Summary
Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.
Abstract
Kanser hücrelerinin rutin bir plastik yüzey üzerinde iki boyutta (2D) kültürlü. Bu teknik, ancak, gerçek ortamı bir tümör yoksun kitle içinde vivoiçin maruz. Solid tümör değil bir levha plastik için bağlı olarak büyümek, ama onun yerine bir üç boyutlu (3D) klonal hücre koleksiyonu gibi onların komşuları ile ve normal hücresel polarite bozulma gibi farklı mekansal özellikleri ile etkileşim alanı. Bu etkileşimler 3D kültürlü hücre içinde vivo tümörü daha alakalı olan morfolojik ve hücresel özellikleri elde etmek neden. Ayrıca, bir tümör kitle stromal ve bağışıklık hücreleri yanı sıra--dan diğer hücre tip hücre dışı matriks gibi diğer hücre türleri ile doğrudan temas halinde olduğunu. Kollajen ve fibronektin oluştururlar, yatırılır matris oluşur.
Bir girişim başucu için tezgah gelen Onkoloji araştırma bulguları ve çeviri artırmak için birçok grup kendi ilaç geliştirme stratejileri 3D modeli sistemlerinin kullanımı araştırmaya başladı. Bu sistemler bir tümör karmaşık ve türdeş olmayan ortam özetlemek girişimi çünkü daha fizyolojik ilgili olduğu düşünülür. Bu sistemler, ancak, oldukça karmaşık olabilir ve 96-şey biçimleri ve bazı şimdi bile 384 büyüme mükellef olmasına rağmen onlar büyük ölçekli büyüme ve tarama için birkaç seçenek sunar. Bu boşluğu yöntem tanımlamak burada ayrıntılı olarak kültür tümör pulcuklarının 1536-şey tabak içinde yüksek-den geçerek kapasite geliştirme yol açmıştır görülmektedir. Bu yöntemler bir uzlaşma son derece karmaşık matris tabanlı sistemler, ekran ve geleneksel 2D deneyleri için zor olan temsil etmektedir. Kanser hücre hatları farklı genetik mutasyonlar yataklık çeşitli başarıyla tarandı, Mitogen-Activated Protein Kinaz veya MAPK yolu hedefleme bileşiklerin küratörlüğünde bir kütüphane kullanarak bileşik etkinlik İnceleme. Küresel kültür yanıt-e doğru o zaman yanıt 2D olarak yetiştirilen hücrelerin karşılaştırılır ve fark faaliyetleri bildirdi. Bu yöntemler bir yüksek-den geçerek 3D ortamda bileşik etkinliğini test etmek için benzersiz bir protokol sağlar.
Introduction
Son on yılda daha fazla çalışmalar tam olarak 2D hücrelerde plastik üzerinde büyüyerek recapitulated değil kavramları anlamak için 3D hücre kültür modellerinin kullanımı hayata geçirdik. Bu kavramlar değişiklikler hücrelerinin apikal ve bazal katmanları kayma yönünü nerede kayıp normal epitel hücre polarite1 , hem de hücre dışı matriks hayatta kalma ve hücre kader düzenlenmesinde rol örnekleridir. Onkoloji araştırma, özellikle, 3D modelleri temel biyoloji kanser hücreleri ve 2D ve 3D hücre kültür sistemleri3,4arasındaki farkları anlamak için kullandı. Daha gelişmiş hücre kültürü teknikleri ve onların daha fazla uyum çok iyi biçimleri için 3D ayarları'nda yeni ilaçlar için arama sağlamıştır. Karmaşık çok cell tipi küreler6,7için, koşullarda 2D, 3D modelleri tek hücre tipi alanlara farklı boyutlarda, katmanlı hücresel sistemleri5 karmaşıklık tümörler aralığının hücre aksine yetiştirilen 8. yeni bileşikler veya kuvvetli bu 3D modeli sistemlerinde hücre ölümüne neden destekte keşfi, bu nedenle, ilaç geliştirme kampanyalarının yüksek ilgi olduğunu. Bitiş noktaları bu deneyleri kez hücre çoğalması değişimler değerlendirmek için 2D kültürlerde geçekleştirilen aynıdır, ancak daha fizyolojik ilgili bir ortamda yürütülen zaman bağımlılık hedef gen veya yolu olma gerçek düzeyini ortaya çıkarabilir sorguya.
Yukarıda tanıtılan gibi çeşitli model sistemleri geliştirilmiştir 3D kültür sistemlerinde uyuşturucu yanıt çalışmaya, ama çoğunluk ya 96 veya 384-de microtiter plakaları kullanın ve sık sık kullanılan yüksek üretilen iş (HTS) eleme oluşum kolayca adapte değildir ilaç keşif tarama kampanyalar. Bu tür sistemleri damlacık teknolojileri, küresel kültürler, havaya yükselme ve kollajen, Matrigel veya Polietilen glikol (PEG)2 gibi doğal veya sentetik jelleri birleşmeyle kültürleri ikna etmek için manyetik parçacıklar hücrelerle zonklayan asılı kullanımını içerir . Burada, 3D küresel kültürler 1536-şey plaka biçiminde kurulan kanser hücre satırlarından üretmek için daha önce gelişmiş bir teknik detaylı yöntemleri mevcut. Bu protokol için yüksek tanımlı bir orta normalde yapisan hücre hatları9eki önleyen kullanılır. Bu sistem sınırlamaları vardır (yani, tam olarak karmaşık bir modeli sistem kanseri özetlemek olamaz), ama yine de, bu deneyleri bir yüksek-den geçerek tarama küçük moleküller büyük koleksiyonları ve uyuşturucu yanıtının Çapraz karşılaştırma etkinleştirin çeşitli hücre satırları ve bileşikleri karşı 2D ve 3D kültürler arasında.
Hücre hatları bu makaledeki yöntemlerden yolu, kanser, dysregulated son derece olan bir yol sinyal MAPK ilgili genlerin tüm liman mutasyonların göstermek için seçilen ve hangi birçok tedavi için kullanılabilir. Satırları da KRAS, Nöroblastom RAS veya NRAS, Harvey sıçan sarkomu virüs onkogen veya HRAS ve ilişkili kinaz hızla hızlandırılmış Fibrosarcomas da bilinir Kirsten sıçan sarkomu virüs oncogenic mutasyonların aktive var RAFs. Son edebiyat bu yolun farklı düğümlerin inhibitörleri 3D koşulları9,10altında yetiştirilen hücre satırları alt kümesinde benzersiz olarak daha etkili olduğunu göstermektedir. Bir çalışmada kanser hücrelerinin etkin RAS ile 3D kültürlü ne zaman, onlar MAPK inhibitörleri için artan bir hassasiyet gösterdi ve ayrıca, bu yaklaşım yolları tanımlayabilir ve geleneksel 2D cevapsız inhibitörleri hedef bulundu ayarı. Bu çalışmanın amacı bu hücre satırları kültür için kullanılan yöntemleri sunmaktır ve ayrıca, kültür sistemleri sadece 3D kullanırken gözlenen bu inhibitörleri yanıtlarını diferansiyel göstermek için hücre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kültür 1536-şey 3D tümör pulcuklarının
- Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM/F12) 500 mL aşağıdaki ayıraçlar ekleyerek bir taze 3D tümör küresel orta kök (hücre orta + nakavt serumu değiştirme + insülin-transferrin-selenyum) hazırlamak: 1 x penisilin/streptomisin, insan 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), 20 ng/mL insan epidermal büyüme faktörü (EGF), %0,4 Sığır serum albumin (BSA) (Kesir V), 1 x insülin-transferrin-selenyum ve % 1'nakavt (KO) serum değiştirme (değil donma-çözülme).
- Filtre-0.4 µm şişe-ilk filtre sistemi aracılığıyla takviyeleri ile tüm Orta sterilize.
- Önerilen rutin kültür şartlarından yıkama tarafından geleneksel hücre kültürü şişeler göre büyüyen kanser hücre satırları ayırmak 3 x 1 x fosfat ile arabelleğe alınmış serum (PBS) ve % 0.25 tripsin (1 mL uygun bir miktar ekleniyor 5 cm2) başına hücrenin üzerine ince bir tabaka oluşturmak 5 min için. 5 x serum içeren orta miktarda tripsin etkisiz hale getirmek ve hücreleri saymak için devam edin. Örneğin, orta 25 mL 5 mL tripsin için kullanın.
- Toplam 8 µL küresel orta bir kuyu başına 500 hücre doku kültürü tedavi 1536-şey kalıplara tohum için hücre çözümü için 62,5 x 104 hücre/mL konsantrasyonu ayarlayın.
- Bir biyolojik emanet dolabı, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset peristaltik pompa-tabanlı bir sistem ile kullanarak hücreleri tohum. Kaset 1 x PBS ve % 70 ile tüp farklı hücre aralarını temizlemek için 10 etanol s.
- Alternatif olarak, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset ve peristaltik pompa veya tabak gerekli hücre satır başına sayısına bağlı olarak bir ekli şırınga pompa kullanarak bir HEPA filtre oda içinde bulunan sıvı bir işleyici kullanarak hücreleri tohum.
- Bir nefes alabilir yapışkan plaka mühür de el ile veya bir tabak mühürleyen kullanarak plakalarının.
- 10 rpm ve 37 ° C % 5 karbondioksit (CO2) ve %95 bağıl nem ile ayarlamak bir iplik kuluçka tabak koyun. 3 d formuna pulcuklarının izin.
2. kültür 1536-şey 2D kanser satırları
Not: 1536-şey 2D kanser satırları ek bahçedeki 3D plakaları önce 24 h kültürlü.
- Seçili satırlar için bir uygun büyüme ortamının 500 ml aşağıdaki ayıraçlar ekleyerek bir 2D kanser hücre ortamı hazırlamak: 1 x penisilin/streptomisin ve % 10 fetal Sığır serum (FBS).
- Filtre-0.4 µm şişe-ilk filtre sistemi aracılığıyla takviyeleri ile tüm Orta sterilize.
- Önerilen rutin kültür şartlarından yıkama tarafından geleneksel hücre kültürü şişeler göre büyüyen kanser hücre satırları ayırmak 3 x 1 x PBS ve 5 min için % 0.25 tripsin (5 cm2başına 1 mL) uygun bir miktar ekleniyor hücrenin üzerine ince bir tabaka oluşturmak. 5 x serum içeren orta miktarda tripsin etkisiz hale getirmek ve hücreleri saymak için devam edin. Örneğin, orta 25 mL 5 mL tripsin için kullanın.
- Hücre çözümü için 62,5 x 104 hücre/mL konsantrasyonu tam orta 8 µL kuyuda başına 500 hücre Toplam 1536-iyi doku kültürü tedavi kalıplara tohum için ayarlayın.
- Bir biyolojik emanet dolabı, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset peristaltik pompa-tabanlı bir sistem ile kullanarak hücreleri tohum. Kaset 1 x steril PBS ve % 70 ile tüp farklı hücre aralarını temizlemek için 10 etanol s.
- Alternatif olarak, steril, küçük çelik uçlu Paslanmaz kaset ve peristaltik pompa veya hücre başına plakaların hacmine bağlı olarak ekli şırınga pompa kullanarak bir HEPA filtre robotik oda içinde bulunan sıvı bir işleyici kullanarak hücreleri tohum gerekli satır.
- Bir nefes alabilir yapışkan plaka mühür de el ile veya bir tabak mühürleyen kullanarak plakalarının.
- 10 rpm ve 37 ° C % 5 CO2 ve % 95 bağıl nem ile bileşik toplama önce 24 h için ayarlamak bir iplik kuluçka tabak koyun.
3. Bileşik toplama
- Sıvı işleme robot 10 mM en iyi bir konsantrasyon ile % 100 dimetil sülfoksit (DMSO) MAPK inhibitörleri, 8-point, 3-fold seri dilutions hazırlayın. Proteasome inhibitörü Bortezomib olumlu bir denetim olarak tam bir hücre tahlil dinamik aralığını belirlemek için öldürmek için kullanılır.
- Hızlı-spin all tahlil plakaları ve herhangi bir yoğunlaşma toplamak için 100 x g de bileşik plakaları. Yapışkanlı mühür her tabaktan kaldırmak ve bir tabak 8 toplam eklemek için bir akustik dağıtıcı set-up üzerinde yer her bileşik/seyreltme % 0,1 DMSO iyi başına son bir konsantrasyon ve 10 µM üst bileşik dozu temsil eden nL.
- Bileşik ilavesi tamamlandıktan sonra buharlaşma plaka üzerinde engeller ve bir iplik Kuluçka Gelişim makinesi 37 ° C'de % 5 CO2 ve % 95 bağıl nem ile 5 d için plaka yerleştirin bir ısmarlama, paslanmaz çelik hücre kültür kapak koyun.
4. algılama reaktif toplama ve ham veri Acquirement
- Yeterli bir hücre çoğalması, oda sıcaklığında veya 37 ° C su banyosu adenin trifosfat (ATP) değişiklikler ve böylece, değişiklikleri algılamak için biyoluminesans içeren bir hücre lizis reaktif hacmi önceden ısıtmak. Algılama reaktif 3 µL toplam peristaltik pompa kullanarak her şey ekleyin ve en az 15 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçkaya.
- Bir tabak luminometer üzerinde ışıldama yakalamak.
5. veri işleme
- Araç ham veri ayıklamak ve bütün wells DMSO tarafsız denetim olarak yalnız içeren ortalama test bileşikler içeren tüm alanlar normalleştirmek. Bu değeri, her bileşik yüzde büyüme inhibisyonu hesaplayın. Bu Microsoft Excel'de formül işlevini kullanarak tamamlanır nerede f (x) = {(örnek değer göreli ışık birimleri (RLUs) / (DMSO değeri RLUs Ortalama) * 100)}.
- Doz-yanıt eğrileri ve inhibitör IC50s değerleri normalleştirilmiş veri--dan adım 5.1 bir grafik programı kullanarak bileşik toplama karşı grafiklerini çizerek oluşturmak.
Not: Helios, bir iç NIBR yazılım aracı kullanarak verileri analiz ettik. Bu işlevi tamamlamak için parametrik olmayan eğri çözümleme aracı seçili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli kurulan kanser hücre hatları de 2D kültür koşullar altında büyümeye bilinir burada açıklanan yöntemleri kullanarak test edildi. Temsilcisi imge--dan a değişiklik-in MAPK mutant kanser hücre hatları (Calu-6:KRAS, ncı-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS ve KNS-62:HRAS) Şekil 1' de görülmektedir. Bu görüntüler hücre hatları çeşitli türleri morfoloji olmasına rağmen her 1536-iyi tahlil levhalar yaylıdır 3D yapılar oluşan göstermektedir. Şekil 2 gösteren, büyük ölçekli tarama için kullanıldığında 2D karşı bu 3D yetiştirilen kültürler arasındaki fark bileşik hassasiyet görülebilir. Grafikteki her nokta bir bileşik'ın inhibitör konsantrasyon temsil eden bir % 50 hücre öldürme veya bileşik'ın IC50 her iki ayar yanıtta olduğu yerde. Etkisi sadece farklı medya tarafından aracılı değil göstermek için Calu-6 hücre 2B doku kültürlü tabak ya da eki önlemek 3D Scivax biyofilm plakaları kullanarak aynı medyada kültürlü. Artan duyarlılık veya alt IC50 3D büyüme koşulu için Tamamlayıcı Şekil 1 ' de iki bileşikleri aynı medya için görülür. Calu-6 gibi çizgiler SK-MEL-30 gibi çizgiler daha az duyarlı 2B için karşılaştırıldığında 3D olmakla birlikte 3D koşullar altında yetiştirilen bileşikler için artan bir hassasiyet göstermektedir. Tablo 1 Bu ekranda kullanılan tüm hücre satırları hakkında ek bilgiler içerir.
Temsilcisi doz-yanıt eğrileri örnekleri Şekil 3' te görüntülenir. Bu rakam iki bileşikler, RAF265 fark etkinliğini göstermektedir (Şekil 3A) ve RAF709 (Şekil 3B), hangi RAF kinaz aktivitesi inhibe. Her iki bileşiklerdir 3D daha güçlü Calu-6, küçük hücreli dışı akciğer kanseri olan koşullarda satır barındıran Q61K, protein KRAS etkinleştiren bir mutasyon. Aynı zamanda, her iki benzer şekilde güçlü 3D pulcuklarının ve 2D kültürler KRAS G13D aktive mutasyon içeren HCT116 kolon kanseri satırından bileşiklerdir. Duyarlılık arttı etkisini tarafından aracılık ettiği göstermek için 3D ve 2D ve değil, sadece farklı ortam koşulları tarafından Calu-6 hücre büyüme durumu yetiştirilen FBS her iki koşul altında kullanma. 2D ve 3D koşulları FBS kullandığınızda ek Şekil 1' de görüldüğü gibi 3D kültür hala daha düşük bir IC50 üreten bileşikler yüksek bir duyarlılık gösterir.
Son olarak, 3D tahlil Ayrıca RAF dimer son derece etkin RAS mutant hatları ve dimer bağımsız yolu eksik bir inhibisyonu olduğunda oluştuğu bilinmektedir paradoksal büyüme etkinleştirme olgusunun bir gözlem izin etkinleştirme BRAF V600E mutasyonlar11,12' bulundu. Bu harekete geçirmek Şekil 4' te, görülür KNS-62 3D koşullarda BRAF inhibitörü Dabrafenib ile tedavi, üzerine bir HRAS mutasyona uğramış küçük hücre akciğer kanseri satır ve aynı zamanda atipik BRAF mutant pankreas hücreye BxPC-3 hat. Büyüme ilaç düşük konsantrasyonlarda aktif ve büyüme sadece uyuşturucu (Şekil 4B) yüksek konsantrasyonları baskı altında. Bu harekete geçirmek KRAS mutant satır Calu-6 görülen şaşırtıcı değildi ve V600E BRAF mutant çizgi A375 beklenen değil bir şey. Diğer 3D büyüme modelleri (veri gösterilmez) kullanarak Calu 6 paradoksal bir aktivasyon gözlemledim.
Şekil 1: 3D 1536-şey levha büyüyen kanser hücrelerinin temsilcisi görüntüler. Hücreleri bir reaktif pınarı ve küçük bir kaset kullanarak 1536-şey plakaları 3 d toplam kaplama. 4 X lens ile ters bir mikroskobunun alınan Bright-alan görüntüleri göstermek çeşitli 3D türleri morfoloji MAPK mutant hücre hatlarında Calu-6:KRAS, ncı-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS ve KNS-62:HRAS. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir dağılım çizim ve 3D bileşik etkinlik 2D - hücre hatları arasında karşılaştırma. Bileşik etkinlik karar vermeden önce daha önce 3 d için oluşturulan, pulcuklarının sonra bileşikler için ek bir 5 d ile tedavi edildi. Her daire benzersiz bir bileşik yanıt temsil eder. Hücre çoğalması değişimler litik hücre proliferasyonu reaktif kullanarak tespit edildi ve IC50s Helios iç bu yazılımlar ile dört parametre logistic regresyon analizi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: doz-yanıt eğrileri karşılaştırma 2D - karşı 3D-bileşik yeterliği. Doz-yanıt eğrileri DMSO kontrollere göre bileşik etkinlik göstermektedir. KRAS mutant Calu-6 ve HCT116 hücreleri ile iki RAF inhibitörleri, RAF265 ve RAF709, tedavi eğrileri burada görüntülenir DMSO için karşılaştırıldığında yüzde değişim içinde hücre büyüme (% büyüme inhibisyon) olarak kontrol wells. 2D koşullar altında yetiştirilmiştir hücreleri nüfusu kırmızı olarak görüntülenir ve bunlar mavi 3D pulcuklarının büyüdü. Düz çizgiler veri etrafında % 95 güven aralıkları her veri kümesi için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: 3D bazı kültürler paradoksal büyüme etkinleştirme olayları yakalamak. Doz-yanıt eğrileri DMSO kontrollere göre bileşik etkinlik (% büyüme inhibisyon) göstermektedir. KRAS mutant Calu-6, BRAF V600E mutant A375, HRAS mutant KNS-62 ve Dabrafenib burada görüntülenir paradoksal bir harekete geçirmek ile tedavi atipik BRAF mutant BxPC-3 hücreleri eğrileri. 2D koşullar altında yetiştirilmiştir hücreleri nüfusu kırmızı olarak görüntülenir ve bunlar mavi 3D pulcuklarının büyüdü. Düz çizgiler veri etrafında % 95 güven aralıkları her veri kümesi için gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1: 2D - karşı 3D bileşik etkinlik ortamı içeren FBS karşılaştırma doz-yanıt eğrileri. Doz-yanıt eğrileri DMSO kontrollere göre bileşik etkinlik göstermektedir. KRAS mutant Calu-6 hücre iki RAF işlemcimiz, RAF265 ve RAF709, tedavi eğrileri burada görüntülenir DMSO için karşılaştırıldığında yüzde değişim içinde hücre büyüme (% büyüme inhibisyon) olarak kontrol wells. 2D koşullar altında yetiştirilmiştir hücreleri nüfusu kırmızı olarak görüntülenir ve bunlar mavi 3D pulcuklarının büyüdü. Her iki koşul FBS içeren medya kullanın. Hata çubukları standart sapmalar 2 bireysel veri kümelerinden temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hücre satırı adı | Soy | BRAF | RAS |
| A-375 | Melanom | V600E | WT |
| BxPC-3 | Pankreas | V487-P492 > A | WT |
| Calu6 | Küçük hücreli dışı akciğer kanseri | WT | KRAS Q61K |
| HCT 116 | Kolorektal | WT | KRAS G13C |
| IPC-298 | Melanom | WT | NRAS Q61L |
| KNS-62 | Skuamöz akciğer | WT | HRAS Q61L |
| NCI-H1299 | Akciğer | WT | NRAS G12D |
| PANC-1 | Pankreas | WT | KRAS G12D |
| SKMEL-30 | Melanom | WT | NRAS Q61K |
Tablo 1: Hücre satırı bilgileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntemleri 1536-şey tabak büyük ölçekli bileşik izlemek için tümör pulcuklarının üretmek nasıl ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu yöntemler başlangıçta nerede tümör pulcuklarının düşük işlem hacmi deneyleri genetik bağımlılıkları ve bileşik duyarlılık13, hakkında soru sormak için 6-şey ve 96-iyi tabak içinde yetiştirilen Ulusal Kanser Enstitüsü'nde işten adapte 14 , 15. bir kritik ve benzersiz bu protokolü pulcuklarının hücrelerden 1536-tabaklar tanımlanan kullanarak geleneksel 2B doku kültürlü oluşan özelliğidir medya SCM + KO + ITS anılacaktır. Hücrelerin içinde seribaşı sonra herhangi bir buharlaşma süresine 3 d küresel oluşumu engellemek için nefes yapışkan plaka mühürler ile mühürlendi. Pulcuklarının da daha uzun süre bu yaklaşım16kullanarak kültürlü. Küre oluşumu 3 d sonra bileşikleri hücre büyümesi ile bir litik tabanlı yayılması reaktif değişimler raporlaması önce 5 d için eklenir. Normalleştirme için denetim wells ve IC50s hesaplanması 2D vs içinde kültürlü hücreler arasında sonra 3D, bileşik tedavi hücrelerdeki değişiklikler denetim tedavi hücrelere karşılaştırılır.
1536-şey beri plakaları normal doku tedavi plakaları ve değil hidrojel kaplı veya hücre keşfedilmeden tabak, bu protokol bir sınırlama bu protokolü başarılı yürütülmesi için önemli bir faktördür tanımlanmış orta kullanımı. KO serum yerine başlangıçta yeteneğini başarıyla 3D17 embriyonik kök hücrelerinin büyümesini yardım test edilmiş ve bu protokol için birçok tümör küresel hatları13,15, büyüme için uyarlanmış 18 , 19. olduğunu 2D büyüme karşı 3D pulcuklarının hücreleri için ortam koşulları farklılıklar gösterse de, biz daha önce göstermiştir ilaç duyarlılığı farklı etkileri büyüme biçimi tarafından aracılı unutmamak ve değil sadece medya kompozisyon9farklılıkları.
Bu iletişim kuralı, bir sorun giderme adımı olarak başarılı olmasını sağlamak için bir dizi tahlil geliştirme deney ilk yürütülmektedir ki büyük ölçekli bir ekranda başlamadan önce her hücre kültürünü en iyi duruma getirmek için önerilir. Bu örnekte, tüm denetlesinler hücre satırları ilk onlar iyi başına 500 hücre aynı başlangıç yoğunluğu, seribaşı Eğer belirlemek için değerlendirildi. Onlar o zaman standart sapma (SD) ve katsayıları bir varyans (CVs) büyüme dönemi süresince incelemek için salt DMSO plakalı denetlesinler. Bu tahlil geliştirme yerde bile ile belirli satırları diğerlerinden daha hızlı büyüdü ve daha fazla tohum yoğunlukları ve daha zorlu bu satırları deneme süresi optimize etmek yararlı olurdu. Son olarak, burada sunulan veri evrensel bir olay yerine bir eğilim olduğunu, kesin NSCLC gibi hücre satırları benzersiz olarak MAPK yolu bu 2D olarak yetiştirilen karşılaştırıldığında 3D hedefleme bileşikler daha hassas olmak Calu-6 hat göstermektedir. Ek deneyler ne biyolojik mekanizmaları bu çarpıcı fark duyarlılık düzenleyen için katkıda belirlemek için devam etmektedir.
Ekran pulcuklarının bir ultra-HTS ortamda yeteneği erken ilaç bulma işleminde kullanılmak üzere 3D kültürler sağlar ve yalnızca bir 3D ortamda etkin olduğu roman kimyasal madde tanımlaması sağlayabilir. İle o kadar çok 3D uygulama deneyleri olup olmadığını asla uzanmak çarşı etkinliği hastaların, eksikliği nedeniyle de olsa Büyüme inhibisyon içinde vitro ve regresyon vivo içindegösteren klinik adaylar takım sorgulama başladı olabilir Bu daha önce bulma işleminde köprü. 96-şey veya 384-şey yöntemlerini kullanırken kültür hücreleri 3D için çok sayıda farklı plaka türü vardır. Burada, biz bireysel pulcuklarının birden çok resimde üretmek 1536-iyi yöntemler sundu. Gelecekte, bu bulgular benzer ekranlar damla asılı olarak hücreleri büyümek olabilir 1536-şey plakaları veya hangi hidrojel/Matrigel ile kaplanır ve yuvarlak alt olan tabak gibi geliştirilmekte olan yeni teknolojileri kullanarak karşılaştırıldığında, Hangi şey başına bir küre oluşumu için izin verecek. Bu koşullar karmaşıklık bile daha fizyolojik olarak ilgili, yapım onları tarama için kullanılan kültür koşullarına ek katmanlar tanıtmak ve tezgah çeviri roman için başucu için artan bir oranını temsil edebilir terapiler. Bu teknolojiler daha büyük pulcuklarının kullanımını gerektiren hipoksi veya difüzyon degradeler içeren bilimsel sorular da sağlayacak.
Yöntemleri burada bileşikleri küçük molekül Kütüphanesi karşı bu pulcuklarının eleme odak sundu. Gelecekte, bu yöntemler için roman destekte ve biotherapeutics bı özgü antikor veya nerede 3D kültürleri daha fizyolojik ilgili antikor-antijen etkileşim sağlayabilir antikor-uyuşturucu conjugates, gibi ekran genişletmek olabilir. Buna ek olarak, 3D pulcuklarının kullanımını anlama hedefleri ve ortaya çıkan IMMUNO-Onkoloji alanı21müdahaleler için hastalık ilgili deneyleri geliştirmek için kritik olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar Novartis çalışanlarının, ve bazı çalışanlar da hissedarları vardır.
Acknowledgments
Yazarlar Marc Ferrer Ulusal Merkezi translasyonel Bilimler ilerleyen, Ulusal Sağlık Enstitüleri için onun destek ve rehberlik bu deneyleri ilk geliştirme için kabul etmek istiyorum. Buna ek olarak, Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling ve Vesselina Cooke onların bilimsel girdi ve ekip üyeleri proje olarak tartışma için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
References
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
