Summary
Tillgänglighet av somatiska SCs är avgörande för regenerativ medicin, sjukdom modellering och att få inblick i SC boenden. Presenterar här vi experimentella strategier att programmera om, in vitro, åtskillnad mellan vuxna celler till deras motsvarande utbyggbart vävnadsspecifika stam/stamceller av övergående uttryck för den enda transkriptionell samtidig aktivatorn YAP.
Abstract
Här presenterar vi protokoll för att isolera primära differentierade celler och slå dem i stammen/stamceller (SCs) av samma härstamning av övergående uttryck av transkriptionsfaktor YAP. Med den här metoden omvandlas luminala differentierade (LD) celler från mus mjölkkörtlar till celler som uppvisar molekylära och funktionella egenskaper mjölkkörtlar SCs. YAP också vänder fullt differentierade pankreas exokrina celler i bukspottskörteln kanalen-liknande stamfäder. Likaså att kroppsegna, naturliga SCs, kan YAP-inducerad stamceller-liknande celler (”ySCs”) så småningom utökas som organoid kulturer lång sikt in vitro utan ytterligare behov av ektopisk YAP/TAZ, som ySCs är begåvad med en ärftlig själv förnya SC-liknande tillstånd.
Omplanering proceduren presenteras här erbjuder möjligheten att generera och expandera in vitro- stamceller av olika vävnad källor från differentierade celler. Enkel utbyggnad av somatiska celler ex vivo har konsekvenser för regenerativ medicin, för förståelse mekanismer tumör insättande och, mer generellt, för cell- och utvecklingsbiologi studier.
Introduction
Vävnadsspecifika somatiska stamceller (SCs) är kritiska för vävnad förnyelse och reparation efter skada. Möjligheten att enkelt isolera och obegränsat expandera ex vivo somatiska SCs representerar en kritisk fråga för potentiella regenerativ terapier samt för SC tillämpningar inom grundforskning och sjukdom modellering. Framsteg i denna riktning, har dock varit begränsat av svårigheten att fånga SC delstaten olika epiteliala organ in vitro. Faktiskt i flera vuxna vävnader bosatt SCs kan finns inte, eller inte vara lättillgänglig eller deras antal och regenerativ potential kan urholkas av åldrande eller sjukdom förhållanden. 2016 började vi fylla denna lucka genom att rapportera det uttrycket för en enda transkriptionell coactivator, YAP (Ja-associerade protein) eller dess närbesläktade protein TAZ (transkriptionell aktivator med en PDZ motiv), till terminalt differentierade celler effektivt skapar funktionella, utbyggbart, icke-tumörframkallande, autologa cellpopulationer som är operativt och molekylärt oskiljbara från deras motsvarande vävnadsspecifika SCs1. En puls av ihållande YAP eller TAZ aktivitet för dagarna är tillräcklig för att framkalla utseende själv förnya somatiska SCs. Detta är ett stabilt tillstånd som inte längre beroende av kontinuerlig transgenens uttryck, eftersom det kan överföras genom cell generationer utan vidare uttryck för ektopisk YAP/TAZ1. Protokollet presenteras här Detaljer förfarandet används för att generera de novo epitelial stem-/ stamceller i bröstkörteln och bukspottkörtel, start från differentierade cellerna i dessa vävnader. Detta förfarande fyller en svart låda i nuvarande omprogrammering/transdifferentiation arena. Viktigaste insatser i dessa riktningar har verkligen hittills centrerad på cell övergången till tillståndet inducerade pluripotenta stamceller (iPSC), följt av omvandlingen av dessa embryonala och pluripotenta SCs in mer differentierade celler. IPSCs är dock tumörframkallande en gång infördes i vuxna vävnader, att öka behovet av att utveckla protokoll för deras kompletta och effektiva differentiering2. Men kommer denna differentiering steg, även när det är möjligt till priset av långsiktiga utbyggnad, självorganisering och orgel återinsättning potentialer. Dessa är viktiga attribut för orgel regenerering som i själva verket är typiska bara av endogena vävnadsspecifika SCs och för närvarande beskrivs YAP-inducerad SCs (ySCs). På samma sätt differentierade direkt transdifferentiation av en celltyp till en annan med hjälp av cocktails av olika transkription faktorer också generera celler som saknar grundläggande proliferativ och stemness potentiella3.
Förfarandet beskrivs här tar också nytta av den nyligen införda organoid tekniken, som endogena SCs kan utvidgas och differentierade ex vivo4. YAP-inducerad SCs kan generera organoid-bilda SCs även i experimentell, biologiska eller sjukdom förhållanden där endogena SCs inte är närvarande. Vi vill påpeka att typ av cell plasticitet förmedlade av YAP på skillnaden med andra omplanering förfaranden, kan motsvara den enda formen av reversion till SC-liknande status som förekommer i levande vävnader. Återlåsning av SC-liknande egenskaper har förknippats med vävnad reparera eller onkogena aktiveringen5. Även om dispensable för homeostas av flera vuxna vävnader, är YAP och/eller TAZ absolut nödvändigt för regenerering, tumörtillväxt och expansion av somatiska SCs i vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12
Protocol
Alla djur förfaranden utfördes följer våra riktlinjer för institutionella och godkänts av OPBA och hälsoministeriet
1. generering av YAP-inducerad juvret Stem-liknande celler (yMaSCs)
Obs: Alla media och lösning kompositioner för avsnitt 1 anges i tabell 1.
- Isolering av primära mjölkkörtlar cellpopulationer
- Förbereda under en cell kultur huv: disponibla skalpeller, hyaluronidas lösning, dissociation medium, Hemolytiskt lösning, sortering lösning, kollagen I beläggning lösning, Ca2 + kelaterande lösning, tvätta medium #1, tvätta medium #2, dispase lösning, mjölkkörtlar 2D odlingsmedium, is kallt HBSS/PS.
- För en typisk experiment, offra 10 honmöss (antingen CD-1 C57BL/6 stam), 8-12 veckor gamla av cervikal dislokation. Sterilisera buken med riklig 70% etanol lösning före dissektion.
- Dissekera mjölkkörtlar genom att göra en Y-formad snitt längs bukhuden och försiktigt separera körtlar från bukhinnan genom att försiktigt dra med Dumont pincett. Placera dissekerade körtlar i en icke-cell självhäftande maträtt med 10 mL is kallt HBSS/PS (20 körtlar för varje maträtt), se till att inte föra över någon hud fragment.
- Under en vävnadskultur huva, tvätta varje körtel en gång i 10 mL färsk HBSS/PS och placera dem i en tom icke-cell självhäftande maträtt (20 körtlar för varje maträtt). Använd inte vävnadsodling plattor, som celler tenderar att hålla sig till dem orsakar en betydande förlust av material.
- Fint finhacka mjölkkörtlar med skalpeller tills en homogen blandning av 1 mm3 fragment erhålls. Återställa malet vävnaden från varje maträtt i 10 mL av dissociation medium med 25 mL serologiska pipett att undvika igensättning och överföra suspensionen i en 50 mL konisk tub pipettering minst 5 x för att dela upp vävnad klumpar.
Obs: För en effektiv matsmältning, ordentlig malning av vävnaden i steg 1.1.5 är avgörande. - Inkubera i 1 timme vid 37 ° C med kontinuerlig kraftig skakning. Efter 1 h, kontrollera Homogenatet och förlänga inkubation av 10 min om klumpar finns kvar. Snurra ner smält vävnaden vid 400 x g i 5 min i rumstemperatur och kasta bort supernatanten. Återsuspendera pelleten vävnad i 3 mL Hemolytiskt lösning och inkubera 3 min på is.
Obs: Hemolys är en ganska hårda behandling, så strikt tidpunkten är avgörande i detta steg. - Tvätta cellerna med 10 mL tvätta medium #1, snurra ner smält vävnaden vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera pelleten vävnad i 10 mL av tvätta medium # 2 och plattan i 10 cm vävnadsodling rätter. Inkubera rätter för 1 h vid 37 ° C i en cell kultur inkubator.
Obs: Detta steg kommer att tillåta borttagning av majoriteten av fibroblaster, som bör följa kultur skålen. - Återställa cellsuspensionen från rätter och häll i en 50 mL konisk tub. Snurra på 400 x g i 5 min och eliminera supernatanten. Tvätta pelleten två gånger i 10 mL av den Ca2 + kelat lösning av spinning ner vid 400 x g i 5 min varje gång. Återsuspendera pelleten i 5 mL av 0,25% Trypsin/EDTA och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 5 mL av dispase lösning på toppen av trypsin lösningen och komplettera med DNAS jag 1μg/mL. Pipettera upp och ned minst 5 x genom en 1 mL-tips för att dela upp DNA klumpar och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C, skaka varje 3 min.
- Tillsätt 10 mL av tvätta medium #2 och filter i en ny 50 mL koniska rör genom en 40 μm cell SIL. Snurra ner cellsuspension vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten, se till att eliminera all vätska.
- Rening av mjölkkörtlar epitelceller av FACS
- Förbereda den antikropp-mix genom att lägga till 10 μL Lin (mus härstamning antikropp cocktail), 12 μl anti-CD326 (Ep-CAM), till en slutlig koncentration på 30 ng/mL, 10 μl anti-CD49f, till en slutlig koncentration av 25 ng/mL, 10 μl anti-CD61, till en slutlig koncentration på 10 ng/mL , 2,5 μl anti-CD29, till en slutlig koncentration på 2,5 ng/mL.
Obs: från denna steg för steg 1.3, alltid fungera i mörkret, att undvika blekning av fluorescently märkt antikroppar. För varje pellet: - Hålla ett litet antal celler (genom att doppa en 100 μL spets i pelleten) i ett separat rör. Resuspendera cellerna i 500 μL av sortering lösning i en FACS röret och hålla på is som omärkta provet för förfarandet FACS.
- Återsuspendera varje pellet i 200 μL av tvätta medium #1, tillsätt 44,5 μL av antikropp mix, pipett noggrant och inkubera i 30 min på is i mörkret. Späd cellsuspensionen i 10 mL av tvätta medium #1, snurra ner vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 2 mL sortering lösning och filtrera genom ett cap-SIL FACS tubeand vidare till FACS-avskiljande av cell befolkningarna (som i figur 1B). Innan du utför multicolor FACS protokollet, se till att korrigera för den eventuella spridningseffekter av varje fluorokrom till de andra. För att göra detta, inkubera varje fluorophore-konjugerad antikropp separat med cellsuspensionen och mäta spektrala överlappning värden för alla fluorophores och i alla detektorer, via enfärgad kontroller, för att skapa en kompensationsmatris.
Obs: I detta experiment anställdes sorterare utrustade med 85 μm munstycke. En typisk förberedelse från 10 honmöss kommer att ge cirka 800.000 LD celler. Fortsätt till sekundära filtrering om klumpar bildas under FACS förfarandet.
- Förbereda den antikropp-mix genom att lägga till 10 μL Lin (mus härstamning antikropp cocktail), 12 μl anti-CD326 (Ep-CAM), till en slutlig koncentration på 30 ng/mL, 10 μl anti-CD49f, till en slutlig koncentration av 25 ng/mL, 10 μl anti-CD61, till en slutlig koncentration på 10 ng/mL , 2,5 μl anti-CD29, till en slutlig koncentration på 2,5 ng/mL.
- Sådd av primära mjölkkörtlar LD celler
- Under FACS förfarandet coat en multi väl vävnadsodling tallrik med kollagen jag beläggning lösning. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C, 5% CO2 i en cell kultur inkubator. Ta bort beläggningen lösningen och tvätta med tvätta medium #1 strax före plätering.
- Tvätta cellerna återhämtat sig från FACS förfarande med 10 mL tvättlösning #1, snurra ner 400 x g i 5 min och eliminera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i mjölkkörtlar 2D odlingsmedium (500 µL per brunn) och kollagen behandlas plattan. Låt cellerna som sitter i en cell kultur inkubator för 48 h att korrekt cell fastsättning och sprida.
Obs: För en typisk sortering från 10 honmöss, 6-8 brunnar i en väl 24-bra multi-plattan kommer att ge en optimal cell densiteten (100 000 celler per brunn).
- Induktion av yMaSCs (YAP-inducerad Mammary stamceller)
Obs: Från detta steg framåt, alla bör utföras BSL-2 villkor.- Förbereda mjölkkörtlar kolonin medium. Lägga färska till matrisen basalmembranet till medium strax före cellen sådd.
- För induktion av YAP-inducerad mjölkkörtlar stamceller (yMaSCs), transduce primära LD cellerna av lentiviral infektion genom att blanda 1 volymdel FUdeltaGW-rtTA viral supernatanten, en volymen av supernatant som FUW-tetO-YAP (eller TAZ), med två volymdelar serumfritt mjölkkörtlar 2D odlingsmedium 2 x koncentrationer av kosttillskott, i en total volym på 500 mL. Inkubera cellerna med lentiviral supernatanterna för 48 h. För en typisk lentiviral beredning, hänvisas till online protokoll22.
- Efter infektion, tvätta vidhäftande celler och behandla med mjölkkörtlar 2D odlingsmedium kompletteras med 2 µg/mL doxycyklin att inducera exogena YAP (eller TAZ) genuttryck. Använda celler som smittats med tomma, andra eller YAPS94A uttrycker vektorer eller celler som smittats med inducerbara YAP (eller TAZ) vektorer, men lämnade utan doxycyklin som negativa kontroller.
Obs: Framgångsrik infektion kan verifieras av qRT-PCR med primers som är specifika för mänskliga YAP transgenens, som tidigare beskrivits1. - Efter 7 dagar av induktion med doxycyklin, lossa fastsittande celler genom inkubation med 0,05% Trypsin/EDTA (150 μl per brunn) under 10 minuter vid 37 ° C; stoppa trypsinization genom spädning 1:5 i tvätta medium #2 (600 μL/brunn) och räkna celler. Att resuspendera cellerna i mjölkkörtlar kolonin medium (1 mL för varje brunn), kompletterat med 2 μg/mL doxycyklin och utsäde med en clonogenic täthet på 1 000 celler per brunn i 24-väl ultralåga bifogade plattor.
Obs: Kontrollera att mjölkkörtlar kolonin mediet är iskall som vid tidpunkten för basalmembranet matrix tillägg. Basalmembranet matrisen måste alltid lagras vid-20 ° C vid ankomsten och tinats långsamt vid 4 ° C över natten; När tinas, måste den alltid hanteras på isen, enligt tillverkarens riktlinjer. - En gång YAP-uttrycker LD celler börjar frodas och växa som män-liknande kolonier i suspension (yMaSC kolonier) (14 dagar efter sådd), räknas och bearbeta för ytterligare analyser (figur 1 c).
Obs: Negativ kontroll celler (som i punkt 1.4.3) förblir enstaka celler. - Fylla på kulturen med färska Mammary kolonin Medium varje 72 h under de 14 dagarna av yMaSC koloni tillväxt; att göra detta förbereda en alikvot av mjölkkörtlar kolonin medium utan 5% basalmembranet matris, kompletterad med 10 x koncentration av kosttillskott och lägga till 1:10 av den totala volymen till varje brunn (t.ex. 100 μL i 1 mL av totala medium), att undvika överdriven utspädning av matrix suspensionen.
- Sub odling av yMaSCs
- Återskapa de primära kolonierna från mjölkkörtlar kolonin medium, sedan separera och Reseeda.
Obs: yMaSC kolonier härrör från YAP-omprogrammeras LD celler förvärva självförnyelse kapacitet och kan vara framgångsrikt sub odlade utan ytterligare doxycyklin administration (dvs, oberoende av uttrycket av transgena YAP/TAZ). - Förbereda, under en cell kultur huv, mjölkkörtlar kolonin medium som i steg 1.4.1 och mjölkkörtlar organoid medium.
- Samla in varje prov och inkubera i överskottet (10:1) is kallt HBSS för 1 h på is, för att solubilize matrisen basalmembranet. Tvätta kolonier 3 x genom centrifugering vid 180 x g i 5 min och resuspendera i is kallt HBSS. Inkubera kolonier i 0,05% trypsin/EDTA under 10 minuter vid 37 ° C att få en enda cellsuspension. Pipettera kolonier upp och ner 10 x med p1000 spets att säkerställa fullständig dissociation till enstaka cellnivå.
- Greve och reseed celler i mjölkkörtlar kolonin medium (1 mL för varje brunn) utan doxycyklin på en clonogenic densitet 1 000 celler per brunn i 24-väl ultralåga bifogade plattor. Upprepa detta passaging förfarande var 10-14 dagar för att bedöma självförnyelse.
- Innan tredje passagen, passage yMaSC kolonier i organoid odlingsbetingelser, att förbättra yMaSC expansion och tillåta för bildandet av mini-körtlar, som själv ordna i en dubbel epitel som nära påminner om bröstkörteln i vivo histologiska organisation.
- Återställa kolonier från mjölkkörtlar kolonin medlet som i steg 1.5.3 till 1.5.4. Återsuspendera kolonier i 100% tillväxtfaktor minskas matrisen basalmembranet, funderar på att replate högst 20-25 kolonier för varje brunn 24-väl ultralåga fastsättning platta i 150 µL av matrisen.
- Inkubera plattorna i en cell kultur inkubator för 40 min vid 37 ° C och låt matrisen basalmembranet stelna och sedan overlay gelerna med 500 μL av mjölkkörtlar organoid medium.
- Kontrollera för bildandet av kolonier att bilda spirande organoids (figur 1E) efter några dagar.
- Efter 10-14 dagar, passage eller process i organoids för vidare analys.
- Att passagen organoids kulturer, återställa organoids genom att samla varje prov och ruvar i överskottet (10:1) is kallt HBSS för 1 h på is, för att solubilize matrisen basalmembranet. Tvätta organoids 3 x av spinn ner vid 180 x g i 5 min och resuspendera i is kallt HBSS.
- Inkubera organoids i 0,05% trypsin/EDTA under 10 minuter vid 37 ° C att få en enda cellsuspension. Pipettera organoids upp och ner 10 x med p1000 spets att säkerställa fullständig dissociation till enstaka cellnivå.
- Reseed som en enda cellsuspension i en droppe 100% tillväxtfaktor reducerad basalmembranet matris (150 μl för varje brunn 24-väl ultralåga fastsättning platta). Låt matrisen basalmembranet bilda en gel genom ruvning 40 min vid 37 ° C i en cell kultur inkubator och overlay gelerna med 500 μL av mjölkkörtlar organoid medium.
Obs: yMaSC organoids kan förvaras i fryst tillstånd genom att återvinna från 100% basalmembranet matrix kultur som i steg 1.5.13, undvika trypsinization. Lagra i mjölkkörtlar organoid medium kompletteras med 10% DMSO. - Snabbt frysa den yMaSC organoids vid-80 ° C och sedan bevarade i flytande kväve.
- Återskapa de primära kolonierna från mjölkkörtlar kolonin medium, sedan separera och Reseeda.
2. generering av yDucts
Obs: Alla media och lösning kompositioner för avsnitt 2 anges i tabell 2.
- Isolering av primära bukspottskörteln acini
- Placera dissektion pincett och sax i 70% EtOH och förbereda under en huv acinar kultur cellodlingsmedium, 15 mL för varje mus; acinar återhämtning medium, 60 mL för varje mus; PBS/PS; stamlösning kollagenas jag; kollagenas jag lösning A, 15 mL för varje mus; neutraliseras rat tail kollagen jag lösning. Neutralisera rat tail kollagen I till pH = 7, genom att justera först med 0,1 N NaOH att buffra ättiksyra i som kollagen är upplöst, och sedan med 10N HCl. Dilute 2,5 mg/ml i PBS/PS. hålla Rat Tail kollagen I och alla reagenser på is för att neutralisera det. Offra 6 till 9 veckor gamla möss av ordentlig genotyp.
- Placera varje mus på ryggen och tvätta buk med 70% etanol lösningen. Gör ett längsgående snitt längs den buk-väggen. Leta upp och dissekera bukspottkörteln (med mjälten som guide) och placera det i en 10 cm icke-cell självhäftande maträtt i 10 mL is kallt PBS/PS. överföra rätterna omedelbart under en cell kultur huv. Från detta steg framåt, arbeta alltid under en cell kultur huva.
- Överföra varje bukspottkörteln i en ny icke-cell självhäftande maträtt tidigare fylld med 7 mL kollagenas jag lösning A.
- Snabbt färs varje bukspottkörteln med ett par engångs skalpeller, att erhålla en homogen vävnad suspension av ungefär 1 mm3 fragment.
Obs: Det är viktigt att notera att proceduren tar inte mer än 2 min för optimal cellernas viabilitet. - Inkubera skålen för kollagenas matsmältningen vid 37 ° C, 5% CO2 i en cell kultur inkubator för 10 min, skaka varje 3 min för att säkerställa en homogen vävnad matsmältningen.
- Återställa smält vävnaden i en 50 mL konisk tub (en för varje bukspottkörteln), tvätta skålen med 10 mL Acinar tvätta Medium och placera den i samma 50 mL koniska rör, pipettering rötas vävnaden upp och ned inte mer än 3 x.
- Snurra ner smält vävnaden för 5 min vid 100 x g vid 18 ° C och ta bort supernatanten.
Obs: Snurra ner cellerna vid 18 ° C till lägre kollagenas aktivitet under detta steg. - Återsuspendera vävnaden pellet i 7 mL kollagenas jag lösning A och häll denna lösning i en ny 10 cm icke-cell självhäftande maträtt.
- Inkubera skålen för en andra omgång kollagenas matsmältningen vid 37 ° C i ca 10 min som i steg 2.1.5, skaka varje 3 min för att säkerställa en homogen vävnad matsmältningen. Under tiden Förbered en ren 50 mL koniska tub för varje bukspottkörteln toppad med en 100 μm cell SIL.
- Återställa den smälta vävnaden och passera 100 μm cell silen genom lakning vävnaden med en steril 10 mL sprutkolven (se till att försiktigt trycka ner vävnaden, undvika skeva styrkor tangentiell till SIL ytan). Tvätta skålen med 10 mL acinar tvätta medium och passera samma 100 μm cell silen här 10 mL.
- Snurra ner smält vävnaden för 5 min vid 100 x g vid 18 ° C och ta bort supernatanten.
- Återskapa vävnad pelleten med 10 mL acinar tvätta medium. Överför cell lösningen i en 50 mL konisk tub redan som innehåller ytterligare 10 mL färsk acinar tvätta medium, undvika överdriven pipettering för resuspension av pelleten.
- Snurra ner smält vävnaden för 5 min vid 100 x g vid 18 ° C och ta bort supernatanten.
- Noggrant Återsuspendera smält vävnaden i 6 mL acinar återhämtning medium och fördela det i 2 brunnar i 6-väl multi väl vävnadsodling plattan, 3 mL vardera. Under ett stereomikroskop noggrant bedöma kvaliteten på acinar isoleringen, som visas som en homogen suspension av acinar kluster, med en mindre andel av enstaka celler (se figur 2B); ta bort eventuella stora vävnad klumpar så småningom presentera (vanligtvis synliga även för blotta ögat), genom pipettering dem ut ur lösningen.
- Sådd av primära bukspottskörteln acini
- Inkubera smält acinar kluster vid 37 ° C i en cell kultur inkubator för 2 h, om du vill tillåta för cell återhämtning.
- Under cell återhämtning pälsen 48-väl multi brunnar med 100 μL av neutraliserat rat tail kollagen jag och inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en cell kultur inkubator att tillåta en hydrogel kudde till form.
- Efter 2 h på cell återhämtning, samla acinar cellsuspension i ett koniskt rör, snurra ner för 5 min vid 100 x g vid 18 ° C och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera i acini i lämplig volym av acinar odlingsmedium (150 μl för varje brunn 48 väl vävnadsodling platta). Utsäde varje separerade bukspottkörteln i 16 brunnar att erhålla en optimal täthet (100-120 acinar kluster per brunn).
- Späd ut denna acinar suspension med en lika stor volym av neutraliserat rat tail kollagen jag lösning, att hålla rören på isen. Blanda noggrant och snabbt utsäde cellsuspensionen ovanpå kollagen dynan beskrivs i 2.2.2 (300 μL för varje brunn 48 väl multi väl vävnadsodling platta).
- Inkubera i 1 timme vid 37 ° C i en cell kultur inkubator att tillåta en hydrogel till form.
- Induktion av bukspottskörteln organoids
- Overlay kollagen hydrogels med 500 μL av Acinar odlingsmedium kompletteras med 2 μg/ml doxycyklin för YAP-beroende framkallande av bukspottskörteln organoids från R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A möss; negativa kontroller tillhandahålls av wt celler odlade i samma villkor eller R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A celler odlade i avsaknad av doxycyklin.
- Kultur acinar celler i Acinar odlingsmedium kompletteras med 2 μg/mL doxycyklin för 5 till 7 dagar uppfriskande odlingsmedium (300 μL/brunn) varje 48 h och efter organoid bildandet av morfologiska förändringar mot cysta bildas duktal-liknande strukturer ( Figur 2 c). När organoids bildas, celler kan överförda i bukspottskörteln organoid odlingsbetingelser eller skördas för ytterligare analyser (t.ex.: RNA-extraktion, immunofluorescens).
- Sub odling av bukspottskörteln organoids
- För att bedöma deras självförnyelse kapacitet, klonalt passage YAP-inducerad bukspottskörteln organoids (yDucts) i tredimensionella basalmembranet matrix hydrogels (bukspottskörteln organoid odlingsbetingelser) oberoende av exogena YAP/TAZ tillförsel (dvs. oberoende av doxycyklin administration).
- Förbereda Trypsin 0,05%/EDTA; 100% tillväxtfaktor reducerad basalmembranet matrix; Pankreas Organoid Medium och kollagenas jag lösning B.
- Förbereda en 15 mL koniska rör med 4 mL kollagenas jag lösning B för varje brunn för att vara anpassade.
- Kassera odlingsmedium, försiktigt extrahera hydrogels från brunnarna genom försiktig uppsugning och överföra dem till de koniska rör.
- Inkubera rören vid 37 ° C i 30 min, med kontinuerlig kraftig skakning för att tillåta fullständig nedbrytning av kollagen matris (kontrollera varje 10 min tills hydrogel är helt solubilized). Snurra ner återvunna cellerna på 750 x g i 2 min och ta bort supernatanten.
- Inkubera återvunna cellerna i 1 mL av Trypsin 0,05%/EDTA under 10 minuter vid 37 ° C att få en enda cellsuspension. Späd trypsin med 9 mL PBS 1 x, snurra ner vid 750 x g i 2 min och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i is kallt tillväxtfaktor reducerad basalmembranet matris och utsäde i ultra-låg bifogade plattor (vanligtvis en droppe 150 μL i en väl 24-well platta).
- Låt den basalmembranet matrix hydrogel stelna av ruvning plattorna i en cell kultur inkubator 40 min vid 37 ° C och sedan täcka över med bukspottskörteln Organoid Medium (500 μL för varje brunn). yDucts kommer att växa som cysta-liknande organoids i 7-10 dagar (figur 2D).
- För ytterligare passaging organoids kan avlägsnas från basalmembranet matrix genom inkubation i is kallt PBS 1 x för 30 min, följt av tvättning 3 gånger av spinn ner vid 180 x g i 5 min och resuspension i is kallt PBS 1 x att undvika matrix överföring. Organoids är sedan skiljas med trypsin 0,05% för 10 min till en enstaka celler suspension och sådd i färska basalmembranet matris och sedan belagd med bukspottskörteln Organoid Medium (som 2.4.7-2.4.8).
- yDuct organoids kan förvaras i fryst tillstånd i flytande kväve genom att återvinna från 100% basalmembranet matrix kultur som i steg 2.4.9, undvika trypsinization, och lagra i bukspottskörteln Organoid Medium kompletteras med 10% DMSO.
- yDuct organoids är snabbt fryst vid-80 ° c och sedan bevarade i flytande kväve.
Representative Results
Generation av yMaSCs
En översikt över experimentella strategin att omprogrammera primära mjölkkörtlar LD celler av övergående uttryck av YAP presenteras i figur 1A. Primära mjölkkörtlar LD epitelceller renas av lysrör-aktiverad cell sortering13. Figur 1B representerar en typisk sortering procedur att få tre skilda subpopulationer: basala celler (EpCAMlågCD49fhögCD61–), luminala stamceller (LP) celler (EpCAMhögCD49flågaCD61+ ) och LD celler (EpCAMhögCD49flågaCD61–). Försiktig gating av de tre subpopulationsna är nödvändigt att isolera en ren beredning av LD celler, som är fullt differentierade och helt tillväxt arresterade när seedade i bröstkörteln kolonibildande villkor (se figur 1 c, vänster panel). Omvänt, när induceras att uttrycka exogena YAP, LD celler börjar frodas bildar lätt igenkännliga tät epitelial kolonier i 5% basalmembranet matrix suspension kulturer (figur 1 c). Effektiviteten i omprogrammering, intygas omkring 3% för en typisk experiment, kan vara poängsätts genom att räkna antalet kolonier över antalet enstaka celler ursprungligen seedade i basalmembranet matrix suspension kulturer (figur 1 d). Omstyrda luminala celler (yMaSCs) sedan kan passagen till 100% basalmembranet matrix organoid odlingsbetingelser (se scheme i figur 1A), självorganiserande i komplexa organoid-liknande strukturer som utvecklas kring flera lumen och Visa anmärkningsvärd självförnyelse förmåga även i frånvaro av doxycyklin (dvs. i avsaknad av transgena YAP uttryck) (figur 1E). Histologiskt, yMaSC-derived organoids visar en basala lagret (K14 positiv), inför matrisen basalmembranet rekonstitueras ECM och ett luminala lager (K8 positiv), inför lumen-liknande håligheter inom organoid (figur 1F). Denna arkitektur är omöjlig att skilja från det av organoids som bildas av infödda MaSCs (figur 1F).
Generation av yDucts
En översikt över experimentella strategin att omprogrammera primära bukspottskörteln acini av övergående uttryck av YAP presenteras i figur 2A. Hela acinar kluster är isolerad från huvuddelen av bukspottskörteln vävnad genom en kombination av milda dissociation och storlek utslagning genom filtrering. En typisk beredning presenteras i figur 2B. Efter isolering, ska acinar cell kluster visas som en suspension av exokrina acinar enheter av homogen storlek, med ingen förorening av endokrina Langerhanska öar eller fragment av pankreas duktal trädet och minimal dissociation att enstaka celler. Kontaminering av endokrina holmar eller duktal fragment är ett tecken på bristfällig selektiv filtrering (steg 2.1.10), möjligen på grund av hård hantering; oönskade dissociation av acinar kluster att enstaka celler kan bero på överdriven kollagenas behandling eller obuffrat aktivitet av proteolytiska enzymer släpptes av vävnad, som kan stävjas genom ytterligare SBTI behandling.
En typisk acinar omplanering experiment presenteras i figur 2 c; inom 5-7 dagar av kultur i 3D kollagen-jag bygger hydrogel i närvaro av doxycyklin, bukspottskörteln acini härrör från R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A möss lätt förvandlas till kanal-liknande kluster (att vi heter yDucts), består av en tunn enskiktslager av epitelceller som föröka sig runt en expanderande central hålighet. Den omprogrammering effektivitet, vilket är cirka 70% för en typisk experiment, kan lätt mätas genom poängsättning antalet kanal-liknande kluster över det totala antalet seedade acini (figur 2D). Den negativa kontrollen celler, det vill säga R26-rtTAM2 / + celler eller R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A celler kvar utan doxycyklin, alltid förbli som efter mitotiska acinar kluster i dessa odlingsbetingelser, som tidigare rapporterats1 ,14,15. Omprogrammerade yDucts kan sedan vara passaged på enstaka cellnivå i Matrigel-baserade organoid kultur villkorar16 (se scheme i figur 2A), visar anmärkningsvärd självförnyelse förmåga även i frånvaro av doxycyklin (dvs. i avsaknad av transgena YAP uttryck) (figur 2E).
Figur 1: Isolering av primära mjölkkörtlar LD celler och induktion av mjölkkörtlar stamceller. (A) schematisk representation av experimentella förfarandet antogs för att omprogrammera primära mjölkkörtlar LD celler. (B) representant FACS-tomter som illustrerar en typisk sortering förfarande att rena LD celler. i) dissocierade celler är gated enligt framåt och side scatter för levande celler (P1, blå); (II) befolkningen P1 är sedan ytterligare gated enligt dess Lin profil: subpopulationen av härstamning-negativa celler (P2; grå) väljs, exklusive härstamning-positiv hematopoetiska celler; (III) befolkningen P2 separeras därefter till en EpCAMhög (P3; gul + grön) och en EpCAMlåg (P6, röd) delpopulationer. IV) P3 och P6 är sedan ytterligare gated enligt deras CD61/CD49f-profilen in i tre undergrupper: EpCAMlågCD49fhögCD61– basala celler (P7; röd), EpCAMhögCD49flågaCD61+ LP celler (P8; gul) och EpCAMhögCD49flågaCD61– LD celler (P9; grön). (C) bilder är belysande för LD celler, som smittats med de angivna konstruktioner, förmåga att bilda mjölkkörtlar kolonier 15 dagar efter sådd i mjölkkörtlar kolonin medium. YAP-uttryckande celler förvandlas till kolonibildande celler, medan negativa kontrollen celler (andra-infekterade) återstår endast som tillväxt-greps enstaka celler. Skalstapeln = 50 μm. (D) kvantifiering av de kolonibildande förmåga i angivna celler, som i (C). Data presenteras som medelvärdet + s.d. och är representativa för fem oberoende experiment, var och en med sex tekniska replikat. (E) representativ bild av YAP-omprogrammeras mjölkkörtlar stamceller-liknande celler (yMaSCs) efter 12 dagar i organoid odlingsbetingelser i färska tredimensionella 100% basalmembranet matrix hydrogel i avsaknad av doxycyklin. Skalstapeln = 100 μm. (F) representativa immunofluorescens bilder för den basala markören K14 (grön) och den luminala markören K8 (röd) av organoids härrör från de angivna cellerna, efter 12 dagar i organoid odlingsbetingelser. Skalstapeln = 10 μm. Denna siffra är reproducerade från Panciera et al., 20161. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Isolering av primära bukspottskörteln acinar celler och induktion av bukspottskörteln stamfäder. (A) schematisk representation av experimentella förfarandet antogs för att omprogrammera primära pankreas exokrina acinar celler. (B) representativ bild av primära bukspottskörteln acini strax efter förfarandet isolering (steg 2.1.14). Acinar preparatet ska visas som en homogen suspension av acinar kluster, med minimal förekomst av enstaka celler. Skalstapeln = 400 μm. (C) representativa bilder av primära bukspottskörteln acini härrör från R26-rtTAM2 (övre paneler)eller R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (lägre paneler) möss och odlade i 3-D kollagen jag-baserat hydrogel i 5 dagar med eller utan Doxycyklin (doxy), som anges. Bara konvertera YAP-uttryckande primära acini celler växer som cysta-liknande organoid efter doxycyklin tillägg. Skala barer = 70 μm. (D) kvantifiering av bukspottskörteln acini förmåga att bilda duktal organoids på transgena YAP överuttryck som i (C). Data presenteras som medelvärdet + s.d. och är representativa för fem oberoende experiment, som utförs med fyra tekniska replikat. (E) representativ bild av YAP-reprogramed duktal-liknande celler (yDucts) efter tre passager i färska tredimensionella 100% basalmembranet matrix hydrogel i avsaknad av doxycyklin. Skalstapeln = 130 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Isolering av primära mjölkkörtlar celler | |
| Ca2 + kelat lösning | Förvaras vid 4 ° C |
| EDTA | 0,02% w/V |
| PBS | |
| Kollagen I beläggning lösning | |
| Ättiksyra 0.02N, pH 3,23 | |
| Rat Tail kollagen (beläggning) | 1:50 |
| Dispase lösning | Förvaras vid 4 ° C |
| Dispase | 5 mg/ml |
| PBS | |
| Dissociation Medium | |
| DMEM:F12 | |
| Hyaluronidas stamlösning | 400 U/mL |
| Penna/Strep | 1 x |
| Stamlösning kollagenas jag | 600 U/mL |
| Hemolytisk lösning | Förvaras vid 4 ° C |
| NH4Cl lösning | 1 delar |
| TrisBase 20,6 HB | 9 delar |
| Justera pH-värdet till 7,2 | |
| HBSS/PS | Förvaras vid 4 ° C |
| HBSS | |
| Penna/Strep | 2 x |
| Hyaluronidas stamlösning | Filtrera 0,2 µm, förvaras vid 4 ° C |
| Hyaluronidas från nötkreatur testiklarna (pulver) | 2 000 E/mL |
| Natriumfosfat buffert 1 M pH7.3 | |
| NH4Cl lösning | Butik på T. amb. |
| H2O | |
| NH4Cl | 7,1 g/L |
| Justera pH till 7,65 | |
| Sortering lösning | Filtrera 0,2 µm, förvaras vid 4 ° C |
| BSA | 0,1% |
| EDTA | 1 mM |
| HEPES pH 7 | 25 mM |
| PBS | |
| Tvätta Medium #1 | |
| DMEM/F12 | |
| Penna/Strep | 1 x |
| Tvätta Medium #2 | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 5% |
| Penna/Strep | 1 x |
| Mjölkkörtlar 2D odlingsmedium | |
| DMEM/F12 | |
| FBS | 2% |
| heparin | 4 mg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| murina bFGF | 10 ng/mL |
| murina EGF | 10 ng/mL |
| Penna/Strep | 1 x |
| Induktion och Passaging av yMaSCs | |
| Mjölkkörtlar kolonin Medium | |
| DMEM:F12 | |
| FBS | 5% |
| heparin | 4 µg/mL |
| L-glutamin | 1 x |
| Matrigel (Lägg omedelbart före sådd) | 5% |
| murina bFGF | 20 ng/mL |
| murina EGF | 10 ng/mL |
| Penna/Strep | 1 x |
| Mjölkkörtlar Organoid Medium | |
| Avancerade DMEM:F12 | |
| B27 | 1 x |
| GlutaMax | 1 x |
| heparin | 4 µg/mL |
| Hepes | 1 x |
| mänsklig skalle | 100 ng/mL |
| murina bEGF | 20 ng/mL |
| murina EGF | 50 ng/mL |
| R-Spondin 1 | 1 µg/mL |
Tabell 1: Generation av yMaSCs. Sammansättningen av alla olika odlingsmedier och lösningar som krävs för isolering av primära mjölkkörtlar LD celler och induktion av yMaSCs (avsnitt 1)
| Isolering av primära bukspottskörteln acini | |
| Acinar odlingsmedium | |
| BPE | 50 µg/mL |
| BSA | 0,1% |
| Dexametason | 1 µg/mL |
| FBS | 0,1% |
| ITS-X | 1 x |
| Penna/Strep | 1 x |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Waymouth's Medium | |
| Acinar tvätta Medium | |
| BSA | 0,1% |
| Penna/Strep | 1 x |
| RPMI Medium | |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
| Acinar återhämtning Medium | |
| Acinar odlingsmedium | |
| FBS | 30% |
| Kollagenas jag lösning A | |
| Acinar tvätta Medium | |
| Stamlösning kollagenas jag | 360 U/mL |
| PBS/PS | Förvaras vid 4 ° C |
| PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) | |
| Penna/Strep | 1 x |
| Stamlösning kollagenas jag | Förvaras vid-20 ° C |
| Kollagenas, typ jag (pulver) | 6 000 E/mL |
| PBS | |
| Passaging av bukspottskörteln organoids | |
| Kollagenas jag lösning B | |
| PBS 1 x | |
| Stamlösning kollagenas jag | 240 U/mL |
| Bukspottskörteln Organoid Medium | |
| Avancerade DMEM/F12 | |
| B27 | 1 x |
| gastrin | 10 nM |
| mänskliga FGF10 | 100 ng/mL |
| mänsklig skalle | 100 ng/mL |
| murina EGF | 50 ng/ml |
| N-acetylcystein | 1,25 mM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Penna/Strep | 1 x |
| R-Spondin 1 | 1 mg/mL |
| SBTI | 0,2 mg/mL |
Tabell 2: Generation av yDucts. Sammansättningen av alla olika odlingsmedier och lösningar som krävs för isolering av primära acinar celler och induktion och passaging av yDucts (avsnitt 2)
Discussion
Här presenterar vi protokoll för att programmera ex vivo terminalt differentierade epitelceller i olika vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (eller ySCs) av övergående uttryck av YAP, som tidigare rapporterats1. Vi har detaljerade två förfaranden: en så att omprogrammering av FACS-renat celler genom lentiviral vektorer och en andra som undviker virusinfektion och tar fördel av transgena YAP uttryck. Varje protokoll presenterar en effektiv strategi för att isolera och odla primära differentierade celler och en strategi för att tvinga exogena YAP genuttryck i differentierade celler, genererar de novo somatisk vävnad-specifika utbyggbart stamceller (se system i figurerna 1A och 2A).
Vi visat att isolering strategier här presenteras effektivt isolera en ren population av differentierade celler, vilket framgår av det faktum att vi aldrig upptäckt någon utväxt från negativa kontrollprover (siffrorna 1 c och 2 C).
Lentiviral vektorer används i denna studie för omprogrammering av primära mjölkkörtlar LD celler är doxycyklin inducerbara, erbjuder möjligheten att en sträng kontroll av transgenens uttryck; Detta gör för att slå på och av exogena YAP uttryck vid kommer. Särskild uppmärksamhet bör placeras i undvika användning av en överdriven viral titer, eftersom detta kan vara skadligt i form av omprogrammering effektivitet. När det gäller primära acinar celler bytte vi till en fullt transgena strategi att få en YAP-beroende omprogrammering med minimal manipulationer. Denna sistnämnda strategi är också speciellt lämplig för primära bukspottskörteln acini, som isolerade acinar kluster är knappast mottaglig för lentiviral infektion och mycket ömtålig. Den transgena strategi anställd erbjuder samma fördel av doxycyklin-beroende lentiviral vektorer för tight kontroll av genuttryck. Transgena strategin utnyttjas med primära bukspottskörteln acini bär dessutom den extra fördelen av en mycket högre omplanering effektivitet jämfört med viral-inducerad omprogrammering av mjölkkörtlar LD celler. Utöver olika inneboende plasticitet är associerad till celler som härrör från olika vävnader, kan den högre frekvensen av bukspottskörteln omprogrammering härledas från uttryck som är associerat till enhetliga och självständiga YAP uttryck i alla högre effektivitet explanterad celler. Vi har bland annat visat att exogena YAP inte längre behövs efter generation av ySCs (yMaSC kolonier och yDucts), utan att det påverkar deras självförnyelse kapacitet. Detta beror på att ySCs återaktivera endogena YAP/TAZ och använda dem för självförnyelse när exogena YAP är avstängd1.
Vi validerat uppfattningen att ySCs verkligen ur differentierade celler genom att kontrollera cellen ursprungsland i våra omplanering experiment genom genetiska härstamning-tracing valideringar1.
Omfattande karakteriseringav ySCs visar att YAP-inducerad omprogrammering genererar normal somatisk SCs1 som jag) på transcriptomic nivå, ySCs Visa massiva överlappningar med infödda SCs; (II) ySCs Visa differentiering potentiella och kan generera en Multilinjärt avkomman alltid begränsad till identiteten på deras vävnad ursprung. (III) ySCs är icke-omvandlad och icke-tumörframkallande när transplanterade i vivo.
Här beskriver vi också förfaranden för att upprätthålla och utveckla kultur både yMaSCs och yDucts som organoids inbäddade i 100% basalmembranet matrix hydrogels. Dessa villkor tillåta för självorganisering av ySCs i tredimensionella organoids som garanterar upprätthållandet av stemness egenskaper långsiktiga i kultur, gör det möjligt att expandera dessa stamceller populationer på kommer för nedströms analyser och applikationer. Av okänd anledning, vi misslyckats med att få yMaSC organoids genom att placera infekterade LD celler direkt i organoid odlingsbetingelser 7 dagar efter doxycyklin behandling i plast vävnadsodling plattan; med andra ord, är de mellanliggande tillväxt steget i mjölkkörtlar kolonin villkor viktigt. I våra händer kräver även infödda MaSCs mjölkkörtlar kolonin förhållanden innan passaging i organoid kultur. Dessutom erhålls den effektivaste organoid utväxten när vi undvika separera primära kolonierna i enstaka celler, men snarare överför intakt kolonierna till organoid odlingsbetingelser.
Organoid odlingsbetingelser bära också fördelen av att ge möjlighet att frysa ySCs, förutsatt att organoids återvinns från deras matriser, undvika cell dissociation innan frysförvaring i kväve bad.
Den YAP omprogrammering proceduren presenteras kan konvertera olika differentierade celltyper som härrör från olika vuxna vävnader i deras motsvarande vävnadsspecifika stamceller (vi har testat det med hjälp av mjölkkörtlar, pankreas och neuronala celler)1. Till skillnaden från iPSCs eller andra omplanering ansträngningar, kan YAP/inducerad SCs underhålla minnen av deras vävnad av ursprung. Notera de differentiering av somatiska celler in i celler med stam-liknande egenskaper är den enda formen av cell öde plasticitet och omprogrammering observerade in vivo, till exempel efter vävnadsskada och stödja sårläkning5,17 , 18 , 19 , 20. det är anmärkningsvärt att YAP och TAZ är till stor del överflödiga för normala homeostas men avgörande för vävnad reparera i flera vävnader11,21. Konsekvent med en fysiologisk funktion av omplanering stegen som här beskrivs, har YAP/TAZ nyligen visat att krävas i intestinal förnyelse i musmodeller av patienter med ulcerös kolit genom att orsaka en omvandling av vuxen intestinala celler in i en reparation epitel som visar funktioner av fostrets gut19. YAP omprogrammering således expanderar de nuvarande inducerad cell plasticitet strategierna genom att tillhandahålla ett sätt att generera somatiska stamceller, en stat som hittills har utmanande för att fånga in vitro. Detta tillvägagångssätt, kan om utvidgas också till människa celler, ha bred betydelse från regenerativ medicin program till studien i den somatiska stemness staten och för expansion av somatiska stamceller celler in vitro.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar F. Camargo för gåvan av tetO-YAPS127A möss; R26-rtTAM2 möss (lager #006965) köptes från The Jackson Laboratory. Vi tackar Chiara Frasson och Giuseppe Basso för hjälp med FACS förfaranden. Detta arbete stöds av AIRC särskilda Program molekylär klinisk onkologi '' 5 promille '' och en AIRC PI-Grant till S.P och epigenetik flaggskeppsprojekt CNR-Miur beviljar för S.P. Detta projekt har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horisont 2020 för forskning och innovation (bidragsöverenskommelse DENOVOSTEM nr 670126).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL sterile syringes | Rays | 10LC | |
| 100 mm cell strainer | Corning | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tubes | Corning | 430052 | |
| 24-well ultra low attachment plates | Costar | 3473 | |
| 40 mm cell strainers | Corning | 352340 | |
| 48-well multiwell plates | Corning | 353078 | |
| 50 mL sterile conical tubes | Corning | 430290 | |
| 6-well multiwell plates | Corning | 353046 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634028 | |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504001 | |
| BPE | Gibco | 13028014 | |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| Collagenase, type I | Sigma | 17018029 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Dispase | Gibco | 1705-041 | |
| Disposable scalpels | Swann-Morton | 0503 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DnaseI | Roche | 11284932001 | |
| doxycycline hyclate | Sigma | D9891 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 51976 | |
| FACS tubes (with strainer caps) | Falcon | 352235 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM) | BioLegend | 118208 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | #19780 | |
| FUW-tetO-EGFP | Addgene | #84041 | used as negative control |
| FUW-tetO-MCS | Addgene | #84008 | used as negative control |
| FUW-tetO-wtYAP | Addgene | #84009 | |
| FUW-tetO-YAPS94A | Addgene | #84010 | used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | |
| HBSS | Gibco | 24020117 | |
| HCl | Sigma | 30721 | |
| heparin sodium salt | Sigma | H3149 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| human R-Spondin1 (His Tag) | Sino Biological | 11083-H08H-5 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506 | |
| ITS-X | Gibco | 51500056 | |
| K-14 antibody | Life Technologies | Ab7800 | |
| K-8 antibody | Life Technologies | Ab14053 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail) | BD Biosciences | 51-9003632 | |
| Matrigel® Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| NaOH | J.T.Baker | 0402 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | |
| non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish ø 94) | ROLL | 18248 | |
| PBS 10x | Euroclone | ECM4004XL | |
| PE Hamster Anti-Mouse CD61 | BD Biosciences | 553347 | |
| PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f | BD Biosciences | 551129 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody | BioLegend | 102222 | |
| Pen/Strep (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rat Tail Collagen I (coating) | Sigma | 122-20 | |
| Rat Tail Collagen I for 3D culture | Cultrex | 3447-020-01 | |
| recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| recombinant murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| recombinant murine FGF basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 31870025 | |
| SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max) | Sigma | T6522 | |
| Tris BASE | Roche | 11814273001 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Waymouth medium | Gibco | 31220023 |
References
- Panciera, T. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
- Bar-Nur, O. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Xu, J., Du, Y., Deng, H. Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications. Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Blanpain, C., Fuchs, E. Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Bai, H. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation. Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).
- Cai, J. The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program. Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).
- Elbediwy, A. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Taniguchi, K. A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration. Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).
- Zhang, W. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Signal. 7 (324), ra42 (2014).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Azzolin, L. YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell. 158 (1), 157-170 (2014).
- Stingl, J. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Means, A. L. Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates. Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).
- Shi, G. Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia. Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).
- Huch, M. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).
- Fernandez Vallone, V. Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage. Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).
- Yanger, K. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration. Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).
- Yui, S. YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration. Cell Stem Cell. , (2017).
- Pan, F. C. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140 (4), 751-764 (2013).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).
- Lentiviral production and infection. , http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf (2016).
