été approuvées par le Conseil d’expériences animales relevant du Ministère danois de l’environnement et de la nourriture (2015-15-0201-00535).
1. mode opératoire pour Cannulation
- Préparation de la canule
Remarque : Ne pas toucher la canule avec des gants non stériles.- Casser la pointe de métal biseautée d’une aiguille de 30G dentaire à l’aide d’un porte-aiguille.
- À l’aide d’un porte-aiguille, préparer la canule en insérant la pointe biseautée en métal (environ 0,3 cm) dans une longueur de 30 cm de PE10 tube (tube de polyéthylène 0,024" OD x 0,011" ID) rempli de FSCA (126 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH2PO4 2,5 mM , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, glucose de 10 mM, 26 mM NaHCO3; pH 7,4 lorsque gazéifié avec 95 % d’O2 et de 5 % de CO2).
- Rincer la canule FSCA à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 30G (30 x ½" 0,3 x 12).
-
Intervention chirurgicale
Remarque : La canulation CM chronique permet les animaux récupérer de l’intervention chirurgicale. Injections de CM sont faites le jour suivant l’implantation de la canule et, surtout, peuvent être effectuées chez l’animal éveillé ou anesthésié. Puisqu’il s’agit d’une chirurgie de recouvrement, procédures devraient être effectués dans des conditions stériles.- Peser la souris (C57BL/6JRj, les deux sexes, 8 semaines) et il anesthésier avec un mélange de kétamine et de xylazine (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) par injection intrapéritonéale (i.p.). Si nécessaire, redose la souris avec une demi-dose de la kétamine (50 mg/kg) pendant l’intervention chirurgicale. Sinon, pour canulation chronique, anesthésier la souris en le plaçant dans une chambre à induction isoflurane à 2,5 à 3 % isoflurane, dans environ 1 L/min O2. Dans ce cas, utiliser un cône de nez pour soutenir l’anesthésie isoflurane à 1,5 à 2 % dans l’ensemble de la chirurgie.
- Lorsque le pincement de l’orteil réflexes cessent, et la respiration devient lente et régulière, posez l’animal dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant.
- Appliquer la pommade ophtalmique. Répétez pendant une intervention chirurgicale lorsque cela est nécessaire.
- Se raser la tête et du cou de la souris, supprimer la fourrure et stériliser la peau exposée tout d’abord avec un tampon imbibé d’alcool et puis deux fois avec la chlorhexidine (0,5 %) ou de solution d’iode (2 %). Répétez la stérilisation deux fois plus.
Remarque : Changer le drapé chirurgical pour enlever les débris et les cheveux après le rasage. Alors drapé de l’animal pour protéger le champ stérile. - À la canulation chronique, administrer 0,5 - 1 ml de lidocaïne/bupivacaïne (1 mg/ml et 0,25 mg/ml, respectivement) par voie sous-cutanée (s.c.) sur le site d’incision. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg, s.c.) pour l’analgésie postopératoire.
- Corriger la souris dans le cadre stéréotaxique. Après s’être assuré, soit intraural la fixation ou de l’arcade zygomatique, inclinez légèrement la tête afin qu’il forme un angle de 120° avec le corps (Figure 1E).
- Trouver la partie du crâne qui dépassent immédiatement au-dessus des muscles de la nuque - la crête occipitale. Soulever la peau sus-jacente à l’aide d’une paire de pincettes et couper une pièce en forme d’amande de peau d’environ 1 cm le long de la ligne médiane. Utilisation des cotons-tiges ou œil lances pour contrôler tout saignement qui en résulte.
- À l’aide de la crête occipitale comme point de référence, séparez le tissu connectif superficiel pour exposer les muscles du cou ci-dessous.
- Séparer les muscles à la ligne médiane en exécutant soigneusement la pince vers le bas au milieu de l’incision dans l’axe antéro-à-postérieur. Avec une paire de pinces courbées dans chaque main, rejoignez les pointes au milieu au bas du crâne et tirer les muscles du côté.
Remarque : Cela devrait exposer la CM, ce qui apparaît comme un petit triangle inversé, décrit par le cervelet ci-dessus et de la moelle ci-dessous, derrière la membrane durale translucide (Figure 1 b et 1c). - À l’aide d’un tampon de coton ou spear chirurgie ophtalmologique, essuyer la membrane durale qui recouvre la CM.
-
Insertion de la canule dans le CM
- Retirer la canule de la seringue remplie de FSCA, gardant l’aiguille 30G fixé à l’extrémité arrière du tube.
- Fixer l’aiguille 30G à une distillée rempli d’eau 100 µL seringue reliée à une pompe à seringue.
- Insérez une bulle d’air d’environ 1 cm dans la canule en retirant l’air à l’aide d’un pousse-seringue.
- À l’aide d’un pousse-seringue, retirer 12 μL de traceur de CSF désiré dans la canule.
- Saisir la canule, remplie avec le traceur de CSF, près de l’aiguille recouvert de tube avec une paire de brucelles courbée qui s’est tenue dans la main dominante. Reposer le doigt du milieu de la main non dominante dans la barre de l’oreille du côté opposé et tenez pour l’utilisation ultérieure comme un repos de la canule.
- Insérer la canule à un angle de 45° par rapport à la tête de la souris, en passant au centre de la CM, identifié par son aspect triangulaire vu à travers la dure-mère. Évitez toute pénétration du cervelet ou du bulbe rachidien. Veiller à ce que l’aiguille n’est inséré qu’à une profondeur de 1 à 2 mm, c'est-à-dire au point où le biseau est entièrement sous la dure-mère. Relâcher la pince tenant la canule et laisser la canule à reposer sur la main non dominante.
Remarque : L’extrémité biseautée des aiguilles dentaires nécessiteront l’application d’une force de percer la membrane durale qui recouvre la CM. - Si nécessaire, sécher toute fuite de CSF dès la pénétration à l’aide d’un frottis de chirurgie ophtalmologique spear ou coton.
- Déposer 2-3 gouttes de colle cyanoacrylate sur la membrane durale entourant la canule. Ajouter une goutte d’accélérateur de colle pour guérir la colle immédiatement. Couvrir le crâne et l’aiguille avec un mélange de ciment dentaire (environ 0,5 mg) et de la colle cyanoacrylate (3-5 gouttes). Immédiatement après, appliquez une goutte d’accélérateur de colle pour guérir.
- Pour canulation chronique, couper le tube (en laissant environ 2-3 cm, attaché à la canule) et sceller avec une soudure chirurgicale de conserver les niveaux de la pression intracrânienne (PIC), en empêchant la fuite de la CSF dans la tubulure.
- Pour canulation chronique, administrer carprofène (5 mg/kg, s.c.)
- Pour canulation chronique, placez votre souris dans une cage, le garder sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle jusqu'à ce que l’animal est entièrement récupéré de l’anesthésie.
NOTE : Les animaux doivent être logés individuellement dans leurs cages pour s’assurer que la canule reste intacte. Veiller à ce que le nez est clairement de la literie en plaçant la souris sur une serviette en papier ou autre support solide.
Remarque : Le jour suivant, quand les animaux est récupérés de l’approche chirurgicale réalisée pour l’insertion de la canule, ils peuvent être injectés avec des traceurs de CSF. Pour injection sous anesthésie, administrer un mélange de kétamine/xylazine (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement ; i.p.) et passez aux étapes décrites à la section 2. Pour injection chez des animaux éveillés, passez à la section 3.
2. injection de traceurs CSF via aiguë canule de CM implantés chez des animaux anesthésiés
Remarque : Pour l’injection de traceurs CSF via aiguë canule de CM implanté chez des animaux anesthésiés, immédiatement après l’étape 8 de la section précédente, passez à l’injection de traceur de CSF tel que décrit ci-dessous.
- À l’aide d’un pousse-seringue, commencer l’injection à traceurs CM de CSF à raison de 1 μL/min pendant 5 ou 10 min, ce qui entraîne un volume total de 5 µL ou 10 µL, respectivement. À la fin de l’injection, permettre le traceur de CSF de circuler dans tout le cerveau pendant 30 min avec la canule non perturbée.
- Après 30 min, couper le tube relié à la canule (environ la distance 4 cm de la pointe de l’aiguille) et sceller son extrémité à l’aide d’une soudure chirurgicale.
- Sous anesthésie profonde euthanasier l’animal par décapitation. Rapidement disséquer le cerveau et fixer le tissu par immersion dans de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0.01M, pH 7,4) pendant la nuit (o/n) à 4 ° C.
3. l’injection de traceurs CSF via canule chroniquement implantés CM chez des animaux éveillés
- À l’aide d’un pousse-seringue, retirer µL 7 ou 12 µl de traceur de CSF désirée dans une canule composée d’environ 30 cm de tube PE10 avec une pointe d’aiguille dentaire biseauté de 0,5 cm.
- Freiner doucement l’animal et couper environ 1 cm du tube attaché à la canule.
- Toujours sous contention légère, rapidement se connecter la canule remplie de traceur de CSF pour la canule CM implanté.
- À l’aide d’un pousse-seringue, commencer l’injection à traceurs CM de CSF à raison de 1 µL d’injecter 7 µL/min. ou 12 µL, pour atteindre un volume final de CSF injecté traceur de 5 µL ou 10 µL, compensant ainsi le FSCA restant dans la canule implantée. À la fin de l’injection, permettre le traceur de CSF de circuler dans tout le cerveau pendant 30 min avec la canule non perturbée. S’assurer que le tuyau reste attaché pendant les périodes d’injection et de la circulation.
- À la fin du temps de circulation pour le traceur CSF, procéder à l’euthanasie par décapitation, assurant que l’animal est profondément anesthésié. Rapidement disséquer le cerveau et fixer le tissu par immersion dans de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0.01M, pH 7,4) pendant la nuit (o/n) à 4 ° C.
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Representative Results
Lors de la fixation de souris ou de rats dans un cadre stéréotaxique, muscles de la nuque, autour de la région de la crête occipitale sont carrément disséqués afin d’exposer la cisterna magna (CM). La structure triangulaire de la CM est facilement reconnue entre la portion caudale du cervelet et du bulbe rachidien (Figure 1 a-1 C). La canule est insérée à 1 ou 2 mm dans le CM en perçant doucement la membrane atlanto-occipitale (Figure 1). La membrane dura est une structure robuste et l’insertion de la canule est améliorée en inclinant la tête d’animal par un 120° par rapport au corps. À l’aide d’une pompe à injection, les molécules différemment étiquetées sont ensuite injectées dans la magna de cisterna aux taux contrôlés (Figure 1E). Après un intervalle pour permettre la circulation de traceur de CSF, les animaux est euthanasiés. Le cerveau est soigneusement disséqué et fixe par immersion dans 4 % des PFA o/n à 4 ° C. Macroscopiques vues dorsales des cerveaux récoltées injection CM rongeurs montrent la distribution des traceurs de CSF dans les citernes sous-arachnoïdiennes du cervelet, dans le bulbe olfactif et dans l’espace paravascular le long des artères cérébrales moyennes (MCAs) (Figure 1F ). Dans la partie ventrale du cerveau, vue macroscopique montre la distribution du traceur CSF le long du cercle de Willis (Figure 1). Des coupes histologiques de CM-injecté cerveaux plus révèlent la distribution paravascular des traceurs dans le parenchyme du cerveau. Souris injectées sous anesthésie (Figure 1 H) (ou pendant le sommeil naturel, voir1) révèlent une augmentation remarquable distribution du traceur dans le parenchyme du cerveau par rapport à des souris injectées alors qu’éveillé et librement mobiles dans leur cage maison (Figure 1i).
Figure 1 : Injection de traceurs dans la cisterna magna. (A) aperçu schématique de la tête de la souris et du cerveau montrant l’emplacement de la cisterna magna (CM) en ce qui concerne le cerveau et les structures crâniennes. (B) Photomicrographie de CM exposée après que les muscles du cou environnantes ont été carrément disséqués et poussés sur les côtés. (C) un grossissement supérieur de la zone représentée dans B (rectangle noir), montrant la structure triangulaire inversée de la CM (ligne pointillée) et sa localisation par rapport à la structures environnantes, c'est-à-dire occipital cimier, cervelet et médullaire. (D) la photomicrographie de la canule insérée dans le régime cm (E) de la vue latérale de la tête fixe de souris, légèrement incliné à un angle de 120 ° par rapport au corps. Médaillon du rectangle en pointillés délimité zone montre le schéma d’un système de vue parasagittale une vue parasagittale le cerveau de souris avec la canule insérée dans le CM, comme indiqué dans E. Une seringue, qui est couplée à une pompe d’injection, est utilisée pour livrer des traceurs de CSF ou agents de contraste aux centimètres à travers un tube relié à une fine aiguille 30G. Images représentatives d’un cerveau de souris entière à 30 min après la fin de l’injection de CM avec un traceur fluorescent à partir de la dorsale (F) et ventrale (G) . (H, I,) Sections du cerveau coronale représentant Eosine au DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole ; 1 µg/mL dans du PBS) des souris injectées avec des traceurs de CSF aux centimètres sous anesthésié (H) et l’éveil (I), 30 min après la fin de l’injection de CM à raison de 1 µL/min d’une 5 µL volume d’un mélange d’ovalbumine-AF647 conjugué (OA, 45kDa ; 2 % en aCSF) et conjugué FITC-dextran (DEX, 3kDa et 2 % à aCSF). Barreaux de l’échelle, 5 mm pour B, C, F, G ; 2 mm pour D et 500 µm pour H, I. Cb, cervelet ; CM, cisterna magna ; CTX, cortex ; et OB, bulbe olfactif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons présenté un protocole qui décrit une procédure détaillée pour une canulation cisterna magna (CMc), qui offre une méthode simple pour livrer des molécules marquées dans le compartiment de la CSF. CMc permet la visualisation ultérieure de la dynamique de CSF, aussi bien in vivo et ex vivo, en utilisant différentes modalités d’imagerie ou histologie.
Un des principaux avantages de la technique de CMc réside dans son accès direct à l’espace sous-arachnoïdien sans avoir besoin d’exposer le cerveau par craniotomie. En n’exigeant ne pas une fenêtre crânienne ou la pénétration du parenchyme du cerveau avec une pointe d’aiguille, CMc permet l’administration de molécules dans le compartiment de CSF et l’évaluation du système glymphatic par une procédure peu invasive, avec seulement de brèves perturbations de pression intracrânienne (PIC).
Notamment, l’injection dans le CM est en aval des principales sources du LCR, le plexi choroïde situé dans le système ventriculaire (latéral, troisième et quatrième ventricules). Des ventricules latéraux, CSF flux vers le troisième ventricule via le foramen intraventriculaire (le trou de Monro) et du troisième au quatrième ventricules par l’intermédiaire de l’aqueduc cérébral (l’aqueduc de Sylvius) pour le tronc cérébral et la moelle épinière (revu en3 ). CSF atteint l’espace sous-arachnoïdien via la CM en passant par l’ouverture médiane (ou le foramen de Magendie) et injections de CMc dévie ainsi l’ensemble du système ventriculaire. Toutefois, si cela peut être problématique dans certains modèles de dynamique CSF/ISF dans les ventricules, injection directe de traceurs dans les ventricules nécessite des interventions chirurgicales invasives comme le forage de trous de bavure dans les fenêtres de crâne et l’application de les injections ventriculaires perturbent considérablement le pic13. De même, injection sous pression de traceurs dans l’espace sous-arachnoïdien13,14 dans nos mains abolit le flux des traceurs de CSF le long de l’espace paravascular. En revanche, même si le CMc entraîne la perforation de la membrane durale, pic n’est que transitoirement perturbée et est rapidement restauré2.
À l’aide de la MCC, glymphatic activité peut être mesurée chez des animaux anesthésiés après CMc aiguë, ainsi que chez des animaux éveillés, observant une période de repos de 24 heures après l’implantation de la canule. CMc aiguë est adapté pour combinaison avec 2-photon imaging, qui fournit des informations détaillées sur l’activité glymphatic dans cortex jusqu'à une profondeur d’environ 200 µm1,2. Ce qui est important, aiguë CMc offre également l’avantage de supporter des études d’IRM non biaisées, où la distribution du traceur est suivie dynamiquement, par rapport à une image de niveau de référence individuel acquise avant le début du CSF traceur injection15, 16 , 17. pour l’IRM, l’aiguille dentaire utilisé pour MCC doit être remplacé par un borosilicate capillaire (environ 1 cm de long, diamètre d’environ 20 µm) attachée au tuyau PE.
Contrairement à la canulation aiguë, chronique CMc permet l’expérimentateur à effectuer l’injection de traceur de CSF chez les animaux pendant le sommeil naturel ou sous anesthésie, mais aussi à s’éveiller, se déplaçant librement les animaux. C’est un facteur crucial, étant donné que l’activité glymphatic est hautement dépendant de l’État ; afflux de traceur pour le parenchyme est beaucoup plus élevée chez les animaux qui ont été injectés sous anesthésie ou endormi que chez les animaux qui ont été injectés dans l' état de veille1. En outre, animaux avec une canule chroniquement implantée peut recevoir traceur CSF dans leur cage maison, minimisant ainsi les facteurs de confusion en raison des effets du stress et d’excitation sur l’activité glymphatic. Pour les injections chroniques sous anesthésie, un mélange de kétamine/xylazine (100 mg/kg ; 10 mg/kg, respectivement) est recommandé. Isoflurane en concentrations supérieures à 1,5 % provoque le gonflement du cerveau et n’augmente pas l’activité glymphatic par rapport à l' état éveillé1. Remarque qu’après l’implantation de la CMc, les animaux doivent être unique installé, afin d’assurer que CMc implanté animaux n’endommagera pas la canule de l’autre. En outre, puisque l’implantation chronique de CMc est une intervention chirurgicale de la récupération, doit être effectuée dans des conditions stériles et animaux devrait recevoir des analgésiques post-opérationnelle.
Ce qui est important, CMc peut servir en tant que méthode pour livrer des traceurs de CSF chez la souris, ainsi que chez le rat, avec des modifications minimes au protocole. Anesthésiques appropriés dose doit être administrée et le volume maximal de traceur de CSF qui est injecté chez le rat est 30 µL, en raison des différences dans la taille des espaces ventriculaires et sous-arachnoïdien entre les deux espèces.
Malgré sa simplicité procédurale, une formation et la pratique est nécessaire pour l’expérimentateur réaliser avec succès la CMc. Étant donné que le CM varie dans la taille entre les espèces et les individus, il est conseillé de pratiquer la reconnaissance de sa structure. Pratiquer la procédure à l’aide de bleu Evans (2 % dans l’aCSF) permet l’expérimentateur confirmer l’insertion de l’aiguille correct. Occasionnellement, un navire se situera directement à la ligne médiane de la CM, après quoi l’aiguille est insérée adjacent au bâtiment, mais aussi proche que possible de la ligne médiane. Ces cas noter, pour confirmation ultérieure que traceurs sont réparties uniformément, malgré le placement hors du centre de la pointe de l’aiguille. Ce qui est important, la membrane atlanto-occipitale, couvrant le CM est mécaniquement résistant, et appliquer une pression suffisante pour insérer la pointe de l’aiguille biseautée. Toutefois, il est essentiel que la pression exercée n’aboutit pas à plonger l’extrémité de l’aiguille dans la moelle ou le cervelet. Pour faciliter l’insertion de l’aiguille dans le CM, la tête des animaux doit être inclinée vers le bas à un angle de 120° par rapport à l’organisme, qui s’étend de la membrane. Ce qui est important, attention il faut ne pas gêner la respiration par cette flexion de tête. Si la pointe de l’aiguille doit entrer dans le cervelet, traceurs seront retenus dans les tissus et ne pas distribuer tout au long de l’espace sous-arachnoïdien. Dommages à la moelle sont fréquemment mortel, tandis que le cervelet en cannules chroniques peut endommager dans la prostration et anomalies générales dans le comportement des animaux. Pour minimiser le risque de cette éventualité, les aiguilles avec une plus petite longueur de coupe en biseau peuvent être utilisés.
Lorsque vous déplacez les muscles dans la région du cou qui recouvre la membrane dura pour insérer la canule dans le CM, des saignements peuvent se produire. Tampons de coton peuvent être utilisés pour absorber l’hémorragie, mais sinon, solution de chlorure ferrique peut être appliquée. Chlorure ferrique a un effet hémostatique18et déclenche aussi le durcissement des muscles du cou autour du site d’incision, contribuant ainsi à obtenir la bonne insertion de l’aiguille dans le cm ferrique chlorure assèche également le crâne et la membrane durale, présentant des surfaces mieux pour l’adhérence de la canule. Pour le CMc, appliquer 1 à 2 gouttes de solution de chlorure ferrique (10 %) (environ 1 mL) dans un coton tige et tamponnez les muscles du cou et la crête occipitale. Cependant, topique du chlorure ferrique peut éventuellement s’infiltrer à travers la membrane dans le LCR, avec des effets inconnus sur l’homéostasie du cerveau. Si l’utilisation de chlorure ferrique est un sujet de préoccupation, on peut plutôt utiliser plaie rétracteurs de garder ouvert le site d’incision. Extraction soigneuse des rétracteurs de la plaie après avoir appliqué la colle cyanoacrylate évite la fixation par inadvertance sur le site d’incision.
CMc est une procédure simple et reproductible pour livrer des molécules directement dans le compartiment de la CSF. Puisque CMc est minimalement invasive, c’est la méthode préférée pour la visualisation du système glymphatic et peut être combiné avec différentes modalités d’imagerie telles que l’épifluorescence et microscopie 2 photons ou IRM. Ainsi, le MCC représente un excellent outil pour les études de dynamique des fluides, nommément CSF et ISF et aussi d’habilitation fluide de cerveau. Grâce à la couverture macroscopique du système glymphatic, CMc a le potentiel d’être utilisé pour livrer le cerveau à l’échelle des molécules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Novo Nordisk Foundation et la National Institute of Neurological Disorders et l’accident vasculaire cérébral, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. et Mustapha-R sont bénéficiaires d’une bourse de recherche postdoctorale et une bourse de doctorat de la Fondation de Lundbeck, respectivement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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