Summary
כרומטין לולאה משחק תפקיד משמעותי הכונה; עם זאת, היו לא הפיתוחים הטכנולוגיים המאפשרים שינוי סלקטיבית ולא הפיכים של לולאות כרומטין. כאן נתאר מערכת חזקה לארגון מחדש של לולאה כרומטין באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9), הדגימו באופן סלקטיבי ובלתי הפיכה לווסת ביטוי גנים-ממוקד לוקוסים.
Abstract
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו בבירור כי כרומטין ארוכי טווח, תלת מימדי לולאה אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בוויסות של ביטוי גנים, אבל אם לולאה הוא אחראי או תוצאה של שינויים בביטוי הגנים הוא עדיין לא ידוע. עד לאחרונה, איך כרומטין לולאה משפיע על ויסות פעילות הגן ואת תפקוד התאים גישתה יחסית, מגבלות שיטות קיימות לתמרן מבנים אלה מנעו חקר מעמיק של אינטראקציות אלה. כדי לפתור את חוסר הוודאות הזה, אנחנו מהונדסים שיטה לארגון מחדש של לולאה כרומטין סלקטיבית ולא הפיכים באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9). הדינמיות של מערכת CLOuD9 הוכח על ידי לוקליזציה מוצלחת של בונה CLOuD9 למטרה לוקוסים גנומית לווסת קונפורמציה כרומטין מקומיים. חשוב מכך, היכולת להפוך את הקשר המושרה ולשחזר את קונפורמציה כרומטין אנדוגני גם אומת. אפנון של ביטוי גנים בשיטה זו מבססת את היכולת לווסת את ביטוי גנים הסלולר ואת מדגישה את פוטנציאל גדול עבור יישומים של טכנולוגיה זו ביצירת יציב דה נובו לולאות כרומטין המשפיעים במידה ניכרת על ג'ין ביטוי בהקשרים סרטן ופיתוח.
Introduction
היחסים בין כרומטין מתקפל לתוך הגרעין וארגון ספציפי של הגנום צברה ריבית משמעותית בשנים האחרונות, כמו זה הוכח יש קשר הדוק עם ג'ין-ביטוי-1,-2. בעוד הקשר המדויק בין פעילות הגן אפנון של הכרומטין נשאר לא ברור, זה יש כבר המשוערות האינטראקציות בין אנשי קשר כרומוזומלית כתוצאה ארגון דינמי כרומטין תלת מימדי לשרת ג'ין פונקציית רגולציה3. אכן, אפקט כזה הוכח טוב-מיקומה ג'ין גלובין האנושי, שבו אזור הבקרה לוקוס (LCR) מסדיר את הפעילות של גנים גלובין באופן התפתחותי מסוים על-ידי יצירת לולאה כרומטין בין שני אזורים4. עם זאת, זה והן באזורים אחרים, לא ברור אם כרומטין לולאה הוא גורם או תוצאה של שינויים בביטוי הגנים.
עד עכשיו, האתגרים בלימוד תופעה זו נותרה בעינה. למשל, ניסיונות אחרים גרימת כרומטין לולאות מעורב שינוי את רצף ה-DNA ליניארי או את הליכים מורכבים הדורשים שפע של ידע רקע על רכיבים ספציפיים המאפשרים לולאה5,6, 7,8. בנוסף, בזמן עבודה קודמות הציע שאת כרומטין לולאות נסיעה ביטוי גנים ב והקשר מסוימים המוגבלת7,8, רמת-כרומטין אילו לולאה משפיע על שעתוק באופן גלובלי אינו ברור. למרות התעניינות ההשפעה של לולאה ארוכי טווח על ביטוי גנים גדל בהתמדה בשנים האחרונות, שאלות שלא נענו על ביסוס ושימור אנשי קשר כרומטין לשנות פעילות הגן נמשכות.
הטכנולוגיה שתכננו מעסיקה נוקלאז לקוי באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) - CRISPR - הקשורים החלבון 9 (dCas9), כדי לאפשר התמקדות בהרחבה ישים כל לוקוסים גנומית9. טכנולוגיה זו מבטלת את סוגיות מורכבות הקשורות שינויים של רצף ה-DNA ליניארי, והוא נגיש בלי ידע מוקדם משמעותית של מרכיבים לולאה מסוים. בעיקר, הכלי הוא אוניברסלי וישימים בקנה מידה נרחב לולאות כרומטין מזוהה בפיתוח באותה מידה כמו מגוון רחב של מחלות, כמו סרטן. הכוח של CLOuD9 מומחש הפיכה משינוי מבנה לולאות לווסת ביעילות ביטוי גנים.
Protocol
1. gRNA עיצוב
- בחר כלי עיצוב סטנדרטי gRNA כדי לעצב את המדריך RNAs10. השתמש משלימים זוגות בונה CLOuD9 שפותחו בעבר9 (קרי, לפחות 1 S. aureus (CSA) ו 1 ס הפישחה ינפל תומימת (CSP) לבנות) עבור כל ניסוי.
- בתוך כלי העיצוב הנבחר באינטרנט, השתמש הרצף Protospacer סמוכים מוטיב (פאם) "הגולה" באורך מדריך של 20 bp CSP ופאם את רצף "NNGRRT" עם מדריך אורך 21 CSA.
- בחרו מדריכים מבוסס על ירידה לפרטים ניקוד ועיצוב מדריכים על שני הגדילים כדי למקסם את סיכויי קבלת מדריך עבודה.
- סדר oligonucleotides 2 לכל מורה דרך יצרן oligo: עבור oligo קדימה, להוסיף "caccg" עד הסוף 5' של הרצף מדריך, ולשם את oligo הפוכה, להוסיף "aaac" בסוף 5' ו "c" עד הסוף 3' לפני שמזמינים.
- בתחילה, עיצוב gRNAs 3-5 עבור כל אזור של עניין, על-פני אזור לחץ הדם 250-1000. להעריך את gRNA מיקוד יעילות כדלקמן:
- שיבוט מזוהה gRNAs לתוך פלסמיד פעיל Cas9 (ראה שלב 3), transiently transfect לתוך תאים 293T (ראה שלב 4)11.
- לגדל תאים עבור 2-3 d של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט דלקת), ולאחר מכן הקציר ולחלץ דנ א גנומי12.
- להגביר את אזורי ממוקד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). הפעלת מוצרים ב- 1.5% agarose ג'ל ולטהר להקות המתאים.
- ביצוע וזמינותו endonuclease של T7 כפי שמתואר את Guschin, et al. פרוטוקול13,14.
הערה: מדריכים יעילים הם אלה נקבע לחתוך DNA באתר היעד.
2. תרבית תאים
- לשמור על תאים בריאה, פעיל חלוקת המדינה.
- עבור K562s, תרבות בתקשורת רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 עם 10% FBS ו 1% עט חיידק.
- לגדול K562s בבקבוקון הצוואר הנוטה בזווית2 25 ס מ עבור תחזוקה ולהתאים את צפיפות התא לתאים 400,000 לכל mL בכל יום.
- לאחר K562s יש כבר transduced עם CLOuD9 בונה, להוסיף 2 µg/mL puromycin ו hygromycin µg/mL 100 למדיה תחזוקה.
- עבור 293Ts, תרבות של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 10% FBS ו 1% עט חיידק.
- לגדול 293Ts ב- 10 ס מ2 צלחות, מתפצלים כשהם confluent.
- עבור K562s, תרבות בתקשורת רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 עם 10% FBS ו 1% עט חיידק.
3. פלסמיד והכנה gRNA ההכנסה15
הערה: פלסמיד מפות זמינות בנספח, תחל מנוצל בניסויים דוגמה הינם זמינים במשלים טבלה 1.
- מיקס 5 µg של פלסמיד lentiviral CRISPR עם 3 µL של BsmBI, 3 µL של Phosphatase אלקליין, 6 µL של 10 x מאגר ולאחר µL 0.6 מ"מ שזה עתה הוכנו DTT. להביא את הנפח הכולל 60 µL עם ddH2O, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לעכל, dephosphorylate את פלסמיד.
- ג'ל לטהר את פלסמיד מעוכל, elute ddH2O.
- לערבב 1 µL של כל אחד המדריכים מזווג ב 100 מיקרומטר עם µL 1 של 10 x T4 מצדו מאגר, µL 6.5 ddH2O ו- 0.5 µL PNK T4, להגיע 10 µL הנפח הכולל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לאחר מכן כבש עד 25 ° C-5 ° C/min.
הערה: זה anneal זוג מדריכים. - לדלל את 1:200 מדריכים annealed (מתוך שלב 3.3) ב- ddH2O.
- לערבב 1 µL של פלסמיד מתעכל מהשלב 3.2 עם 0.5 µL של המדריכים מחוברים מדולל מהשלב 3.4, 2.5 µL של המאגר, µl 1 של ddH2O, ו- 0.5 µL של ליגאז, כדי לגרום לתגובה 5.5 µL סה. דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מאתרים ומפסיקים את מדריכים פלסמיד BsmBI מתעכל.
- להפוך את פלסמיד מחוברים החדש משלב 3.5 Stbl3 חיידקים ומגבירים באמצעות כל שיטה הכנה פלסמיד.
4. lentivirus ייצור
- ספירת 750,000 293T התאים לכל טוב של שש-באר צלחת באמצעות hemocytometer של, זרע אותם ב DMEM עם 10% FBS ו 1% עט חיידק. השתמש באר אחת עבור כל מבנה.
- 24 שעות לאחר זריעה, לשנות מדיה טריים תרופתיים DMEM עם 10% FBS.
- צינור אחד, לדלל µL 11 של ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים עם 150 µL של המדיום OptiMEM, לכל תגובה11.
- בשפופרת נפרדים, למהול 2 µg של פלסמיד וקטור lentiviral CLOuD9 מהשלב 3.6, 0.35 µg של pMDLg/pRRE, 1 µg של pRSV-Rev 0.65 µg של pMD2.G עם 150 µL של המדיום OptiMEM, לכל תגובה11.
- עבור כל תגובה, להוסיף את תערובות מדולל פלסמיד lentiviral הכימית תקנים מבוססי השומנים מדולל ביחס של 1:1, וכן תקופת דגירה של 5 דקות11.
- להוסיף האחסון כולו בכל המתחם מעורבות של שלב 4.5 לתוך הבארות בהתאמה של התאים 293T תרופתיים מהשלב 4.2.
- 48 שעות מאוחר יותר, לאסוף ייצור ויראלי מדיה על ידי pipetting לתוך צינור טריים ספין למטה ב g x 300 במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים כדי להסיר שאריות תאים שיורית.
- להשתמש בייצור נגיפי מדיה מיד התמרה חושית של התאים היעד או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
5. התמרה חושית lentivirus של תאים
- להוסיף 250 µL של כל הבונה ויראלי של הריבית (מורכב מ פלסמידים CLOuD9 משלימים) צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל תאים 80,000 עבור היישום CLOuD9.
- להביא את הנפח הכולל של מדיה בכל חרוט 1 מ עם תרופתיים מדיה, ולהוסיף polybrene ריכוז סופי של בין 1-8 µg/mL (הריכוז המרבי של polybrene נסבל על ידי סוג התא מנוצל צריך להיקבע השפעול).
- לסובב תאים ב g x 800 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואז resuspend על ידי pipetting מבלי להסיר את תגובת שיקוע ויראלי. להעביר את המתלים התא כולו צלחת התרבות תאים.
- 24 שעות לאחר התמרה חושית, תאים ספין למטה ב- g x 300 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- האחות תגובת שיקוע ויראלי, resuspend תאים בתקשורת תרבות תא רגיל.
- ביום הבא, להוסיף puromycin (1 µg/mL עבור תאים 293T), hygromycin (25 µg/mL עבור תאים 293T) המדיום התרבות התא כדי לבחור עבור תאים transduced כפליים. השפעול לקבוע את המתאים ריכוזי puromycin hygromycin עבור סוג תא נתון לפני תחילת הניסויים.
- לשמור תאים בתקשורת הבחירה לפחות 3 d לפני כל הניסויים במורד הזרם ולתחזק בתקשורת הבחירה עבור משך הזמן של כל הניסויים.
6. התא Dimerization לשטוף החוצה
- להוסיף 1 מ"מ חומצה אבציסית (ABA) או אמצעי אחסון המקבילה של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) עבור פקדים כדי תרבית תאים כדי dimerize את CLOuD9 שנבחרו transduced תאים. השתמש ABA בתוך 6 חודשים ממועד קבלת לשמור בקירור, להגן עליו מפני אור לאורך כל שימוש. יכול להיות מנוצל 2 מ מ ABA במידת הצורך.
- לשנות מדיה מדי יום כדי לספק ABA טרי (או דימתיל סולפוקסיד עבור פקדים) למשך כל הניסויים.
הערה: אין הגבלה על האורך של dimerization נצפתה עדיין.
- לשנות מדיה מדי יום כדי לספק ABA טרי (או דימתיל סולפוקסיד עבור פקדים) למשך כל הניסויים.
- הפוך dimerization דרך ההסרה של מדיה המכילה ABA ושטיפת תאים עם מספיק פוספט buffered מלוחים (PBS) כדי לכסות את פני השטח של הלוח, פעמיים. לאחר מכן, התרבות תאים בתקשורת ABA-חופשית כדי לשמור על מצב בלתי dimerized.
7. Immunoprecipitation ו Co-immunoprecipitations
הערה: להפוך את כל מאגרי טרי ומיד לפני השימוש.
- לאחר סיום dimerization ניסויים, איסוף ספין למטה תאים ואז תשאף תגובת שיקוע.
- Crosslink, להקפיא את התאים
- להפוך מלאי טרי של 1% פורמלדהיד PBS בטמפרטורת החדר, שימוש בחומרים טריים. עבור כל 2 מיליון תאים, resuspend בעדינות עם 1 מ"ל של 1% פורמלדהיד בטמפרטורת החדר בדיוק 10 דקות, תוך כדי סיבוב.
הערה: השתמש נפח מינימלי של 10 מ"ל עבור crosslinking פחות מ-10 מיליון תאים. - להרוות crosslinking עם התוספת של גליצין כדי ריכוז סופי של 0.125 מ', ואחריו הדגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, תוך כדי סיבוב.
- ספין למטה תאים ולשטוף x 1-2 עם PBS קר כקרח. תא כדורי ניתן אז הצמד קפוא חנקן נוזלי, מאוחסן ב- 80 ° C או שימוש באופן מיידי.
הערה: חום תהפוך crosslinks פורמלדהיד. מיהר, ניתן לאחסן תאים ישירות ב- 80 ° C ללא להקפיא את הצמד.
- להפוך מלאי טרי של 1% פורמלדהיד PBS בטמפרטורת החדר, שימוש בחומרים טריים. עבור כל 2 מיליון תאים, resuspend בעדינות עם 1 מ"ל של 1% פורמלדהיד בטמפרטורת החדר בדיוק 10 דקות, תוך כדי סיבוב.
- להכין נוגדן/חרוז המספר המשלים
הערה: אופטימיזציה תנאים שבחרת נוגדנים (כלומר, בדיקה פירוק שונים מאגרים עבור פירוק התא וביצוע IP) עשוי להיות כדאי. שני בופרים הנפוצים, מאגר פירוק פצאל ומאגר ששינה ריפה, יכולה להיות השפעה משמעותית על יעילות ה-IP ואת sonication יעילות. כל מאגר יצירות ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. בנוסף, עליך לזכור כי כרומטין sonication עשויה להימשך מספר שעות.- Resuspend חרוזים מאת vortexing לזמן קצר לפי הצורך הנוגדן שבחרת.
- להעביר כמות מספקת של חרוזים לניסוי צינור 1.5 מ. כנקודת התחלה, להשתמש µL 20 של חרוזים בכל µg 1 של נוגדן. אל תוסיף עוד נוגדנים.
הערה: להשתמש נוגדנים µg 10 עם 200 µL של חרוזים 1 מ ג של סכום lysate כנקודת התחלה, אלא אם כן זה ידוע כי הנוגדן הוא פחות או יותר יעיל מאשר זה ירמוז. חלבונים נמוכה שפע, יחס זה ייתכן שיהיה צורך להתאימם. - אם משתמש מאגר פירוק פצאל, לשטוף 3 x במאגר דילול IP. אם משתמש מאגר פירוק ריפה, לשטוף 3 x במאגר פירוק ריפה.
- Resuspend חרוזים באמצעי אחסון הסופי של המאגר באותו מצעד 7.3.3 (IP דילול או מאגר ריפה) זה > 1 x ו- < 5 x האחסון הראשונית. קרי עבור 100 µL חרוז הראשונית אמצעי אחסון, להשתמש בין 100 ל 500 µL resuspension הסופי נפח.
- מוסיפים נוגדן חרוזים שטף (י) ב- הריכוז המתאים. טוב HA או דגל נוגדן ל IP CLOuD9 בונה, להשתמש נוגדנים ב- 1:50 (µg חלבון: חלבון µg lysate) דגירה בין 8 + h עם לינה ב 4 ° C, תוך כדי סיבוב. לחלופין, נדרשת תקופת דגירה של 2-4 שעות בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע של חרוזים וזורקים.
- שטיפת חרוזים 3 x עם המאגר לשטוף.
- Resuspend באמצעי אחסון מינימלי של מאגר מנוצל עבור הדגירה לילה עם הנוגדן (IP דילול או מאגר ריפה). לשמור בקירור עד בשילוב עם חלבון lysate.
- Sonicate כרומטין
- תחילה lyse תאים עם התוספת של נפיחות המאגר כדי תא כדורי על קרח למשך 10 דקות, מצליף תאים בכל מין כמה כדי למנוע ליישוב.
הערה: בדרך כלל, µL 500 של נפיחות מאגר הוא הוסיף על 25 מיליון תאים טיפס משם, אבל האם לא להשתמש פחות מ- 500 µL מאגר עבור < 25 מיליון תאים. - דאונס ידנית הן בכיוון השעון ונגד כיוון השעון, 13 x אחד.
- ואז גרעינים ספין למטה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 1,500 x g... תשאף את תגובת שיקוע לחלוטין חוזר כדי להסיר את תגובת שיקוע הנותרים ואז לשקול בגדר תא במ ג.
- להוסיף מעכב פרוטאז למאגר פירוק גרעיני (פצאל מאגר או ריפה מאגר, מעל, בחרו אחת).
- להוסיף x 10, כמות גרעינים פירוק המאגר מגורען גרעינים כדי resuspend (לדוגמה, להוסיף 1 מ"ל של גרעינים פירוק מאגר גלולה 0.100 g). בקצרה מערבולת ואת lyse למשך 10 דקות על קרח.
הערה: זכור את הגודל של הצינור sonication. אחסון אידיאלי הוא לעיתים קרובות < 1 מ"ל, אז דגימות ייתכן שיהיה צורך לחלק אם כדורי גדולים במיוחד.- עבור Co-IP, sonicate גרעינים בקצרה כדי solubilize חומר להרוות מרחביות לרמה המאפשרת immunoprecipitation עם 2-3 כרכים דילול מאגר ולאחר מכן המשך לשלב 7.4.6. נוגדנים מאוד רגיש, להוסיף מאגר דילול נוסף כדי לצמצם עוד יותר את ריכוז מרחביות.
הערה: עצור sonication כאשר מנקה lysate; זה ישתנה מ אטום/שקוף לבן שקוף לחלוטין. לשמור דגימות קר ככל האפשר, לא על sonicate. - שבב, ביסודיות sonicate דנ א כדי לקבל שברי DNA bp 150-1000 ולאחר מכן המשך לשלב 7.4.6.
- עבור Co-IP, sonicate גרעינים בקצרה כדי solubilize חומר להרוות מרחביות לרמה המאפשרת immunoprecipitation עם 2-3 כרכים דילול מאגר ולאחר מכן המשך לשלב 7.4.6. נוגדנים מאוד רגיש, להוסיף מאגר דילול נוסף כדי לצמצם עוד יותר את ריכוז מרחביות.
- ספין-אוף חומרים לא מסיסים במהירות מקסימלית 10 דקות ב 4 º C.
- העברת חומר מסיס צינור טריים.
- עבור Co-IP, למדוד את הריכוז של חלבון והמשך הנפתח בשלב 7.5.
- שבב, להסיר את aliquot 10 µL של פינו lysate ולהוסיף 40 µL IP • תנאי מאגר µL 6 5 מ' NaCl לזה עבור סכום כולל של 56ul. מרתיחים למשך 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, להוסיף 5-10 µL של 3 מ' NaOAc pH 5, לנקות על עמודה טיהור PCR. למדוד את הריכוז של ה-DNA על ידי מדידה של ספיגת ב-260 nm ו לתקנן מדגמים. לאחר מכן המשך הנפתח בשלב 7.5.
הערה: תוספת lysate יכול להיות snap קפוא ב- 80 ° C בשימוש במועד מאוחר יותר, אבל התוצאות הטובות ביותר מתקבלים מן הטרייה lysate. אם קפוא, לא ההקפאה/ההפשרה lysate יותר מפעם אחת.
- תחילה lyse תאים עם התוספת של נפיחות המאגר כדי תא כדורי על קרח למשך 10 דקות, מצליף תאים בכל מין כמה כדי למנוע ליישוב.
- טלסין (pulldown)
- להעביר כמות מספקת של חלבון lysate צינור טריים. אם משתמש מאגר פירוק פצאל, לדלל כרכים 2.1 IP דילול מאגר (לעיל).
- להפריש µL 100 של תגובת שיקוע עבור פקד קלט, ולאחסן ב 4 ° C עד למחרת.
- להוסיף חרוזים/נוגדן המספר המשלים משלב 7.3.8 דגימות עכשיו.
- לסובב דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וודאו כי אין מספיק נפח עבור התנועה נוזל צינורות 1.5 mL.
- רוחצים את Elute
- לאחר סיבוב לילה, שמור את תגובת שיקוע השבר nonbinding. לאחר מכן לשטוף חרוזים 3-5 x במאגר דילול IP.
- להכין מאגר • תנאי IP בטמפרטורת החדר, ללא מעכבי.
- Elute מתחמי עם 50 µL • תנאי מאגר מזועזע על מערבולת ב 67 מעלות צלזיוס עבור • תנאי העברת 15 דקות לרכבת התחתית החדשה ומשלבים אני חוזר עם עוד 50 µL. שניהם עבור • תנאי 100 µL הכולל.
הערה: אם יש יותר מדי רקע של ההליך • תנאי זה, חום יכול להיות מופחת או לסלק בתהליך רועד/דגירה. זה בדרך כלל מפחיתה את התשואה של חלבון המטרה אך להקטין באופן משמעותי את הרקע.
- הפוך crosslinks על ידי חימום ב 67 מעלות צלזיוס במשך > 4 שעות.
הערה: זה אינו הכרחי עבור שיתוף IPs אבל יכול להיות מועיל.- עבור Co-IP, כדי להבטיח dimerization מלאה בין המטרות של עניין, שהופעלו eluates ג'ל מרחביות-דף בדיקה עם נוגדנים נגד HA התג או תג דגל, כמצוין, הכל ב 1:1000. לאחר מכן המשך לשלב 8.
- שבב-qPCR, כדי להבטיח לוקליזציה הנכון והיעדים של כל רכיב CRISPR-dCas9, נקי • תנאי המוצר על עמודה, elute ב- 10 µL. בצע בזמן אמת כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA מטוהרים. תחל מנוצל הנתונים שהוצגו זמינות משלים טבלה 1. לאחר מכן המשך לשלב 8.
8. RNA חילוץ ו- PCR כמותי
- כדי לחקור את CLOuD9-induced שינויים בביטוי הגנים, ראשית, לבודד ולטהר RNA הכולל בקרת תא כדורי והן תא dimerized כדורי.
- להפוך DNA משלימים (cDNA) הרנ א מטוהרת על ידי שעתוק במהופך17 ולבצע ניתוחים qPCR. תחל זמינות משלים טבלה 1.
9. כרומוזום קונפורמציה ללכוד Assay
- כדי לצפות שינויים בשכיחות של אנשי קשר לוקוסים גנומית שנגזרות CLOuD9, לבצע לכידת קונפורמציה כרומוזום (3 ג) מבחני8.
- לכמת 3C מוצרים מצדו של שתי קבוצות של כפילויות עבור כל אחד שלושה משכפל ביולוגי על-ידי ה-PCR כמותי בזמן אמת. לנרמל דוגמאות על האותות 3 ג מ מיקומה טובולין. תחל זמינות משלים טבלה 1.
Representative Results
CLOuD9 המניע יזם הפיכה β-גלובין-לולאה LCR. שימוש נאות של מערכת CLOuD9 מעניקה מגע הפיך של CSA משלימים ובונה CSP CLOuD9 באמצעות הוספה או הסרה של ABA תא תרבות התקשורת (איור 1 א'). בונה CSA, CSP (איור 1b) הם נקודתיים לאזורים גנומית המתאים באמצעות תקן CRISPR gRNAs. בהתחשב התיעוד נרחב מיקומה גלובין האנושי כמו גם קיפול כרומוזומלית בתדירות גבוהה ו שחלוף שמתרחשת שם במהלך הפיתוח, אזור זה נבחר כדי להדגים את תוכנית השירות של מערכת CLOuD9. בנוסף, הקו תא K562 נבחר כי הוכח לבטא באופן עקבי רמות גבוהות של הגן γ עוברית-גלובין, לעומת הגן β-גלובין מתבטאת בדרך כלל בתאים השושלת erythroid למבוגרים בריאים. באמצעות התאים K562, היכולת של CLOuD9 לשינוי גנים יכולים להיבדק על ידי ניסיון לשחזר את ביטוי הגן β-גלובין בשורה זו התא.
לפני אינדוקציה של dimerization, כרומטין PCR כמותי-immunoprecipitation (שבב-qPCR) היה מנוצל כדי להבטיח לוקליזציה מדויקת ומיקוד של כל רכיב CLOuD9 (משלים באיור 1). בנוסף, co-immunoprecipitation (Co-IP) עם או בלי ABA לאמת dimerization CSA, CSP בנוכחות ליגנד, כמו גם הפיכות בהיעדר ליגנד (איור 1 c ו משלים איור 2). 24 שעות לאחר הוספת ABA, מגע גדול יותר בין β-גלובין את LCR הופיע כפי שנמדד על ידי לכידת קונפורמציה כרומוזום (3 ג) בתאים עם שני החלקים dimerization, אבל לא על פקדים שמכילים רק שני מבנים CSA או CSP, ובכך מאמת ייחודה של השינוי כרומטין של האתרים יישוב (איור 1 c ו משלים דמויות 3,4). יצירת אינטראקציה LCR-β-גלובין לא מונע לחלוטין את הקשר LCR-גלובין אנדוגני, אך במקום זאת, הוסיף הקשר המקורי, כפי שדווחה בעבר8. עליות באנשי β-גלובין/LCR נצפו עבור עד 72 שעות של dimerization, ללא קשר לאזור שבו המדויק בתוך יישוב LCR ו β-גלובין יזם אזור (דמויות משלים 5,6). לבסוף, הפיכות של המערכת אושר עם 3c לאחר הסרת ABA, אשר הראו חידוש מוחלט קונפורמציה אנדוגני (איור 1 ד ו- 3 דמויות משלים-6).
אנחנו נחשבים כי ההצלחה המוצגים בתאים K562 עשוי להיות תוצאה של המיקום לוקוס גלובין באזור של euchromatin (איור 1-d), אז קו תא השני היה מנוצל כדי לחקור את הרעיון הזה. מערכת CLOuD9 הוחל על תאים 293T HEK באזורים heterochromatic, שאינם מבטאים גלובין גנים (איור 1e). התוצאה הייתה דומה מה נצפתה ב K562s; יותר עמותות LCR β-גלובין נמדדו על ידי 3C אחרי 24 שעות עם אבא (איור 1e ו משלים איור 3), מתן עדות ליכולת חזקים של CLOuD9 לתפקד בסביבות שונות הסלולר, למרות המדינה כרומטין המקורי או קונפורמציה.
לוקוסים נוספים נבדקו כדי להבטיח את הישימות של CLOuD9, כולל ייצוג המקדם Oct4 משפר דיסטלי 5' בתוך תאים 293T רחבה. בעבר, היו אף ביטוי Oct4 לזיהוי בשורה זו תא ואנשי עוד, אין קשר אנדוגני תיאר. עדות Oct4 ביטוי בתאי גזע עובריים כתוצאה ממגע עם דיסטלי 5' משפר המניע את הניסוי הזה, לאותה התוצאה נצפתה בβ-גלובין לוקוס18. הקשר בין Oct4 משפר דיסטלי ומפיץ זוהה התאים CLOuD9 זמינה, אך לא התאים בקרה (איור 1f). בנוסף, זה היה ציין Oct4 יזם ואינטראקציה דיסטלי 5' משפר גם בקשה משפר 3' ליצור קשר עם יזם את Oct4. אירוע זה עולה בקנה אחד עם ראיות כי 3' משפר אינטראקציה עם Oct4 יזם/5 ' מורכבות במהלך הפעלת גנים אנדוגני10דיסטלי משפר.
CLOuD9 מעוררת הקשר שינויים ספציפיים-לוקוסים גן. לאחר שנוכח כי המערכת CLOuD9 אכן זירוז כרומוזומלית. אנשי קשר גנטי לוקוסים, אנחנו ביקשו לבחון את ההשפעה של הלולאות על ביטוי גנים. זה תועד, כי שעתוק גלובין, Oct4 הגנים הם מכסה על המגעים בין את לוקוסים גן LCR ו גלובין ובין דיסטלי 5' משפר לבין Oct4 מקדם, בהתאמה1,11. לפיכך, אנו המשוערות וששימוש את CLOuD9 מערכת נסיעה כרומטין היווצרות לולאה בכל אחד מאזורים אלה יגרמו בביטוי הגנים משכנעת.
ב שני לוקוסים, RT-qPCR הפגינו את כרומטין ABA המושרה לולאות נסע מגביר בביטוי Oct4 בתאים 293T, וβ-גלובין ביטוי בתאי K562, אבל לא 293Ts (איור 2 א). למרות התוספת של ABA לתא תרבות עבור קטנה כמו 24 h מוגברת β-גלובין ביטוי משמעותי, ביטוי המשיכה להגדיל בהתמדה עד 72 שעות, היה הפיך על כשלון ABA (איור 2 א). כל התאים K562 חוץ הפקדים בעקבות מגמה זו, לא משנה איפה הרכיבים dimerization היו ממוקמים באזורים LCR ו β-גלובין יזם (איור 2 א ו משלים דמויות 7, 8). כדי לתמוך ממצאים אלה, שבב-qPCR של H3K4me3 ו- RNA Pol-II-מיקומה β-גלובין ב K562s ו 293Ts התכתב עם שינויים שנצפה שעתוק (איור 2 c-f).
CLOuD9 יוצר לולאות כרומטין יציב. למרות אינדוקציה לולאה לטווח קצר עם CLOuD9 בבירור עקב ציפיות, בין אם אינדוקציה לטווח ארוך של לולאה אפקטים דיפרנציאלית נשארה שחלים. כדי לחקור, התאים היו תרבותי בנוכחות ABA במשך 10 ימים. בעוד הן K562s והן 293Ts הציג עלייה בתדירות הקשר בין מיקומה β-גלובין את LCR ביחס פקדים (איור 3 א, b ודמויות משלים 9,10), עדיין רק נצפו שינויים בביטוי β-גלובין בתאי K562 (איור 3 c). מעניין, עם זאת, זה היה ציין כי לטווח ארוך dimerization ב K562s, איפה שעתוק הייתה חריפה upregulated, היה לא הפיך יותר (איור 3 א ו משלים דמויות 9-11). עם זאת, ב- 293Ts, שבו אין שינוי בתעתיק נצפתה בעקבות dimerization לטווח ארוך, המושרה שינויים באנשי כרומטין נותרה הפיך (איור 3b ו משלים איור 9).
בסך הכל, רק ירידה קטנה בביטוי הגנים נצפתה לאחר 10 ימים של הסרת ABA, אשר נותרה גבוהה בצורה משמעותית מזו רמות ביטוי גנים לפני dimerization (איור 3 c). בהתאם, תאים K562, אך לא תאים 293T, הראו שינויים מתמשכת H3K4me3 ו- RNA Pol-II-β-גלובין מיקומה על ידי שבב-qPCR, לעומת פקדים, גם לאחר 10 ימים של הסרת ABA (איור 3d-f). לכן, התוצאות שלנו מציינים כי היציבות של הלולאה כרומטין מרמז על ביטוי גנים בר קיימא יותר.
איור 1: CLOuD9 המניע יזם הפיכה β-גלובין-לולאה LCR. תוספת של חומצה אבציסית (ABA, ירוק) (א) מביא שני מבנים CLOuD9 משלימים (CLOuD9 ס' הפישחה ינפל תומימת (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), אדום וכחול, בהתאמה) לתוך קרבה, שיפוץ הכרומטין. הסרה של ABA משחזר את קונפורמציה כרומטין אנדוגני. (b) בונה CLOuD9 לשלב טכנולוגיה CRISPR-dCas9 S. aureus ו ס הפישחה ינפל תומימת עם תחומים הפיכה dimerizeable PYL1 ו- ABI1. (ג) ציר הזמן של CLOuD9 dimerization ניסויים. (ד) ג 3 assay מדידה תדרים רחב לוקוס crosslinking β-גלובין בתאים K562 לאחר 24 שעות של טיפול ABA (אדום), לאחר מכן שטיפה (כחול) מציג הפיכות של המושרה β-גלובין/LCR אנשי קשר (מודגשים באפור). ראשי חץ כתום עולה ספציפי CLOuD9 הבונה המטרה אזורים. השבר EcoRI המכיל רגישות יתר האתרים 1-4 של LCR (פס שחור) שימש האזור עוגן. תדירותו crosslinking עם שברי EcoRI המצוין אחרים (שמות בראש הגרף) היו העריכו. Β אנושי-גלובין גנים ואתרי רגישות יתר LCR מתוארים בתחתית הגרף עם קואורדינטות כרומוזומלית. נתונים שבב-seq של H3K4me3 ושל H3K9me3 להדגים כי האזור הזה היא תהיה ב- K562s- (e) בדומה לשינויים הפיכים הכרומטין נראים בתאים HEK 293T, למרות עדויות H3K4me3 של H3K9me3 שבב-seq נתונים זה גלובין האזור הוא heterochromatic בסוג זה של התא. מדידת Oct4 תדרים רחב לוקוס crosslinking אצל 293T assay (נ) ג 3 תאים לאחר 72 שעות של טיפול ABA (אדום) מציג המושרה Oct4/דיסטלי אנשי קשר enhancer (מודגשים באפור). ראשי חץ כתום עולה ספציפי CLOuD9 הבונה המטרה אזורים. השבר MboI המכיל את מקדם Oct4 (פס שחור) שימש האזור עוגן. תדירותו crosslinking עם שברי MboI המצוין אחרים (שמות בראש הגרף) היו העריכו. האזורים Oct4 האנושי מתוארים בתחתית הגרף עם קואורדינטות כרומוזומלית. כל תוצאות 3 ג, התקבלו לפחות שלושה ניסויים עצמאית. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין. עבור β-גלובין, נקבעו התדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS לאפס. עבור Oct4, נקבעו התדרים האינטראקציה בין השבר עוגן קטע שליטה שלילי מחוץ לאזור שמעצבת Oct4 לאפס. קווי שגיאה לציין ש n = 3. איור זה שונה מ- איור 1 מורגן, סטפני ל', et al. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: CLOuD9 גורם שינויים ספציפיים בהקשר במצב כרומטין וביטוי גנים. (א) CLOuD9-induced כרומטין לולאה על מיקומה β-גלובין תוצאות אינדוקציה הפיך β-גלובין הביטוי K562s אך לא 293Ts. משמעות בהתחשב ביחס תאים שליטה מטופלים. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; נ. ס שאינם משמעותיים. קווי שגיאה לציין ש n = 3. (b) אינדוקציה של Oct4 ביטוי נצפתה ב 293Ts בעקבות CLOuD9-induced לולאה על מיקומה אותו. החשיבות ניתנת ביחס תאים שליטה מטופלים. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, t = 4.562, df = 2. קווי שגיאה מציינים ש (ג) תיאור סכמטי של שבב-qPCR מיקומים פריימר לאורך הגוף הגן β-גלובין. (יח, e) שבב-qPCR מדגים הפיך שינויים בעקבות CLOuD9-induced לולאה H3K4me3-מיקומה β-גלובין K562s אך לא 293Ts. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. קווי שגיאה מציינים ש (נ) CLOuD9 שינויים בתיווך בתעתיק β-גלובין ב K562s להתכתב עם העלאות תפוסת RNA Pol-II על פני מכלול של הגוף הגן β-גלובין. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. קווי שגיאה לציין ש דמות זו שונתה איור 2 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: CLOuD9 יוצר לולאות כרומטין יציב שמווסתים ביטוי גנים חזקים בעקבות dimerization לטווח ארוך. (א, ב) ג 3 assay מדגים כי K562s אבל לא 293Ts, כרומטין CLOuD9-induced לולאה הופך להיות בלתי הפיכים לאחר 10 ימים של טיפול ABA, אפילו כאשר ABA מוסר עד 10 ימים נוספים. כל 3C התקבלו תוצאות לפחות שלושה ניסויים עצמאית. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS היו מוגדר כאפס. קווי שגיאה לציין ש n = 3. (ג) מייצב Loop ב- K562s תוצאות בביטוי מתמיד של β-גלובין, גם לאחר 10 ימים של ABA שטיפה. אין שינויים בביטוי β-גלובין הם נצפו 293Ts. משמעות בהתחשב ביחס תאים שליטה מטופלים. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * * * P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; נ. ס שאינם משמעותיים (d) שבב-qPCR מראה העלאות H3K4me3 סימני על מיקומה β-גלובין בתגובה CLOuD9-induced לולאה מתקיימים לאחר 10 ימים של ליגנד כשלון ב- K562s. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. (ה) אין שינויים משמעותיים ב- H3K4me3 אותות הבאים לטווח ארוך dimerization נצפתה על ידי שבב-qPCR 293Ts- (נ) גדל RNA Pol-II תפוסה של מיקומה β-גלובין בעקבות אינדוקציה לולאה לטווח הארוך נשמר ב- K562s לאחר 10 ימים של ליגנד שטיפה. דו-זנבית של סטודנט t-בדיקות * P < 0.05, * * P < 0.001, * * * P < 0.0001. כל קווי השגיאה לציין ש דמות זו שונתה איור 3 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: בונה CLOuD9 לשפה לאזורים שלהם לקהלי היעד. Immunoprecipitation כרומטין וקבועים PCR של CLOuD9 כמותיים מדגימים לוקליזציה הנכון שלהם מנחלת גנומית המיועד. דמות זו שונתה משלים איור 1 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 2: בונה CLOuD9 הפיכה לשייך בתגובה טיפול ABA- Co-immunoprecipitations הפגנת האגודה של החלבונים dCas9 הבאים 72 h של טיפול ABA הוא מתהפך הבאים הבאים 72 h של ליגנד שטיפה. דמות זו שונתה משלים איור 2 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 3: בקרת הטיפול גורם ללא שינויים באנשי כרומטין. טיפול עם דימתיל סולפוקסיד, סוכן שליטה, למשך 24 שעות המניע שאין שינוי קונפורמציה כרומטין אנדוגני מאת 3C או תאים K562 או HEK 293Ts. 3 ג הערכים היו מנורמל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS נקבעו לאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. דמות זו שונתה משלים איור 3 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים באיור 4: תאי בקרה CLOuD9 transduced הצג אין שינויים בכרומטין לולאה. בימוי שניים CLOuD9 בונה גם את LCR או יזם β-גלובין המניע ללא שינויים משמעותיים במבנה כרומטין מאת C 3 בעקבות טיפול ABA טיפול בקרה. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS היו מוגדר כאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. איור זה השתנה מ 4 איור משלים מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 5: יצירת לולאה כרומטין CLOuD9 נשאר הפיכים לאחר 72 שעות של dimerization. 3 ג assay ב K562s מדגים הפיכות של CLOuD9 המושרה β-גלובין/LCR אנשי קשר לאחר 72 שעות של טיפול ABA. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS היו מוגדר כאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. איור זה השתנה מ 5 איור משלים מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 6: CLOuD9 לולאה β-גלובין/LCR המושרה לא מושפע באתר היעד גלובין. בימוי CSA, CSP בונה לאזורים חלופי את LCR או בתוצאות יזם β-גלובין דומה לשינויים הפיכים אינדוקציה לולאה על ידי 3C לאחר 72 שעות של טיפול ABA. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS היו מוגדר כאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. דמות זו שונתה משלים איור 6 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 7: CLOuD9 המושרה שינויים בביטוי הגנים מתקיימים ללא קשר לאתר היעד גלובין. בימוי CSA, CSP בונה לאזורים חלופי של האמרגן β-גלובין, LCR שאין לה השפעה על אינדוקציה של ביטוי גנים בעקבות 72 h של dimerization. אולם בעוד כמה להשפעה על ביטוי גנים הבאים dimerization לטווח ארוך (10 יום) נצפתה, רמות גבוהות של β גלובין ביחס תאים שליטה מטופלים היו כשלון ליגנד הבאים הבאים מתמשכת במשך עשרה ימים נוספים. החשיבות ניתנת ביחס תאים שליטה מטופלים. 0.001 <p , t = 10.25, df = 5; p < 0.0001, נותר נכון t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; נ. ס שאינם משמעותיים. כל קווי השגיאה מצביעות על SD. דמות זו שונתה משלים איור 7 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 8: תאי בקרה CLOuD9 transduced להראות אין שינויים בביטוי β-גלובין. בימוי שניים CLOuD9 בונה גם את LCR או יזם β-גלובין המניע ללא שינויים משמעותיים בביטוי β-גלובין בעקבות טיפול ABA טיפול בקרה. החשיבות ניתנת ביחס תאים שליטה מטופלים. נ. ס שאינם משמעותיים. דמות זו שונתה משלים איור 8 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 9: טיפול בקרה לטווח ארוך גורם ללא שינויים באנשי כרומטין. טיפול עם דימתיל סולפוקסיד, סוכן שליטה, במשך 10 ימים המניע ללא שינוי קונפורמציה כרומטין אנדוגני מאת 3C או תאים K562 או HEK 293Ts. 3 ג הערכים היו מנורמל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS נקבעו לאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. דמות זו שונתה משלים איור 9 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 10: ארוך טווח CLOuD9 לולאה β-גלובין/LCR המושרה לא מושפע באתר היעד גלובין. בימוי CSA, CSP בונה לאזורים חלופי LCR או β-גלובין יזם בתוצאות בדומה מתמשכת לולאת השראה כפי שמתואר על ידי 3C לאחר 10 ימים של טיפול ABA ו 10 ימים של ליגנד עוקבות שטיפה. 3 ג הערכים היו מנורמל ל טובולין, תדרים האינטראקציה בין השבר עוגן השבר המקיף השבר β/HS היו מוגדר כאפס. קווי שגיאה מציינים SD. n = 3. איור זה השתנה מ 10 איור משלים מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים איור 11: בונה CLOuD9 בלתי הפיך לשייך בתגובה טיפול ABA לטווח ארוך- Co-immunoprecipitations הוכחת התאחדות בלתי הפיך של CSA, CSP dCas9 החלבונים לאחר 10 ימים של טיפול ABA ו 10 ימים הבאים של ליגנד שטיפה. איור זה השתנה מ 11 איור משלים מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים טבלה 1: רשימת פריימר רצף gRNAs, לרביעיית-PCR, 3 ג של שבב qPCR. טבלה זו שונתה משלים טבלה 1 מורגן, סטפני ל', ואח. 9. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה
Discussion
The most נמצאים בשלבים קריטיים CLOuD9 כרומטין לולאה: 1) בעיצוב או באמצעות gRNAs את הנכון, מדיה 2) המשתנים מדי יום על תאים CLOuD9-transduced, לרבות ABA או דימתיל סולפוקסיד, 3) שמירה על הטריות של ABA, וביצוע 4) הערכות מדויקות וזהיר של קונפורמציה כרומטין.
הגבולות של CLOuD9 מתגוררים בעיקר ביכולת לעצב מדריכי לאזור היעד של בחירה. מדריך RNAs לבצע משימה חשובה של הרכיבים dCas9 לאזורי היעד דנ א כדי להיות dimerized ביצעה התאמה לשפות אחרות, היעילות של המדריכים מבוססים על אתר היעד הספציפי שלהם. ללא הרכיבים gRNA הנכון, CLOuD9 המערכת לא תהיה אפשרות ליצור הפיכה המושרה לולאות. לפיכך, על-ידי עיצוב מדריכים מרובים עבור כל אזור בעל עניין שמתפשטת המדריכים באזור של 250-1000 bp, מדריך מוצלח אחד לפחות יובטח. מדריך מיקום הוא גם חלק בלתי נפרד תוצאות מדויקות. חשוב להימנע מכווני הנמצאים ב אתרי הקישור של פקטור שעתוק או אזורים קריטיים אחרים כדי למנוע תופעות רקע כגון למעלה או למטה רגולציה של שעתוק. בנוסף, מיקומו המדוייק של הבונה CLOuD9 עלולה מעט על שעתוק של הגן היעד. זה מדגיש את החשיבות של בדיקות מרובות זוגות של מדריכים לכל אזור היעד, כדי לזהות את זוג החזקה ביותר למטרות ניסוי. עוד, בכל צמד אזורי היעד, הבונה CSA צריך להיות ממוקד עם gRNAs עבור S. aureus, הבונה CSP צריך להיות יעד עם gRNAs הפישחה ינפל תומימת ס הכוונת ירידה לפרטים.
כדי להבטיח תוצאות מדויקות dimerization הנכון, חשוב גם לשמור על הרעננות של סביבות הסלולר בעקבות את התמרה חושית של המבנה CLOuD9. מדיה יומי לשנות ומבטיחה התוספת של dimerizer טרי (או שליטה) כי המבנה משלימים נשארים בסמיכות ולשמר קונפורמציה כרומטין שינו. יתר על כן, המבטיח אבא טרי ולא אוחסן כיאות על-פי הפרוטוקול של היצרן (נפתח בתוך 6 חודשים, כל הזמן קר, מוגנים מפני אור) חיוני להשגת תוצאות אותנטי.
ראוי לציין, dimerizer ABA עבור CLOuD9 שימש עם החלבונים dimerization אסתי, PYL, ולא יותר נפוץ מנוצל FRB ומערכת FKBP. הצורך של rapalog המערכת FRB/FKBP מוגבלת תחולת CLOuD9, בשל רעילות תאים סרטניים. מערכת ABI/PYL חלופי עקפו מגבלה זו, באופן יעיל המאפשר CLOuD9 להיות רחב יותר utilizable.
באופן קולקטיבי, פיתחנו CLOuD9, טכנולוגיה ייחודית וחזק יכול בכפייה אך הפיכה ליצור אנשי קשר בין לוקוסים גנומית היעד לטווח ארוך. דרך גרימת כרומטין לולאות, אנחנו גם להוכיח כי CLOuD9 יכול להיות מנוצל כדי לשנות ביטוי גנים בהקשר הסלולר המתאימה. יכולת ההתאמה של הטכנולוגיה מאפשרת לימוד בלתי מוגבלת של האינטראקציות בין כל שני לוקוסים גנומית, מבלי לדרוש ידע מוקדם של לולאה אזורים או לולאה מנגנונים. בנוסף, הפיכות והפגינו ייחודי של CLOuD9 מאפשר בהמשך בחינת המנגנונים לולאה מחלות ופיתוח. בעוד ההשפעות על המטרה של כרומטין לולאה הוכחו בבירור, יש עדיין להיות נתונים מציע תובנה ההשפעות של לולאה חופש-יעד וההשפעה עוקבות על הלולאות ביעד.
הנתונים שלנו ממחישה רק כמה יישומים של כלי זה, אך מרמז את הרעיון שבבסיס הגדולות כרומטין הסדר היא מעידה על ביטוי גנים. הטכנולוגיה שלנו יכול לשמש כדי לחקור ולחשוף את הדקויות של הכרומטין בהכונה, ובכך לשפר את ההבנה הכוללת של התפקיד של כרומטין מתקפל לתוך שעתוק של גנים. הבנה טובה יותר של הדקויות של דינמיקה תעתיק יכול להוביל את הדרך מחקר וטיפול של סרטן, מחלות תורשתיות, והפרעות מולדות, בכרומטין ברורים אשר הרכבה הפיצולים ללא ספק ביטוי גנים20, 21,22,23. העבודה הבאים ניצול הטכנולוגיה CLOuD9 דולקת עוד פרטים על הסדר ועל הדינמיקה של כרומטין תחומים, איך שמעבידים קיפול כדי לקיים את ביטוי גנים יציב פיתוח והן המחלה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ה צ'אנג, טי אורו, ס' Tavazoie, R. פלין, עמ' בטיסטה, קאלו אי ו המעבדה וואנג כולו עבור תמיכה טכנית וקריאה ביקורתית של כתב היד. S.L.M. נתמכו בעבודה זו דרך של NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028), המכון הלאומי לסרטן (1F99CA222541-01). K.C.W. נתמכת על ידי פרס הקריירה עבור מדענים רפואיים מהקרן Wellcome בורוז, הוא אי דונלד, דיליה ב בקסטר קרן סגל חוקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
| DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
| lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
| pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
| pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
| pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
| anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
| anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
| DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
| RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
| Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
| SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
| Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
| anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
| anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
| EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
| 4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
| anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
| K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
| Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
| PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
| FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
| FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
| 10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
| T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
| 2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
| Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
| Buffers | |||
| Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
| Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
| IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
| Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
| Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
| Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
| IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |
References
- Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
- Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
- Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
- Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
- Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
- Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
- Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
- Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
- Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, 13 July (2017).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
- Lipofectamine 2000 Reagent. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).
- DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2006).
- Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , New England BioLabs. (2016).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
- Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
- RNeasy Mini Handbook. , QIAGEN. (2012).
- SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).
- Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
- Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
- Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
- Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
- Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
