Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Published: May 15, 2018 doi: 10.3791/57499
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

Abstract

מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים היעד משמשת לזיהוי מוטציות תשואה של פנוטיפ הרצוי. שיטות העשויות לשמש להשגת מוטגנזה מכוונת אקראי, PCR לשגיאות היא אסטרטגיה נוחה ויעילה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות (כלומר., ספרייה מוטציה). PCR לשגיאות הוא שיטת הבחירה כאשר חוקר מבקש להפוך למוטציות אזור מוגדרים מראש, כגון האזור קידוד של הגן תוך השארת אזורים אחרים גנומית מעושה. לאחר ספריית מוטנטים מוגבר על-ידי ה-PCR לשגיאות, זה חייב להיות משובטים לתוך פלסמיד מתאים. הגודל של הספרייה שנוצר על ידי ה-PCR לשגיאות מוגבל בשל היעילות של השלב שיבוט. עם זאת, בשמרים ביקוע, שמר הביקוע, הצעד השיבוט יכול להיות מוחלף על ידי שימוש יעילים ביותר בשלב אחד פיוז'ן PCR כדי ליצור מבנים לשינוי. מוטציות של פנוטיפים הרצוי ייתכן ואז שנבחר באמצעות עיתונאים המתאים. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה הזאת בפירוט, לוקחים כדוגמה, כתב להוסיפה אצל הטרוכרומטין centromeric.

Introduction

גנטיקה קדימה היא שיטה קלאסית שבה חוקרים לחפש מוטנטים המתרחשים באופן טבעי המציגים פנוטיפ מסוים, ואת לבצע ניתוח גנטי. גנטיקה הפוכה, מוטציות יוכנסו הגן עניין, פנוטיפ נבדק. במקרה האחרון, מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים יעד משמש לעתים קרובות כדי ליצור מאגר של מוטציות נבחרו לאחר מכן עבור פנוטיפים הרצויה, כגון רגישות טמפרטורה או שינו את פעילות אנזימטיות. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להשיג מוטגנזה מכוונת אקראי, כולל PCR לשגיאות1; הקרנה UV2; מוטגנים כימיים, כגון אתיל methanesulfonate (EMS) או חומצה חנקיתית3; השימוש של זנים הנתונים זמניים, כגון אלה יתר לבטא mutD5 4; וסדר דנ א5.

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה הפוכה-גנטיקה שבו אנו מנצלים PCR לשגיאות לייצר בריכות מוטציה גן המטרה שמרים ביקוע. כפי שאפשר לנחש מהשם שלו, שיטה זו יוצר מוטציות על ידי בכוונה הצגת שגיאות במהלך ה-PCR. בניגוד לשיטות אחרות מוטגנזה מכוונת, PCR לשגיאות מאפשר למשתמש להגדיר את האזור כדי להיות mutagenized. זה עושה את זה שימושי במיוחד המאמצים לחקור את הפונקציה של חלבון/תחום עניין.

כדי להדגים את הפרוצדורה מוטגנזה מכוונת אקראית זו, אנו בזאת השתמש rpt4 +, שמקודד את יחידת משנה פרוטאוזום 19, כדוגמה. Rpt4 הוכח יש פונקציות proteolysis תלויית אורגניזמים שאינם ביקוע שמרים6,7,8,9, פגם proteolysis עלול לגרום השפעות עקיפות על ידי שינוי חלבונים רמות. לפיכך, אנו, איבחון מוטציות שהפעיל שינויים proteolysis עצמאית, במטרה לחקור את תפקוד פרוטאוזום על הטרוכרומטין.

PCR לשגיאות ניתן ליישם בכל אזור הגן על-ידי כוונון המיקום שבו לאגד צבעי יסוד. ניתן לזהות מוטנטים כי התערוכה פנוטיפי לשינוי המיוחל עם כתבים המתאים. כאן, אנחנו מנוצל של הכתב ade6 + הוספת תאים 1 החיצוני חוזרים על עצמם (otr) אזור10. הטרוכרומטין מכוננת נוצר ב אזור זה11, אז הכתב ade6 + מושתק במצב פראי-סוג; זה מסומן על ידי מושבות אדום10. מוטציה אשר שיערער את הטרוכרומטין מכוננת על תאים יוביל הביטוי של ade6 + הכתב, אשר הוא מדמיין בתור מושבות לבן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיה

  1. להכין תמצית שמרים עם תוספי מזון (כן), כן ללא אדנין (כן נמוך אייד), בינוני הביקוע גלוטמט (PMG12), וכן PMG ללא אדנין (PMG-אייד) על ידי ערבוב המרכיבים כפי שמתואר בטבלה 1. כן-אייד (איד נמוכה) ו לוחות PMG איד יש את כל המרכיבים אותו, אבל אדנין מושמט מן האחרון.
    1. השתמש המניה מלח (50 x) הבאות: 52.5 g/L MgCl2·6H2O 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 גרם/ליטר אשלגן כלורי, 2 g/L נה2כך4 ב מים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.
    2. השתמש ויטמין הבאים (1, 000 x) מניות: 1 g/L pantothenate 10 גרם/ליטר nicotinic חומצה, אינוסיטול 10 גרם/ליטר, ביוטין 10 mg/L במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.
    3. השתמש המינרל הבאים (10, 000 x) מניות: חומצה בורית 5 g/L, MnSO 4 g/L4,4·7H ZnSO 4 g/L2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, MoO 0.4 g/L3, 1 g/L קי, 0.4 g/L CuSO4·5H2O , 10 גרם/ליטר חומצת לימון במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: בינוני נוזלי כן יכולה להיעשות על-ידי השמטת את אגר.
  2. אוטוקלב המדיום לקרר אותו אל מתחת 60 ° C תוך כדי ערבוב עם בר stir, בקצב של 200 סל ד.
  3. עבור לוחות כן + G418 (geneticin), להוסיף 1 מ"ל/L G418 פתרון מניות המדיום. כן.
    1. להשתמש את G418 הבאים (1, 000 x) מניות: 100 מ"ג/מ"ל G418 במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר, aliquot 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, חנות ב-20 ° C.
  4. מערבבים עוד 5-10 דקות, aliquot התקשורת 90-מ מ פטרי (1 ליטר של aliquots בינוני עד בערך 40 פטרי. חנות את הלוחיות ב 4 º C.

2. שיבוט של rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs

  1. לבצע PCR עם תחל p1 ו- p2 (איור 1 א') באמצעות ביקוע שמרים הדנ א (gDNA) כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), ולאחר החלת את מחזורי התגובה המתוארות בטבלה 2 כדי להגביר 3,315-בסיס פרגמנט זוג (bp) הכוללת rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות של ערכת טיהור13 לפי הוראות היצרן (איור 1 א').
  2. לעכל את וקטור KS(-) pBlueScript14 ו את מקטע ה-DNA מוגבר המכיל rpt4 + עם שלה 5' / 3' UTRs עם BamH1 ו Xho1 ב הנפח הכולל של 20 µL (DNA ~ 1 µg, אנזים U 20, 1 x עיכול מאגר) ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך 16-18 h (איור 1B).
  3. ג'ל לטהר את הווקטור מעוכל (1.2% agarose ג'ל) והכנס את הדנ א על ידי ביצוע מבוסס-טה agarose בג'ל (100 וולט, 1 h), excising הלהקות הדנ א של גודל הרצוי לבודד את ה-DNA עם ערכת חילוץ ג'ל15.
  4. מאתרים ומפסיקים את וקטור והוספה הדנ א באמצעות T4 DNA ליגאז על-ידי ביצוע תגובה מצדו 20-µL המכיל 50-100 ננוגרם של וקטור ה-DNA, ~ 3-fold טוחנת עודף של ה-DNA של הוספה, 400 U T4 DNA ליגאז 1 x מאגר מצדו. דגירה תערובת זו ב 18 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.
  5. להפוך את ה-DNA מחוברים µL 100 של e. coli DH5α על-ידי החלת הלם חום עבור 70 s-42 ° C. להוסיף 1 מ"ל של ליברות, תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס להתאוששות. לבצע צנטריפוגה (13,800 x g), למחוק את הצלחת supernatant, כל טרנספורמציה e. coli תאים על צלחות LB-אמפיצילין (LA), של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
  6. לבחור 4-8 מושבות עם קיסמים ולגדול בן לילה ב 37 ° C 3 מ ל LA בינוני.
  7. לבודד את פלסמידים עם פלסמיד טיהור ערכת16 בשימוש על פי הפרוטוקול של היצרן ולבצע digestions אנליטית אנזים הגבלה עם 5 µL של פלסמיד מבודד, 5 U של כל אנזים הגבלה (BamH1 , Xho1) ו- 1 x מאגר ההגבלה. דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור 3 ח' אשר השיבוט על-ידי קביעת רצף המועמד פלסמידים.

3. החדרת מוטציה שקטה (Xho1 הגבלת האתר)

  1. עיצוב זוג תחל 33-bp (p3 ו- p4) המכילים את השינוי הרצוי ברצף אחרת משלימים.
  2. לבצע PCR עם אמינות גבוהה פולימראז17 (איור 1C) בהנפח הכולל של 25 µL (10 ng של פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר) באמצעות אופניים הפרמטרים המפורטים בטבלה3.
  3. לעכל את פלסמיד תבנית עם Dpnאני בהנפח הכולל של µL 20 (20 U אנזים, 1 x עיכול מאגר) ב- 37 מעלות צלזיוס ב מים אמבט 1 h.
  4. לשנות, להפיץ, לבודד, רצף של פלסמיד המכיל את מוטציה שקטה, כמתואר בצעדים 2.5-2.7.
    הערה: מוטציה שקטה יכולה גם הציג באמצעות שיטת השיבוט המאפשר חיבור שברי DNA מרובים התגובה יחיד18.

4. אקראי מוטגנזה מכוונת של rpt4 + מאת PCR לשגיאות

  1. לבצע PCR לשגיאות, באמצעות פלסמיד את המוטציה שקט (אתרXho1 ) התבנית, תחל p5 ו- p6, הנפח הכולל של 50 µL (כמות תבנית מוגדרת בשלב 4.1.1, 2 µL 10 pmol פריימר מיקס, אנזים U 2.5, מאגר התגובה x 1) , ואת פולימראז מיוחד אשר נועד ליצור שגיאת גבוה שיעור19 (איור 1D). לבצע PCR כפי שמתואר בטבלה 2.
    1. השתמש µg 4-5 של תבנית פלסמיד לשלוט תדירות מוטציה ל bp 1/kb (kilobase).
      הערה: ריכוז גבוה (> 500 ng/µL) של פלסמיד, אשר ניתן לקבל באמצעות ערכת הכנה מיני20, נדרש.
  2. להשתמש בג'ל כדי לאשר מוצר ה-PCR של 2670 bp (1.2% agarose ג'ל). ג'ל לטהר המוצר PCR כפי שמתואר בשלב 2.5.

5. הכנה של פיוז'ן PCR קטעים (קאן, 3' UTR)

  1. לבצע PCR באמצעות pFA6a-KANMX621 תבנית, תחל p7 ו p8, התנאים המפורטים בטבלה 4 כדי לקבל השבר סמן (קאן). ג'ל לטהר השבר 1,480-bp וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 2.5 (איור 1E).
    1. בדוק אם stop codon של הגן שמיועד מוטציה ובאזור קידוד של גנים סמוכים שלה מופרדים על-ידי יותר מ-500 bp. לא ניתן להשתמש המחסל אנדוגני כאשר אזור זה הוא פחות מ 500 bp; במקום זאת, המחסל ADH אמור לשמש במקום המחסל אנדוגני. השינויים פרוטוקול נדרש להשתמש המחסל ADH מוצגים בטבלה 5.
      הערה: שינויים אלה חל רק כאשר המחסל ADH , אשר זמין פלסמיד pFA6a-3HA-KANMX6, משמש במקום המחסל אנדוגני.
  2. לבצע PCR עם משובטים rpt4 +-שמכיל וקטור p9 תבנית ואת צבעי בסיס, p10 ב הנפח הכולל של 50 µL (20 ng את פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר), להשתמש בתנאים המוצגים טבלה 6. ג'ל לטהר שהושג 506-bp 3' UTR השבר (איור 1E).

6. דור של הבונה השינוי על ידי היתוך PCR (איור 1E)

  1. להכין את השברים 3 (mutagenized rpt4 +קאן, את 3' UTR) ב- 50 ng/µL.
  2. לבצע היתוך ש-PCR של השלושה קטעים באמצעות תחל p11 ו- p12, כפי שמתואר בטבלה 7. (הפרוטוקול עבור פיוז'ן PCR הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי22). לטהר המוצר העיקרי של ה-PCR 4,398-bp.
    1. השתמש rpt4 +: KAN:3'UTR קטעים ביחס של 1:3:1 לקבלת תוצאות אופטימליות.
      הערה: הסכום הכולל של ה-DNA הוספה לא יעלה על 500 ng. הכמות המומלצת של rpt4 +: KAN:3'UTR הוא 50 ng:150 ng:50 ng. האזור mutagenized הוא כ- 1.6 קילו, אז המספר המינימלי של מושבות שמרים זה היה חשבון על כל השילובים האפשריים של כל בסיס להיות מוטציה לשלושה האחרים הוא 1,600 x 3 = 4,800 מושבות. כי התגובה טרנספורמציה אחת מניבה בדרך כלל המושבות 400-500, התגובות לפחות 10 שווה של פיוז'ן PCR לבנות נדרשת. צורך זה יכולים להתקיים על ידי פשוט הגדלת הסכום התגובה (קרי, מספר המבחנות) לפי פקטור של 10.

7. שינוי של שמרים ביקוע על ידי אלקטרופורציה (איור 1F)

  1. לחסן שמרים עד 10 מ"ל של כן בינוניים עד רוויה מאת המקננת זה עבור יותר מ 16 h.
  2. לדלל לתאים צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.2 ב 200 מ ל כן בינוני דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות עבור h 5-6, כדי OD600 = 0.6 - 0.8.
  3. להתרכז לתאים OD600 = 30, לוותר על ארבעה צינורות חרוט 50-mL ולהירגע על קרח למשך 10 דקות.
  4. לקצור את התאים על ידי ביצוע צנטריפוגה ב 1,050 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות, אלקטרו 10-וואקום על קרח. בצע את השלבים 7.3-7.8 על קרח.
  5. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 15 מ"ל של 1.2 מ' בסורביטול. ללחוץ בעדינות את הצינורות כדי resuspend את התאים.
  6. Centrifuge התאים ב- g x 1050 עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
  7. חזור על שלבים 7.4 ו- 7.5. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 500 µL של 1.2 מ' בסורביטול כל שפופרת, resuspend את התאים, וכן לאסוף את כל התאים אחד צינור חרוטי 15-ml.
  8. להוסיף בסורביטול 1.2 מ' עד 2.4 מ ל (OD600 = 10 0.2 מ"ל). שמור את הצינורית על קרח.
  9. להוסיף 200 µL של תאים בסורביטול-הושעתה (ודא שהם מושעים באופן מלא) צניעותו EP המכיל הפיוז'ן PCR לבנות, מערבבים היטב, להעביר את הדגימה אלקטרו-cuvette.
  10. Electroporate התאים עם האפשרויות הבאות: פטריות, ShS (2.00kV, הדופק 1).
  11. להוסיף µL 600 של 1.2 מ' בסורביטול כל אלקטרו-cuvette עבור הנפח הכולל של 800 µL, ופרש לאחר מכן התאים על כן ארבעה לוחות (µL 200/צלחת). אלקטרו עשר-וואקום אחלק ל-40 כן צלחות.
  12. דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  13. לבצע ציפוי משוכפל כדי כן + G418, דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.

8. מבחר של יציב הטרוכרומטין מוטציות, בדיקת תוצאות חיוביות שגויות

  1. על כל צלחת כן + G418, לבצע ציפוי משוכפל כן-אייד (איד נמוך), צלחות PMG-אייד (לא אייד). תקופת דגירה הלוחות עותק משוכפל של 1-2 ימים ב- 30 מעלות צלזיוס, עד הופעה כלשהי של המושבות על לוחות כן-אייד צבע אדום (איור 1 ג'י).
  2. להשוות לוחות כן-אייד ואייד PMG ותאים בחר להראות ורוד או לבן על הצלחת. איד. כן, גם לגדול על הצלחת PMG-אייד. אל תבחר מושבות ללא גידול על PMG-אייד, כפי שהם תוצאות חיוביות שגויות (למשל, המשקף הקלטת קאן משולב באתר-יעד בחלקים אחרים של הגנום).
  3. לאסוף כ עונה 1 פרק 105 תאים מהמושבה לכל, דגירה ב 10 µL של SPZ, לאודנום zymolyase 2.5 mg/mL 100 T ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות שימוש 1 µL של פתרון זה לבצע כתבנית המוצא המושבה PCR (איור 1 H).
    1. להפוך SPZ (50 מ"ל) על ידי ערבוב 30 מ של 2 מ' בסורביטול, 4.05 מ של 1 מ ' נה2HPO4, mL 0.95 NaH2PO4 ו-15 מיליליטר מים מזוקקים (pH הסופי, 7.5). (5 מ"ל) יכול להיות בתוספת zymolyase ודוגמאות המאוחסן ב- 500-µL aliquots ב-20 ° C עד השימוש.
  4. לבצע בג'ל (1.2% agarose ג'ל, 180V, 20 דקות) כדי להמחיש את התוצאות של + המושבה ה-PCR. בחר תגובות תערוכת ה-PCR להקות של גודל תקין ולעכל 5 µL של כל מוצר התגובה עם Xhoאני (4 U אנזים 1 x עיכול מאגר, תנורים 37 ° C, 1 h) לסנן תוצאות חיוביות שגויות (איור 1 H).
  5. לבצע בג'ל להמחיש את מעכל XhoI (1.2% Agarose ג'ל, 180 V, 20 דקות). סמן את המושבות שמוצריהן PCR נחתכים על ידי XhoI, לרפא אותם ללוחות כן + G418 (איור 1I).
  6. לבודד gDNA מתאי שמרים ביקוע ולבצע רצף של מוצרי ה-PCR23. להשוות את הרצף שהושג עם הרצף פראי-סוג כדי לזהות מוטציות (איור 1I).
  7. ישירות מחדש מציגים את mutation(s) פראי-סוג תאים על-ידי הפיכתם עם בונה פיוז'ן מוגבר על ידי ה-PCR של תאים מוטציה23. כדי לאשר את פנוטיפ בתאים מוטציה עשה לאחרונה (איור 1J) לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט הבחינה.
    1. פיוז'ן שינוי המבנה יכול להיות בקלות מוגבר על ידי PCR עם תחל p1, p10 באמצעות ה-DNA גנומי של מוטציות כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), וליישם את מחזורי התגובה המתוארים בטבלה 2 . טרנספורמציה של הבונה יכול להיעשות על-ידי ביצוע השלבים הבאים 7.1-7.13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המוטציות Rpt4 שנרכש על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים באיור 1 ניתן לנתח אותם על-ידי הערכת את הצבעים של המושבות. הצבעים של המושבות הם הבחינו על גבי הלוחות הרלוונטיים ומקטין את המספר באיור2. הכתב ade6 + להוסיפה אצל באזור הטרוכרומטין מושתק בפראי-סוג ומראה מושבות אדום בצלחת כן-אייד. ברגע הטרוכרומטין הוא גרם אולי לפגיעה ביציבות הכתב ade6 + מתבטא, מושבות לבן יכול להיות שנצפו בצלחת כן-איד כמו מוטציה clr4Δ . המוטציות Rpt4 ממוסך הם כפי שמוצג. מוטציה rpt4-1 מראה destabilization הטרוכרומטין חמור ביותר.

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. (א) ייצוג סכמטי של המוצר PCR מתקבל על ידי בסיבוב הראשון של ה-PCR, אשר מתבצע באמצעות תחל 1 ו- 2. (B) המבוסס על הגבלת שכפול של השבר rpt4 + . (ג) מוטגנזה של וקטור משוכפל משמש כדי להציג מוטציה שקטה אשר מוסיף אתר ההגבלה XhoI . (ד) אקראי מוטגנזה מכוונת של rpt4 + קידוד אזור מתבצעת באמצעות PCR מועדת לטעויות. (ה) השבר מוטציה rpt4 + , השבר קאן ו- 3' UTR השבר הצטרפו פיוז'ן PCR להפקת קלטת טרנספורמציה-מוכנות. (נ) ביקוע השמרים הופכים עם פיוז'ן PCR לבנות, אשר מחליף את רצף אנדוגני rpt4 + מאת רקומבינציה הומולוגית. (G) שנבחר קאן מושבות משוכפל מצופה כן-אייד (איד נמוך), צלחות PMG-אייד (לא אייד) הינם חיוביים מושבות נבחרו. (H) PCR והגבלה XhoI עוקבות של המוצר PCR משמשים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. (I) המוטציה הגורמת של פנוטיפ מזוהה על ידי תיקון של מושבות שנבחר, התפשטות של תאים, הפקת דנ א גנומי (gDNA), רצף של החלק הרלוונטי של rpt4 +. (J) מוטציות סיבתי מאושרות (ואת תוצאות חיוביות שגויות נשלטים) על ידי החדרת ישירות את המוטציה פראי-סוג התאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הטרוכרומטין מוטנטים דה-דיכוי של Rpt4. תרשים סכמטי של otr1::ade6 + הכתב (למעלה). 5-fold דילולים טורי של מוטציות Rpt4 ממוסך בחר נצפו על גבי הלוחות המצוין בצו של הגדלת רמת הטרוכרומטין הקשורה (למטה). איור זה שונה מן המאמר 'פרוטאוזום 19 מעורבת ישירות ברגולציה של הטרוכרומטין שמתפשט בבית ביקוע שמרים"מאת Seo. et al., 201724. הדמות הלא הקצוץ ניתן למצוא במאמר המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

רכיב סוג של צלחת
כן PMG
תמצית שמרים 5 g/L
גלוקוז 30 g/L 20 גרם/ליטר
אדנין 0.15 g/L 0.1 g/L
היסטידין 0.15 g/L 0.1 g/L
לאוצין 0.15 g/L 0.1 g/L
אורציל 0.15 g/L 0.1 g/L
Pthalate מימן אשלגן 3 g/L
נה2HPO4 2.2 g/L
חומצה גלוטמית-L 3.75 g/L
מלחי 20 מ ל/L
ויטמינים 1 מ"ל/L
מינרלים 0.1 מ"ל/L
אגר 16 g/L 16 g/L

טבלה 1. מרכיבי כן PMG צלחות

טמפרטורה זמן Cycle(s)
95oC 2 דקות מחזור 1
95oC 20 s מחזורים
55oC 30 s
72oC 2 דקות
72oC 8 דקות מחזור 1
8oC . תחזיק

בטבלה 2. תוכנית מומלצת PCR מוטגנזה

טמפרטורה זמן Cycle(s)
95oC 2 דקות מחזור 1
95oC 30 s 19 מחזורים
55oC 1 דקות
72oC 7 דקות
72oC 10 דקות מחזור 1
8oC . תחזיק

בטבלה 3. תוכנית מומלצת PCR PCR לשגיאות

טמפרטורה זמן Cycle(s)
95oC 2 דקות מחזור 1
95oC 20 s מחזורים
55oC 30 s
72oC 2 דקות
72oC 8 דקות מחזור 1
8oC . תחזיק

בטבלה 4. מומלץ PCR תוכנית להשגת השבר קאן

שינוי כדי למשל במקרה של rpt4 +
תבנית וקטורית pFA6a-3HA-KANMX6
וקטור מחייב רצף p7 ATTACGCTGCTCAGTGCTGA ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA
תלוי רצף p7 הרצף 50bp האחרון כולל את stop codon
תלוי רצף p8 הסדרה 50bp הראשונה מיד לאחר stop codon (רצף משלים) AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC
רצף p9 להתחיל מיד לאחר stop codon tgcacatatatccaaaaagccatgaa
רצף של p10 לייצר ~ שבר 500bp עם p9 (seqeucne משלימים) TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC

טבלה 5. השינויים הנדרשים כאשר המחסל ADH משמש במקום המחסל אנדוגני

טמפרטורה זמן Cycle(s)
95oC 2 דקות מחזור 1
95oC 20 s מחזורים
55oC 30 s
72oC 1 דקות
72oC 8 דקות מחזור 1
8oC . תחזיק

טבלה 6. מומלץ PCR תוכנית להשגת 3' UTR השבר

טמפרטורה זמן הרמפה Cycle(s)
94oC 2 דקות מחזור 1
94oC 20 s 10 מחזורים
70oC 1 s
55oC 30 s 0.1 oC/s
68oC 2:30 דקות 0.2 oC/s
94oC 20 s 5 מחזורים
70oC 1 s
55oC 30 s 0.1 oC/s
68oC 2:30 דקות 0.2 oC/s + s/מחזור 5
94oC 20 s 10 מחזורים
70oC 1 s
55oC 30 s 0.1 oC/s
68oC 2:30 דקות 0.2 oC/s + s/מחזור 20
72oC 10 דקות מחזור 1
8oC . תחזיק

טבלה מס ' 7. תוכנית מומלצת PCR פיוז'ן PCR

CBL1877 h + ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1:ade6

S1 טבלה: זן השתמשו במחקר זה


טבלה S2: רשימת תחל השתמשו במחקר זה

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מוטגנזה מכוונת אקראית באמצעות PCR לשגיאות הוא כלי רב עוצמה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות באזור נתון. טכניקה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים אשר מבקשים להעריך את הפונקציה של חלבון תחת נסיבות מסוימות. לדוגמה, במסמך זה השתמשנו PCR לשגיאות כדי להעריך את תפקוד 19 פרוטאוזום יחידה משנית, Rpt4, בתחזוקת הטרוכרומטין. על ידי שינוי האזור ממוקד על ידי ה-PCR לשגיאות, התאמת התנאים ההקרנה, הצלחנו להפוך למוטציות תאים על האזור גנומית של עניין המסך פנוטיפ הרצוי. לאחרונה, שיטה דומה שימשה כדי לבודד תאי שמרים ביקוע מחסה מוטציות בגן רכיב25גוף קוטב פלך.

היתרון המפתח של אקראי מוטגנזה מכוונת היא כי ייתכן להחיל אותה על גנים שאינם חיוניים והן חיוניות. מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים חיוניים תניב מוטציות מגוונים, כגון אלה בעלי פגמים פונקציונלי עדינים ו/או חלקי לאפשר תא הכדאיות להתקיים, או מוטציות פונקציות אשר מושפעים רק תחת תנאי ספציפי. דוגמה של האחרונים היא מוטציה הרגיש. מוטציות כאלה עשויים להיות מבודדים באמצעות 5 מ"ג/ליטר phloxine B, אשר כתמי תאים הגוסס באדום, מאפשר לתאים הגדלים לאט להיות מכובד למות תאים26.

השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא הצעד PCR מועדת לטעויות. בשלב זה, חשוב לשלוט תדר מוטציה אשר יכול להשתנות בהתאם את מספר מחזורי PCR ואת הסכום הראשוני של תבנית. אנו ממליצים כי המשתמש לתקן את מספר מחזורי PCR, משתנים הסכום הראשוני של תבנית, כפי שמצאנו שזה יהיה נוח יותר אסטרטגיה ואופטימיזציה. נציין כי הטכניקה של PCR לשגיאות כבר נרחב זמין במשך עשרות שנים. אם המשתמש בוחר, הם עשויים לחפש שיטה ידנית ביצוע PCR לשגיאות27 בלי באמצעות ערכת מוטגנזה מכוונת זמינים מסחרית.

כמו אזהרה, שיעור חיובי כוזב של פרוטוקול זה הוא גבוה למדי. לפיכך, מועמדים מוטציה צריך לעבור סדרה של הקרנות נועד לסנן את תוצאות חיוביות שגויות. מצאנו כי שיתוף השקטה של אתר ההגבלה בגן היעד יכול לעזור למנוע את הצורך נושא תוצאות חיוביות שגויות לשלב יחסית מפרך של רצף. זה חסכוני, המועמדים מוטנטים עשויים מספר מאות או אפילו מעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (2016R1A2B2006354).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Media
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
Yeast extract BD Biosciences 212720
L-Leucine JUNSEI 87070-0310
Adenine sulfate ACR 16363-0250
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
L-Histidine Sigma-Aldrich H8125
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl JUNSEI 19015-0350
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Potassium phthalate Sigma-Aldrich P6758-500g
Inositol Sigma-Aldrich I7508-50G
Biotin Sigma-Aldrich B4501-100MG
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 Sigma-Aldrich M7634-500G
ZnSO4•7H2O  JUNSEI 83060-031
FeCl2•4H2O KANTO CB8943686
Sodium molybdate dihydrate YAKURI 31621
KI JUNSEI 80090-0301
CuSO4•5H2O YAKURI 09605
D-myo-inositol MP biomedicals 102052
Pantothenate YAKURI 26003
Nicotinic Acid Sigma-Aldrich N4126-500G
(NH4)2SO4  Sigma-Aldrich A4418-100G
Agarose Biobasic D0012
G418, geneticin LPS G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aglient 600380 For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit Aglient 200500 For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F-530L For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase Takara RR001b For general PCR
BamH1 New England BioLabs R0136S
Xho1 New England BioLabs R0146S
Dpn1 New England BioLabs R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black VWR 89033-116 For replica
Replica-plating tool VWR 25395-380 For replica
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100  For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap Biorad 1652086  For fission yeast transformation
Thermal Cycler Bioer BYQ6078 For fusion PCR ramp reaction 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
  2. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  3. Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
  4. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  5. Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
  6. Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
  7. Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
  10. Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
  11. Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
  12. Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
  13. QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
  14. pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
  15. QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
  16. QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
  17. PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
  18. Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
  19. GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
  20. Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
  21. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  22. Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
  23. Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
  24. Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
  25. Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
  26. Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
  27. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).

Tags

גנטיקה גיליון 135 מוטגנזה מכוונת אקראי ביקוע שמרים הטרוכרומטין PCR לשגיאות צנטרומר גן מיקוד
גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted… More

Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast. J. Vis. Exp. (135), e57499, doi:10.3791/57499 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter