Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Published: September 14, 2018 doi: 10.3791/57457
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 5, 3, 1,2,6
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System
* These authors contributed equally

Summary

Kromatin looping spiller en væsentlig rolle i genregulering; der har dog været nogen teknologiske fremskridt, som giver mulighed for selektiv og reversible ændring af kromatin sløjfer. Her beskriver vi et kraftfuldt system for kromatin loop re organisation ved hjælp af CRISPR-dCas9 (CLOuD9), viste at selektivt og reversibelt modulere genekspression på målrettet loci.

Abstract

Nylige undersøgelser har klart vist at langtrækkende, tre-dimensionelle kromatin looping interaktioner spille en betydelig rolle i reguleringen af genekspression, men om looping er ansvarlig for eller et resultat af ændringer i genekspression er stadig ukendt. Indtil for nylig, hvordan kromatin looping påvirker forordningen af genaktivitet og cellefunktion har været forholdsvis tvetydig, og begrænsninger i eksisterende metoder til at manipulere disse strukturer forhindret tilbundsgående efterforskning af disse interaktioner. For at løse denne usikkerhed, vi udviklet en metode til selektiv og reversible kromatin loop re organisation ved hjælp af CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamikken i CLOuD9 systemet er blevet påvist ved vellykket lokalisering af CLOuD9 konstruktioner til at målrette genomisk loci for at modulere lokale kromatin kropsbygning. Evnen til at vende den inducerede kontakt og genoprette den endogene kromatin kropsbygning er vigtigere, også blevet bekræftet. Graduering af genekspression med denne metode fastsætter evne til at regulere cellulær genekspression og understreger den store muligheder for anvendelser af denne teknologi at skabe stabile de novo kromatin sløjfer, der mærkbart påvirker gen udtryk i sammenhænge af kræft og udvikling.

Introduction

Forholdet mellem kromatin foldning i kernen og den specifikke tilrettelæggelse af genomet har høstet betydelig interesse i de seneste år, som det har vist sig at være nært forbundet med gen expression1,2. Mens den præcise forhold mellem genaktivitet og graduering af kromatin struktur forbliver uklart, det har været en hypotese at samspillet mellem kromosomale kontakter som følge af dynamisk tredimensional kromatin organisation tjene en gen regulativfunktionen3. Ja, sådan en effekt er påvist godt på menneskelige globin gen locus, hvor regionen locus kontrol (LCR) regulerer aktiviteten af globin gener i en udviklingsmæssig specifik måde ved at oprette en kromatin loop mellem to regioner4. Men i både dette og andre områder, det er uklart om kromatin looping er en årsag eller konsekvens af ændringer i genekspression.

Indtil nu har forblev udfordringer i at studere dette fænomen uløst. For eksempel, involveret andre forsøg på overtalelse kromatin sløjfer ændring af lineære DNA sekvens eller komplicerede procedurer kræver en overflod af baggrundsviden om specifikke elementer, som letter looping5,6, 7,8. Derudover, mens tidligere arbejde har foreslået at kromatin loops drev genekspression i en specifik og begrænset forbindelse7,er8, niveauet på hvilke kromatin looping påvirker transskription globalt usikker. Selvom interesse i virkningen af langtrækkende springer på genekspression er vokset konstant i de seneste år, fortsat ubesvarede spørgsmål om oprettelse af og fastholde kromatin kontakter for at ændre genaktivitet.

Den teknologi, som vi har manipuleret beskæftiger nukleasen mangelfuld grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) - CRISPR - forbundet protein 9 (dCas9), at give mulighed for den generelt gældende målretning af enhver genomisk loci9. Denne teknologi eliminerer de komplekse spørgsmål i forbindelse med ændringer af den lineære DNA-sekvens og er tilgængelig uden betydelige forudgående kendskab til særlige looping komponenter. Mest bemærkelsesværdigt, er værktøjet universelle og generelt gælder for kromatin sløjfer anerkendt i udvikling, en lang række sygdomme, såsom kræft. Styrken af CLOuD9 fremgår af reversibelt at ændre strukturen af sløjfer til effektivt modulere genekspression.

Protocol

1. gRNA Design

  1. Vælg en standard gRNA designværktøj til at designe guide RNA'er10. Bruge supplerende par af de tidligere udviklede CLOuD9 konstruktioner9 (dvs. mindst 1 S. aureus (CSA) og 1 S. pyogenes (CSP) konstruere) for hvert forsøg.
    1. Inden for den valgte online designværktøj, bruger Protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens "NGG" med en guide længde 20 bp for CSP og PAM sekvens "NNGRRT" med en guide længde på 21 til CSA.
    2. Vælg guider baseret på specificitet score og design vejledninger på begge tråde at maksimere chancerne for at opnå en arbejdsgruppe vejledning.
    3. Bestil 2 oligonukleotider pr. guide fra en oligo producent: for den fremadrettede oligo, tilføje "caccg" til 5'-enden af guide-sekvensen, og for den omvendte oligo, tilføje "aaac" til 5' enden og "c" til 3'-enden før du bestiller.
  2. I første omgang design 3-5 gRNAs for hvert område af interesse, spredt over en 250-1000 bp region. Vurdere gRNA målretning effektivitet som følger:
    1. Klon identificeret gRNAs ind i en aktiv Cas9 plasmid (Se trin 3) og forbigående transfect i 293T celler (Se trin 4)11.
    2. Vokser celler for 2-3 d i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (pen strep), derefter høste og udtrække genomisk DNA12.
    3. Forstærke målrettede regioner ved polymerase kæde reaktion (PCR). Køre produkter på en 1,5% agarosegel og rense passende bands.
    4. Udføre en T7 liv1975 analyse som beskrevet i Guschin, mfl. protokol13,14.
      Bemærk: Effektiv guider er dem, fast besluttet på at skære DNA på destinationsstedet.

2. celle kultur

  1. Vedligeholde celler i et sundt og aktivt dividere stat.
    1. For K562s, kultur i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medier med 10% FBS og 1% pen strep.
      1. Vokse K562s i en 25 cm2 canted hals kolbe til vedligeholdelse og justere celle tæthed til 400.000 celler pr. mL hver dag.
      2. Efter K562s har været transduced med CLOuD9 konstruktioner, tilføje 2 µg/mL puromycin og 100 µg/mL hygromycin til vedligeholdelse medier.
    2. For 293Ts, kultur i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% pen strep.
      1. Vokse 293Ts i 10 cm2 plader og opdele når sammenflydende.

3. plasmid forberedelse og gRNA indsættelse15

Bemærk: Plasmid kort er tilgængelige i tillægget og primere udnyttes i eksempel eksperimenter er tilgængelige i supplerende tabel 1.

  1. Mix 5 µg af den lentiviral CRISPR plasmid med 3 µL af BsmBI, 3 µL alkalisk fosfatase, 6 µL af 10 x Buffer og 0,6 µL af frisklavede 100 mM DTT. Bringe den samlede mængde til 60 µL med ddH2O og inkuberes ved 37 ° C i 30 min til at fordøje og dephosphorylate plasmidet.
  2. Gel rense den fordøjede plasmid og elueres i ddH2O.
  3. Mix 1 µL af hver af de parrede vejledninger på 100 µM med 1 µL af 10 x T4 ligatur Buffer, 6,5 µL af Hedeselskabet2O og 0,5 µL T4 PNK, at nå 10 µL samlede volumen. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min, så 95 ° C i 5 min, og derefter rampe ned til 25 ° C ved 5 ° C/min..
    Bemærk: Dette vil anneal par af guider.
  4. Fortynd udglødet vejledninger (fra trin 3.3) 1:200 i ddH2O.
  5. Mix 1 µL af den fordøjede plasmid fra trin 3.2 med 0,5 µL af de fortyndede sammenskrevne vejledninger fra trin 3.4, 2,5 µL af 2 x Buffer, 1 µl af Hedeselskabet2O og 0,5 µL af Ligase, gøre en 5,5 µL samlede reaktion. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min til ligate guider til BsmBI fordøjet plasmid.
  6. Omdanne Stbl3 bakterier den nyligt sammenskrevne plasmid fra trin 3.5 og forstærke ved hjælp af enhver plasmid forberedelse metode.

4. lentivirus produktion

  1. Grev 750.000 293T celler pr. brønd for en six-godt plade ved hjælp af en hemocytometer og frø dem i DMEM med 10% FBS og 1% pen strep. Bruge et godt for hver konstruktion.
  2. 24 timer efter såning, ændre medier til frisk antibiotikum-gratis DMEM med 10% FBS.
  3. I ét rør, fortyndes 11 µL af lipid-baserede Transfektion reagens med 150 µL af OptiMEM medium, per reaktion11.
  4. I en separat rør, fortyndes 2 µg på CLOuD9 lentiviral vektor plasmid fra trin 3.6, 0,35 µg pMDLg/pRRE, 1 µg for pRSV-Rev og 0,65 µg for pMD2.G med 150 µL af OptiMEM medium, per reaktion11.
  5. For hver reaktion, tilføjes den fortyndede lipid-baserede Transfektion reagens i forholdet 1:1 fortyndede lentiviral plasmid blandinger, og Inkuber i 5 min11.
  6. Tilføje hele mængden af hver blandet kompleks fra trin 4.5 i de respektive brønde af antibiotika-fri 293T celler fra trin 4.2.
  7. 48 timer senere, indsamle viral produktion media når der afpipetteres i en frisk rør og spin ned på 300 x g i 5 min. Efter centrifugering, skal du flytte supernatanten til en frisk tube at fjerne resterende celle debris.
  8. Bruge viral produktion medier straks til transduktion af target-cellerne eller fryse ved-80 ° C til fremtidig brug.

5. lentivirus transduktion af celler

  1. Tilføje 250 µL af hver viral konstruktion af interesse (som består af komplementære CLOuD9 plasmider) til en 15 mL konisk slange med 80.000 celler for programmet CLOuD9.
  2. Bringe den samlede mængde af medier i de enkelte konisk til 1 mL med antibiotika-frie medier, og tilføje polybrene til en endelig koncentration på mellem 1-8 µg/mL (den maksimale koncentration af polybrene tolereret af celletype udnyttet skal bestemmes eksperimentelt).
  3. Spin celler ved 800 x g i 30 min. ved stuetemperatur, så resuspend af pipettering uden at fjerne viral supernatanten. Flytte det hele cellesuspension til en celle kultur plade.
  4. 24 timer efter transduktion, spin celler ned på 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  5. Opsug viral supernatanten og resuspend celler i regelmæssig celle kultur medier.
  6. Den næste dag, tilføje puromycin (1 µg/mL for 293T celler) og hygromycin (25 µg/mL for 293T celler) til cellekulturmedium vælge for dobbelt transduced celler. Eksperimentelt bestemme de relevante koncentrationer af puromycin og hygromycin for en given celletype forud for begyndelsen af eksperimenter.
  7. Holde celler i udvalg medier for mindst 3 d før enhver downstream eksperimenter og vedligeholde i udvalg medier for varigheden af alle eksperimenter.

6. celle Dimerization og vaskes ud

  1. Tilføj 1 mM Abscisic syre (ABA) eller en tilsvarende mængde af dimethylsulfoxid (DMSO) for kontrolelementer til cellekultur til dimerize CLOuD9 og transduced celler. Bruge ABA senest 6 måneder efter datoen for modtagelsen, holde kold og beskytte det fra lys overalt i brug. 2 mM ABA kan udnyttes, hvis det er nødvendigt.
    1. Ændre medierne dagligt til at give frisk ABA (eller DMSO kontrol) for varigheden af eksperimenterne.
      Bemærk: Ingen begrænsning på længden af dimerization er endnu blevet observeret.
  2. Vende dimerization gennem fjernelse af medier indeholdende ABA og vask celler med nok phosphat bufferet saltvand (PBS) at dække overfladen af pladen, to gange. Derefter kultur celler i ABA-gratis medier til at opretholde en un-dimerized tilstand.

7. Immunoprecipitation og Co-immunoprecipitations

Bemærk: Sørg alle buffere friske og umiddelbart inden brug.

  1. Efter afslutningen af dimerization eksperimenter, indsamle og spin-ned celler så Aspirér supernatanten.
  2. Bitmapgenkendelse og fryse ned celler
    1. Gøre en frisk bestand af 1% formaldehyd i PBS ved stuetemperatur med friske materialer. For hver 2 millioner celler, forsigtigt resuspend med 1 mL 1% formaldehyd ved stuetemperatur i nøjagtigt 10 min, mens roterende.
      Bemærk: Brug en mindstemængde af 10 mL for crosslinking mindre end 10 millioner celler.
    2. Dæmpning crosslinking med tilsætning af glycin til en endelig koncentration på 0,125 M, efterfulgt af inkubation i 5 min. ved stuetemperatur, mens roterende.
    3. Spin ned celler og vaske 1-2 x med iskold PBS. Celle pellets kan derefter være snap frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C eller bruges umiddelbart.
      Bemærk: Varme vil vende formaldehyd krydsbindinger. Hvis styrtede, kan celler gemmes direkte i-80 ° C, uden snap fryse.
  3. Forberede antistof/perle konjugat
    Bemærk: Optimere betingelserne for valgte antistof (dvs, teste forskellige lysis buffere for celle lysis og udfører IP) kan være umagen værd. To fælles buffere, Farnham lysisbuffer og modificeret RIPA buffer, kan have en betydelig effekt på IP effektivitet og ultralydbehandling effektivitet. Alle buffer kompositioner kan findes i Tabel af materialer. Derudover skal du huske at kromatin ultralydbehandling kan tage adskillige timer at fuldføre.
    1. Resuspend perler af vortexing kort som passer til den valgte antistof.
    2. Overføre en passende mængde perler for eksperimentet til en 1,5 mL tube. Som udgangspunkt, skal du bruge 20 µL af perler for hver 1 µg antistof. Lave ikke sammenlægge antistof endnu.
      Bemærk: Brug 10 µg antistof med 200 µL af perler til 1 mg af den samlede lysate som udgangspunkt, medmindre det er kendt at antistoffet er mere eller mindre effektiv end dette ville indebære. For lav overflod proteiner, kan dette forhold skal justeres.
    3. Hvis du bruger Farnham lysisbuffer, vask 3 x i IP fortynding buffer. Hvis du bruger RIPA lysisbuffer, vask 3 x i RIPA lysisbuffer.
    4. Resuspend perler i en endelige mængden af den samme buffer fra trin 7.3.3 (enten IP fortynding eller RIPA buffer) der er > 1 x og < 5 x den oprindelige mængde. dvs. For 100 µL indledende perle volumen, bruge mellem 100 og 500 µL endelige resuspension volumen.
    5. Tilføje antistof til vasket perler nu på en passende koncentration. For en god HA eller Flag antistof mod IP CLOuD9 konstruktioner, bruge antistoffer på 1:50 (µg protein: µg protein lysate), og der inkuberes mellem 8 + h og natten over ved 4 ° C, mens roterende. Alternativt, inkuberes i 2-4 timer ved stuetemperatur.
    6. Fjern supernatanten fra perler og kassér.
    7. Vask perler 3 x med Wash buffer.
    8. Resuspend i en minimal mængde af bufferen udnyttet i natten inkubation med antistof (IP fortynding eller RIPA buffer). Holde koldt indtil kombineret med protein lysate.
  4. Der sonikeres kromatin
    1. Først lyse celler med tilsætning af hævelse buffer til celle pellets i isbad i 10 min, svippede celler hver få min til at forhindre afregning.
      Bemærk: Generelt, 500 µL af hævelse buffer er føjet til 25 millioner celler og skaleres derfra, men gør ikke brug mindre end 500 µL buffer for < 25 millioner celler.
    2. Dounce manuelt både med uret og mod uret, 13 x hver.
    3. Derefter spin kerner ned ved 4 ° C i 5 min på 1.500 x g. Aspirér supernatanten helt og Gentag for at fjerne resterende supernatanten, derefter Indvejning mg celle pellet.
    4. Tilføje protease hæmmer til kerner lysisbuffer (Farnham buffer eller RIPA buffer, ovenfor, vælge en).
    5. Tilføje 10 x mængde kerner lysisbuffer til pelleted kerner til resuspend (for eksempel, tilsættes 1 mL af kerner lysisbuffer til en 0.100 g pellet). Kort vortex og lyse i 10 min på is.
      Bemærk: Husk på størrelsen af sonikering tube. Ideel volumen er ofte < 1 mL, så prøver kan skal deles hvis pellets er meget store.
      1. Der sonikeres kerner kort for at solubilize materiale og slukke SDS til et niveau, der tillader immunoprecipitation med 2-3 bind af fortynding buffer Co-IP, og derefter fortsætte til trin 7.4.6. For meget følsomme antistoffer, tilføje flere fortynding buffer til yderligere at reducere koncentrationen af SDS.
        Bemærk: Stop sonikering når lysate rydder; det vil ændre fra en uigennemsigtig/gennemsigtig hvid til helt gennemsigtig. Holde prøver så koldt som muligt og ikke over sonikeres.
      2. For ChIP, grundigt sonikeres DNA for at opnå 150-1000 bp DNA fragmenter, så gå videre til trin 7.4.6.
    6. Spin ud uopløselige materiale ved maksimal hastighed for 10 min. ved 4 ° C.
    7. Overføre opløselige materiale til en frisk tube.
    8. For Co-IP, måler koncentrationen af protein og gå videre til pulldown i skridt 7,5.
    9. For ChIP, fjerne en 10 µL alikvot af ryddet lysate og tilføje 40 µL IP eluering buffer og 6 µL 5 M NaCl til der i alt 56ul. Kog i 15 min. ved 95 ° C, tilsættes 5-10 µL af 3 M NaOAc pH 5, og rydde op på en PCR rensning kolonne. Måler koncentrationen af DNA ved måling af absorbans ved 260 nm og standardisere på tværs af prøver. Fortsæt til pulldown i skridt 7,5.
      Bemærk: Ekstra lysate kan være snap frosset ved-80 ° C og anvendes på et senere tidspunkt, men bedste resultater er opnået fra den friske lysate. Hvis frysning, ikke fryse/tø lysate mere end én gang.
  5. Pulldown
    1. Overføre en passende mængde protein lysate til en frisk tube. Hvis du bruger Farnham lysisbuffer, fortyndes i 2.1 bind af IP fortynding buffer (ovenfor).
    2. Der er afsat 100 µL af supernatanten for input kontrol, og opbevares ved 4 ° C indtil næste dag.
    3. Tilføje perle/antistof konjugat fra trin 7.3.8 til prøver nu.
    4. Rotere prøver ved 4 ° C natten over og sikre, at der er nok volumen til flydende bevægelse i 1,5 mL rør.
  6. Vask og elueres
    1. Efter overnatning rotation, skal du gemme supernatanten som den ikke-bindende brøk. Derefter perler vask 3-5 x i IP fortynding buffer.
    2. Forberede IP eluering buffer ved stuetemperatur uden hæmmere.
    3. Elueres komplekser med 50 µL eluering buffer rystet på en vortex på 67 ° C i 15 min. overførsel eluering til en ny tube og Gentag med en anden 50 µL. kombinere dem begge for en total 100 µL eluering.
      Bemærk: Hvis der er for meget baggrund fra denne eluering procedure, varme kan mindskes eller elimineres under omrystning/inkubation. Dette generelt reducerer udbyttet af target protein men signifikant fald i baggrunden.
  7. Vende krydsbindinger af varme ved 67 ° C for > 4 h.
    Bemærk: Dette er ikke strengt nødvendigt for Co IPs men kan være nyttige.
    1. For Co-IP, for at sikre fuld dimerization mellem mål af interesse, køre eluater på en SDS-page gel og sonde med antistoffer mod HA tag eller Flag tag, som anført, alle på 1: 1.000. Derefter fortsætte til trin 8.
    2. For ChIP-qPCR, for at sikre korrekt lokalisering og målretning af hver CRISPR-dCas9 komponent, rense eluering produkt på en kolonne og elueres 10 µL. Udfør real-time kvantitativ polymerase kæde reaktion (qPCR) oprenset DNA. Primere udnyttet i de præsenterede data er tilgængelige i supplerende tabel 1. Derefter fortsætte til trin 8.

8. RNA udvinding og kvantitativ PCR

  1. For at undersøge de CLOuD9-inducerede ændringer i genekspression, først, isolere og rense total RNA fra både kontrol celle pellets og dimerized celle pellets.
  2. Foretage supplerende DNA (cDNA) fra den oprensede RNA ved reverse transkription17 og udføre qPCR analyser. Primere er tilgængelige i supplerende tabel 1.

9. kromosom kropsbygning fange Assay

  1. Undersøgelser vedrørende8til at observere ændringer i hyppigheden af genomisk loci kontakter induceret af CLOuD9, udføre kromosom kropsbygning capture (3C).
  2. Kvantificere 3C ligatur produkter i to sæt af dubletter for hver af tre biologiske replikater af kvantitative real-time PCR. Normalisere prøver at 3C signaler fra tubulin locus. Primere er tilgængelige i supplerende tabel 1.

Representative Results

CLOuD9 inducerer reversible β-globin promotor-LCR looping. Passende anvendelse af CLOuD9-systemet inducerer reversible kontakt af supplerende CSA og CSP CLOuD9 konstruerer gennem tilføjelse eller fjernelse af ABA til celle kultur medier (figur 1a). CSA og CSP konstruktioner (figur 1b) er lokaliseret til passende genomisk områder ved hjælp af standard CRISPR gRNAs. I betragtning af den enorme dokumentation for menneskelige globin locus samt hyppige kromosomale foldning og omordning, der opstår der under udvikling, denne region blev valgt til at påvise nytten af CLOuD9 systemet. Derudover blev K562 cellelinje valgt fordi det har vist sig at konsekvent udtrykker høje niveauer af føtal γ-globin-genet i modsætning til β-globin genet, der udtrykkes typisk i raske voksne erythroid slægt celler. Ved hjælp af K562 cellerne, kan CLOuD9 evne til at ændre genekspression undersøges ved at forsøge at gendanne udtryk af β-globin genet i denne cellelinje.

Før induktion af dimerization, kromatin immunoprecipitation-kvantitativ PCR (ChIP-qPCR) blev udnyttet til at sikre nøjagtig lokalisering og målretning af hver CLOuD9 komponent (tillægs figur 1). Derudover verificeret co-immunoprecipitation (Co-IP) med og uden ABA CSA og CSP dimerization i nærværelse af ligand samt reversibilitet i mangel af ligand (figur 1 c og supplerende figur 2). 24 timer efter tilsætning af ABA, større kontakt mellem β-globin og LCR optrådte som målt ved kromosom kropsbygning capture (3C) i celler med begge dimerization dele, men ikke de kontrolelementer, der indeholder kun to CSA eller CSP konstruktioner, således validering af specificiteten af kromatin ændring for de målrettede websteder (figur 1 c og supplerende tal 3,4). Opretter LCR-β-globin interaktion helt fjerne ikke den endogene LCR-globin kontakt, men i stedet føjes til den oprindelige kontaktperson, som tidligere rapporteret8. Stigninger i β-globin/LCR kontakter blev observeret for op til 72 h af dimerization, uanset de nøjagtige region inden for den målrettede LCR og β-globin promotor region (supplerende tal 5,6). Endelig, reversibilitet af systemet blev bekræftet med 3C efter fjernelse ABA, som viste en komplet fornyelse af den endogene kropsbygning (fig. 1 d og supplerende tal 3-6).

Vi mente, at succes fremgår af K562 cellerne kan være et resultat af globin locus placeringen i en region i euchromatin (fig. 1 d), så en anden cellelinie blev udnyttet til at udforske denne idé. CLOuD9 systemet blev anvendt til HEK 293T celler i regioner, der er heterochromatic og ikke udtrykke globin gener (figur 1e). Resultatet var lig hvad blev observeret i K562s; flere β-globin LCR foreninger blev målt ved 3C efter 24 h med ABA (figur 1e og supplerende figur 3), at levere beviser for CLOuD9's robust evne til at fungere i forskellige cellulære miljøer, trods den oprindelige kromatin tilstand eller kropsbygning.

Yderligere loci blev testet for at sikre bred anvendelighed CLOuD9, herunder Oct4-promotor og en distal 5' forstærker i 293T celler. Tidligere har der været nogen påviselig Oct4 udtryk i denne cellelinje og yderligere, ingen endogene kontakter beskrevet. Dokumentation af Oct4 udtryk i embryonale stamceller som følge af kontakt med den distale 5' enhancer motiveret dette eksperiment, og det samme resultat blev observeret på β-globin locus18. Kontakt mellem Oct4 distale enhancer og initiativtager var identificeret i CLOuD9 aktiveret celler, men ikke for kontrol cellerne (figur 1f). Derudover blev det observeret denne Oct4 promotor og distale 5' enhancer interaktion også fik en 3' forstærker til at kontakte Oct4 promotor. Denne begivenhed er i overensstemmelse med beviser at 3' enhancer interagerer med Oct4 promotor/5 ' distale enhancer komplekse under endogene gen aktivering10.

CLOuD9 inducerer sammenhæng specifikke ændringer på gen loci. Når du har bekræftet, at CLOuD9 systemet virkelig fremkalde kromosomale kontakter på gen loci, søgte vi at undersøge loops' effekt på genekspression. Det er dokumenteret, at transskription for globin og Oct4 gener er betinget af kontakter mellem LCR og globin gen loci og distale 5' forstærker og Oct4 promotor, henholdsvis1,11. Dermed, vi hypotese at bruger CLOuD9 system til at drive kromatin loop formation i hver af disse regioner ville resultere i overbevisende genekspression.

I begge loci, RT-qPCR demonstreret at ABA induceret kromatin loops kørte stigninger i Oct4 udtryk i 293T celler og β-globin udtryk i K562 celler, men ikke i 293Ts (figur 2a). Selv om tilsætning af ABA til celle kultur for så lidt som 24 h øget β-globin udtryk betydeligt, udtryk fortsatte med at stige støt op til 72 timer og var reversible ved ABA udvaskning (figur 2a). Alle K562 cellerne undtagen kontrolelementerne fulgt denne tendens, uanset hvor komponenterne dimerization blev placeret i LCR og β-globin promotor-regioner (figur 2a og supplerende tal 7,8). Til støtte for disse resultater svarede ChIP-qPCR H3K4me3 og RNA Pol-II på β-globin locus i K562s og 293Ts med observerede ændringer i transskription (figur 2 c-f).

CLOuD9 etablerer stabil kromatin sløjfer. Selvom kortsigtede loop induktion med CLOuD9 klart fulgt forventninger, om langsigtede induktion af looping havde differential effekter forblev skal overholdes. For at undersøge dette, blev celler dyrkes i overværelse af ABA for 10 dage. Mens både K562s og 293Ts udstillet øget kontakt frekvens mellem β-globin locus og LCR i forhold til kontrol (figur 3a, b og supplerende tal 9,10), var ændringer i β-globin udtryk stadig kun observeret i K562 celler (figur 3 c). Interessant, men det blev observeret, at langsigtede dimerization i K562s, hvor transkription var kraftigt upregulated, var ikke længere reversible (figur 3a og supplerende tal 9-11). Dog inducerede i 293Ts, hvor ingen ændring i transskription blev observeret efter langsigtede dimerization, ændringer i kromatin kontakter forblev reversible (figur 3b og supplerende figur 9).

Alt i alt blev kun et lille fald i genekspression observeret efter 10 dage af ABA fjernelse, som var betydeligt højere end gen expression niveauer før dimerization (figur 3 c). I tråd med dette, K562 celler, men ikke 293T celler, viste vedvarende ændringer i H3K4me3 og RNA Pol-II på β-globin locus af ChIP-qPCR, sammenlignet med kontrollen, selv efter 10 dage af ABA fjernelse (figur 3d-f). Vores resultater viser således, at stabiliteten af kromatin loop indebærer mere bæredygtig genekspression.

Figure 1
Figur 1: CLOuD9 inducerer reversible β-globin promotor-LCR looping. (a) tilsætning af abscisic syre (ABA, grønne) bringer to komplementære CLOuD9 konstruktioner (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), rød og blå, henholdsvis) i nærhed, remodeling kromatin struktur. Fjernelse af ABA genskaber den endogene kromatin kropsbygning. (b) CLOuD9 konstruktioner kombinerer CRISPR-dCas9 teknologi fra S. aureus og S. pyogenes med reversibelt dimerizeable PYL1 og ABI1 domæner. (c) tidslinje af CLOuD9 dimerization eksperimenter. (d) 3 C assay måling β-globin locus-wide crosslinking frekvenser i K562 celler efter 24 timer behandling med ABA (rød) og efterfølgende udvaskning (blå) viser, reversibilitet af induceret β-globin/LCR kontakter (fremhævet i grå). Orange pilespidser angive specifikke CLOuD9 konstruere målområder. Det EcoRI fragment indeholdende overfølsomhed websteder 1-4 af LCR (sort bar) blev brugt som regionen anker. Crosslinking hyppighed med andre angivne EcoRI fragmenter (navne på toppen af grafen) blev vurderet. Menneskelige β-globin gener og LCR overfølsomhed websteder er afbildet i bunden af grafen med kromosomale holdning koordinater. Data fra ChIP-FF. i H3K4me3 og H3K9me3 viser, at denne region er euchromatic i K562s. (e) lignende reversible ændringer i kromatin struktur ses i HEK 293T celler, trods beviser fra H3K4me3 og H3K9me3 ChIP-seq data som globin regionen er heterochromatic i denne celletype. (f) 3 C assay måling Oct4 locus-wide crosslinking frekvenser i 293T celler efter 72 h af behandling med ABA (rød) viser induceret Oct4/distale enhancer kontakter (fremhævet i grå). Orange pilespidser angive specifikke CLOuD9 konstruere målområder. Det MboI fragment indeholdende Oct4 promoter (sort bar) blev brugt som regionen anker. Crosslinking hyppighed med andre angivne MboI fragmenter (navne på toppen af grafen) blev vurderet. De menneskelige Oct4 regioner er afbildet i bunden af grafen med kromosomale holdning koordinater. Alle 3C resultater blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg. 3C værdier var normaliseret til tubulin. For β-globin, var interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS fragment sat til nul. For Oct4, var interaktion frekvenser mellem anker fragment og en negativ kontrol fragment uden for regionen Oct4 interagerende sat til nul. Fejllinjer angive s.d. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra figur 1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: CLOuD9 inducerer sammenhæng specifikke ændringer i gen expression og kromatin tilstand. (a) CLOuD9-induceret kromatin springer på β-globin locus resultater i reversible induktion af β-globin udtryk i K562s, men ikke i 293Ts. betydning givet i forhold til kontrol behandlede celler. Tosidede student's t-test * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; n.s. ikke-væsentlig. Fejllinjer angive s.d. n = 3. (b) induktion af Oct4 udtryk blev observeret i 293Ts efter CLOuD9-induceret springer på samme locus. Betydning er givet i forhold til kontrol behandlede celler. Tosidede student's t-test * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Fejllinjer angive s.d. (c) skematisk af ChIP-qPCR primer steder langs β-globin gen krop. (d, e) ChIP-qPCR viser reversible ændringer i H3K4me3 i β-globin locus i K562s men ikke i 293Ts efter CLOuD9-induceret looping. Tosidede student's t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Fejllinjer angive s.d. (f) CLOuD9 medieret ændringer i β-globin transskription i K562s svarer med stigninger i RNA Pol-II belægning på tværs af helhed af β-globin gen krop. Tosidede student's t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Fejllinjer angive s.d. Dette tal er blevet ændret fra figur 2 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: CLOuD9 etablerer stabil kromatin sløjfer, der opretholder robust genekspression efter langsigtede dimerization. (a, b) 3 C analyse viser, at i K562s men ikke 293Ts, CLOuD9-induceret kromatin looping bliver irreversibel efter 10 dage af ABA behandling, selv når ABA er fjernet for op til 10 ekstra dage. Alle 3C resultater blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive s.d. n = 3. (c) Loop stabilisering i K562s resulterer i vedvarende udtryk for β-globin, selv efter 10 dage af ABA udvaskning. Ingen ændringer i β-globin udtryk er observeret i 293Ts. betydning givet i forhold til kontrol behandlede celler. Tosidede student's t-test *** P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; n.s. ikke-væsentlig (d) ChIP-qPCR viser stigninger i H3K4me3 mærker over β-globin locus svar på CLOuD9-induceret looping er påført efter 10 dage af ligand udvaskning i K562s. tosidede student's t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. (e) ingen væsentlige ændringer i H3K4me3 signalerer følgende langsigtede dimerization blev observeret af ChIP-qPCR i 293Ts. (f) øget RNA Pol-II belægning af β-globin locus efter langvarige sløjfe induktion blev fastholdt i K562s efter 10 dage af ligand udvaskning. Tosidede student's t-test * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Alle fejllinjer angive s.d. Dette tal er blevet ændret fra figur 3 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 1: CLOuD9 konstruktioner lokalisere til deres tilsigtede målområder. Kromatin immunoprecipitation og kvantitativ PCR af CLOuD9 konstruktioner viser korrekt lokalisering til deres tilsigtede genomisk loci. Dette tal er blevet ændret fra tillægs figur 1 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Tillægs figur 2: CLOuD9 konstruktioner reversibelt knytte svar på ABA behandling. Co-immunoprecipitations demonstrerer sammenslutningen af dCas9 proteiner følgende 72 h ABA behandlingsforløb er vendt følgende efterfølgende 72 h af ligand udvaskning. Dette tal er blevet ændret fra tillægs figur 2 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 3: kontrol behandling inducerer ingen ændringer i kromatin kontakter. Behandling med DMSO, en agent til tabsstyring, i 24 timer inducerer ingen ændringer i den endogene kromatin kropsbygning af 3C i enten K562 celler eller HEK 293Ts. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 3 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 4: kontrol CLOuD9 transduced celler viser ingen ændringer i kromatin looping. Lede to CLOuD9 konstruerer enten LCR eller β-globin promotor inducerer ingen væsentlige ændringer i kromatin struktur af 3C efter ABA behandling i forhold til kontrol behandling. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 4 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 5: CLOuD9 kromatin looping forbliver reversibel efter 72 timers dimerization. 3C assay i K562s viser, reversibilitet af CLOuD9 induceret β-globin/LCR kontakter efter 72 timers ABA-behandling. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 5 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 6: CLOuD9 induceret β-globin/LCR looping ikke er påvirket af globin målwebsted. Lede CSA og CSP konstruktioner til alternative regioner af LCR eller β-globin promotor resultater i lignende reversible ændringer i loop induktion af 3C efter 72 timers ABA-behandling. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 6 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 7: CLOuD9 inducerede ændringer i genekspression er påført uanset globin målwebsted. Lede CSA og CSP konstruktioner til alternative regioner af β-globin promotor og LCR har ingen indvirkning på induktion af genekspression efter 72 h af dimerization. Men mens nogle påvirke styrken gen expression følgende langsigtede (10 dage) dimerization blev observeret, høje niveauer af β-globin i forhold til kontrol behandlede celler var vedvarende følgende efterfølgende ligand udvaskning for 10 ekstra dage. Betydning er givet i forhold til kontrol behandlede celler. p < 0,001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, fra venstre mod højre t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. ikke-væsentlig. Alle fejllinjer angive SD. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 7 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 8: kontrol CLOuD9 transduced celler viser ingen ændringer i β-globin udtryk. Lede to CLOuD9 konstruerer enten LCR eller β-globin promotor inducerer ingen væsentlige ændringer i β-globin udtryk efter ABA behandling i forhold til kontrol behandling. Betydning er givet i forhold til kontrol behandlede celler. n.s. ikke-væsentlig. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 8 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 9: kontrol langtidsbehandling inducerer ingen ændringer i kromatin kontakter. Behandling med DMSO, en agent til tabsstyring, for 10 dage inducerer ingen ændring i endogene kromatin kropsbygning af 3C i enten K562 celler eller HEK 293Ts. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 9 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende figur 10: langsigtede CLOuD9 induceret β-globin/LCR looping ikke er påvirket af globin målwebsted. Lede CSA og CSP konstruktioner til alternative regioner af LCR eller β-globin promotor resultater i tilsvarende vedvarende loop induktion, som det fremgår af 3C efter 10 dage af ABA-behandling og 10 dage med efterfølgende ligand udvaskning. 3C værdier var normaliseret til tubulin, og interaktion frekvenser mellem anker fragment og fragmentet omfatter β/HS Fragmentet blev sat til nul. Fejllinjer angive SD. n = 3. Dette tal er blevet ændret fra supplerende figur 10 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende Figur 11: CLOuD9 konstruktioner uigenkaldeligt forbinder svar på ABA langtidsbehandling. Co-immunoprecipitations demonstrerer irreversibel sammenslutning af CSA og CSP dCas9 proteiner efter 10 dage af ABA-behandling og 10 efterfølgende dage af ligand udvaskning. Dette tal er blevet ændret fra supplerende Figur 11 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne figur.

Supplerende tabel 1: liste over primer sekvenser for gRNAs, qRT-PCR, 3C og ChIP qPCR. Denne tabel er ændret fra supplerende tabel 1 i Morgan, Stefanie L., mfl. 9. venligst klik her for at downloade denne tabel

Discussion

The most kritiske trin i CLOuD9 kromatin looping er: 1) designe eller ved hjælp af den korrekte gRNAs, 2) skiftende medier dagligt på CLOuD9-transduced celler, herunder ABA eller DMSO, 3) bevare friskhed af ABA, og 4) udfører præcis og omhyggelige vurderinger af kromatin kropsbygning.

Grænserne for CLOuD9 bor primært i evnen til at designe vejledninger til regionen target valg. Guide RNA'er udføre den vigtige opgave at lokalisere dCas9 komponenterne til destinationsområderne DNA til at være dimerized og effektiviteten af vejledningerne er baseret på deres specifikke mål-webstedet. Uden ordentlig gRNA komponenter induceret CLOuD9 system ikke vil kunne danne reversibelt sløjfer. Således, ved at designe flere guider for hver region af interesse og sprede guider over et område af 250-1000 bp, mindst én vellykket vejledning vil blive sikret. Guide placering er også integreret til præcise resultater. Det er vigtigt at undgå guides, der findes i transskription faktor bindingssteder eller andre kritiske områder for at forhindre baggrundseffekter såsom op eller ned regulering af transkription. Derudover kan den præcise placering af CLOuD9 konstruktion lidt indflydelse transskription af target-genet. Dette understreger betydningen af prøvning flere par af guider for hver målområde, at identificere de mest robuste par til forsøgsformål. Yderligere, i hvert par af målområder, CSA-konstruktionen bør være målrettet med gRNAs for S. aureus, og CSP-konstruktionen bør være målrettet med gRNAs til S. pyogenes for målretning specificitet.

For at sikre nøjagtige resultater og korrekte dimerization, er det også vigtigt at bevare friskhed af de cellulære miljøer efter transduktion af CLOuD9 konstruktioner. Daglige media ændre og tilsætning af frisk dimerizer (eller kontrol) sikrer, at de supplerende konstruktioner vil forblive i nærhed og bevare den ændrede kromatin kropsbygning. Derudover er garanterer ABA er frisk og har været opbevaret korrekt efter producentens protokol (åbnet inden for 6 måneder, holdt koldt, beskyttet mod lys) afgørende for at opnå ægte resultater.

Navnlig, blev ABA dimerizer for CLOuD9 brugt med ABI og PYL dimerization proteiner, snarere end mere almindeligt udnyttet FRB og FKBP system. Nødvendigheden af en rapalog til FRB/FKBP-systemet ville have begrænset anvendelighed af CLOuD9, på grund af toksicitet for kræftceller. Alternative ABI/PYL systemet omgås denne begrænsning, effektivt gør det muligt for CLOuD9 at være mere bredt utilizable.

Kollektivt, har vi udviklet CLOuD9, en enestående og robust teknologi, der kan tvinge men reversibelt skabe kontakter mellem langtrækkende mål genomisk loci. Gennem overtalelse kromatin sløjfer, vise vi også, at CLOuD9 kan udnyttes til at ændre genekspression i den relevante cellulære kontekst. Tilpasningsevne af teknologien giver mulighed for ubegrænset undersøgelse af samspillet mellem enhver to genomisk loci, uden at der kræves forudgående kendskab til oprette sløjfer af områder eller looping mekanismer. CLOuD9's unikke demonstreret reversibilitet kan desuden yderligere undersøgelse af de mekanismer, der springer i sygdommen og udvikling. Mens effekterne på mål af kromatin looping er blevet påvist klart, er der endnu at være data tilbyde indsigt i virkningerne af off-target looping og den efterfølgende indvirkning på på target sløjfer.

Vores data viser kun et par anvendelser af dette værktøj men indebærer den vigtige underliggende idé, kromatin arrangement er vejledende af genekspression. Vores teknologi kan bruges til at undersøge og afsløre nuancerne i kromatin struktur RIBOREGULATION, dermed forbedre den overordnede forståelse af rollen som kromatin foldning i transkription af gener. En bedre forståelse af nuancerne i transcriptional dynamics kan føre an i forskning og behandling af kræft, arvelige sygdomme og medfødte lidelser, i hvilke adskilt kromatin forsamling uden tvivl ændrer gen expression20, 21,22,23. Efterfølgende arbejde udnytte CLOuD9 teknologi vil belyse yderligere detaljer om arrangementet og dynamikken i kromatin domæner og hvordan de køre foldning for at opretholde stabil genekspression i både udvikling og sygdom.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo og hele Wang laboratoriet for teknisk support og kritisk læsning af manuskriptet. S.L.M. er blevet støttet i dette arbejde gennem NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) og National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. understøttes af en karriere Award for medicinsk forskere fra fondens Burroughs Wellcome, og er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation Fakultet Scholar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640  media Life Technologies 11875-119 For K562 cell culture
DMEM media Life Technologies 11995-065 1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2 Addgene plasmid #52961 For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev Addgene plasmid #12253 For lentivirus production
pMD2.G Addgene plasmid #12259 For lentivirus production
pMDLg/pRRE Addgene plasmid #12251 For lentivirus production
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668-019 For lentivirus production
anti-HA antibody Cell Signaling 3724 For immunoprecipitation
anti-Flag antibody Sigma F1804 For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504 For DNA extraction
TRIzol Life Technologies 15596-018 For RNA extraction
RNeasy Kit Qiagen 74106 For RNA extraction
Superscript VILO Life Technologies 11754-050 For cDNA 
SYBR Green I MasterMix Roche 4707516001 For qPCR analysis
Light Cycler 480II Roche For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody AbCam ab8580 For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody Active Motif 61083 For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor Roche 11873580001 For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel Biorad Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody Santa Cruz sc-2030 For western blot
anti-mouse HRP antibody Cell Signaling 7076S For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000AKU For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000APE For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000FCJ For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data GEO GSM1479215 For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10001D For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10004D For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free Thermo Fisher Scientific 28908 For crosslinking
PX458 Plasmid Addgene 48138 Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 For PCR purification
FastDigest BsmBI Thermo Fisher Scientific FD0454 For cloning guide RNAs
FastAP Thermo Fisher Scientific EF0651 For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer Thermo Fisher Scientific B64 For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer NEB B0202S For cloning guide RNAs
T4 PNK NEB M0201S For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer NEB B2200S For cloning guide RNAs
Quick Ligase NEB M2200S For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer 1% SDS, 10% NaHCO3  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
  2. Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
  3. Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
  4. Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
  5. Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
  6. Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
  7. Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
  8. Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
  9. Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, 13 July (2017).
  10. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  11. Lipofectamine 2000 Reagent. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).
  12. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2006).
  13. Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , New England BioLabs. (2016).
  14. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
  15. Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
  16. RNeasy Mini Handbook. , QIAGEN. (2012).
  17. SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).
  18. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
  19. Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
  20. Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
  21. Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
  22. Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
  23. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).

Tags

Genetik sag 139 kromatin sløjfer kromatin foldning gene expression CRISPR dCas9 genregulering vendbar dimerization dynamisk kromosomal omrokering.
CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, S. L., Chang, E. Y.,… More

Morgan, S. L., Chang, E. Y., Mariano, N. C., Bermudez, A., Arruda, N. L., Wu, F., Luo, Y., Shankar, G., Huynh, S. K., Huang, C. C., Pitteri, S. J., Wang, K. C. CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure. J. Vis. Exp. (139), e57457, doi:10.3791/57457 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter