Summary
Denne protokol beskriver en nyetableret metode til virus levering til murine prostata. Bruger CRISPR/Cas9 teknologi, gen overekspression eller Cre recombinase levering, teknikken tillader orthotopic ændring af genekspression og implementerer en roman musemodel for prostatakræft.
Abstract
Med en stigende forekomst af prostatakræft er identifikation af nye tumor drivere eller modulatorer afgørende. Genetisk modificerede musemodeller (CLAUSS) for prostatakræft er hæmmet af tumor heterogenitet og dens komplekse mikroevolution dynamik. Traditionelle prostatakræft musemodeller omfatter blandt andet kønscelleoverførsel og betinget knockouts, transgene udtryk af onkogener og xenograft modeller. Generation af de novo mutationer i disse modeller er komplekse, tidskrævende og dyrt. Derudover målrette de fleste af traditionelle modeller størstedelen af prostata epitel, der henviser til, at menneskers prostatakræft er kendt for at udvikle sig som en isoleret hændelse i kun en lille delmængde af celler. Værdifulde modeller skal simulere prostatakræft indledning, men også progression til fremskreden sygdom.
Her beskriver vi en metode til at målrette et par celler i prostata epitel af transducing celler af virale partikler. Levering af en manipuleret virus til murine prostata tillader ændring af genekspression i prostata epitheler. Virustype og mængde vil hermed definerer antallet af målrettede celler for gen ændring ved transducing et par celler for kræft indledning og mange celler for genterapi. Gennem kirurgi-baserede injektion i den forreste lap, distale fra urin track kan tumor i denne model udvide uden forringer funktionen urin af dyret. Derudover ved at målrette kun en delmængde af prostata epitelceller teknikken muliggør klonal ekspansion af tumor, og derfor efterligner human tumor indledning samt progression og invasion gennem den basale membran.
Denne nye teknik giver en kraftfuld prostatakræft model med forbedret fysiologiske relevans. Dyrenes lidelser er begrænset, og da der kræves ingen yderligere avl, samlede animalske count er reduceret. På samme tid, er analyse af nye kandidat gener og veje accelereret, som igen er mere omkostningseffektiv.
Introduction
Påvisning og behandling af prostata cancer har væsentligt forbedret i det seneste årti. Stadig, stiger forekomsten af prostatakræft, efter levetid. Med en anslået 1,1 millioner nye tilfælde på verdensplan er det blandt de mest almindelige årsager til cancer-relaterede dødsfald i mænd 1. Prostatakræft er sen i sin udvikling, men når kræften har udviklet sig til en avanceret metastatisk tilstand, prognosen er dårlig på grund af begrænsede behandlingsmuligheder. Hidtil har kun et par gener er blevet identificeret som fælles drivere i denne kræft, og dens heterogenitet og multifocality hindrer påvisning af biomarkører og markedssegment sygdom drivere2,3.
Klassiske teknikker til at generere GEMMs er ofte hæmmes af deres kompleksitet, rettidig udgifter og omkostninger. Betinget knockout modeller har været udbredt at studere prostatakræft kandidat gener, der resulterer i embryonale dødelighed når inaktiveret i kønscelleoverførsel4. Mest almindelige modeller omfatter en prostata-specifikt Cre recombinase drevet af enten en modificeret Probasin5 eller en PSA6 promotor integreret i CLAUSS af yderligere krydsbestøvning. I disse modeller, vil være målrettet gen af interesse i de fleste af prostata epitelceller, generere hyperplasi i hele organ, som kan forringe dyrets urinveje funktion7.
Viral levering af Cre protein ved indsprøjtning i den forreste lap af murine prostata kan løse dette problem ved at målrette kun få celler8. Hensyntagen til laboratorier tekniske forudsætninger, ekspertise og mål, metode fordele fra en bred vifte af mulige variationer. Vellykkede tilgange udnytte Adenovirus rettet mod JunB og Yvonne_h_p9 eller Lentivirus målretning Yvonne_h_p og Trp5310 har været vist bl.a. Tilføje transgener, såsom luciferase, viral konstruktionen eller CLAUSS vil desuden gøre det non-invasiv overvågning af sygdomsprogression via bioluminescens imaging11.
Genom-redigering baseret på CRISPR/Cas9-teknologi afslører en ny og hurtig mulighed for at studere kræft gennem hurtige generation af somatiske knockouts12. Viral levering af enkelt guide RNA'er (sgRNAs) rettet mod den forreste lap af murine prostata etablerer en fysiologisk mere relevante model af prostatakræft. På denne måde, kan enkelt celler transporterer valgte mutationer danne kloner, der er i stand til ekspansion og invasion. Desuden vil brug af guide RNA'er for flere mål gener generere celle kloner med ændringer i forskellige gener. Dette vil tillade tumor heterogenitet og en naturlig udvælgelse pres på kræft progression, der kan afsløre betydningen af hvert gen ændring eller epistatic mekanismer.
Her vil vi præsentere en metode til at levere viruspartikler til murine prostata for ændring af genekspression. Ved en små abdominale snit, den murine forreste prostata lap er udsat og viruspartikler er sprøjtet ind i lap. Fem dage efter operationen, kirurgiske clips kan fjernes fra huden, og prostata kræft kan analyseres fra 8 uger efter. Samlet set er dette en hurtig og omkostningseffektiv procedure, som har ringe indflydelse på musen og giver mulighed for større tumor udvikle sig uden at gå på kompromis med musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol indebærer en kirurgisk procedure i laboratoriemus. Alle dyreforsøg skal være individuelt gennemgået og godkendt af en institutionel Animal Care og brug udvalg (IACUC). Metoden er baseret på animalsk opsving og overlevelse, sikre passende anæstesi, smertebehandling og en aseptisk kirurgisk miljø på hele tiden. Bruge en varmepude til at forhindre hypotermi under operation og indtil recovery fra anæstesi.
1. Start overvejelser
- Afhængigt af den virus, som benyttes, kan forskellige titer krav anvende; Fortynd virussen i overensstemmelse hermed.
Bemærk: I dette eksempel er et Adeno-associeret virus fortyndes i PBS injiceres på en titer på 1 x 1012 IU/mL. Virussen har serotype 9 og indeholder guide RNA til PT og udtryk for Cre protein under en ubiquitin promotor (figur 1). Tab af Yvonne_h_p øget pAKT og spredning af prostata epitel13. - Brug mandlige mus i en alder af 8 uger på tidspunktet for kirurgi til at sikre passende prostata udvikling.
Bemærk: Mus vist i dette eksperiment er Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin mus på C57BL/6J baggrund12 (figur 1). - Frisk udarbejde en generel anæstesi mix og om muligt holde det sterilt.
Bemærk: For bedre animalske recovery efter operationen, modgift anæstesi er stærkt anbefales.- For at forberede en samlet maengde paa 5 mL bedøvelsesmiddel, mix 0,15 mL medetomidine hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) og 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) med 4,2 mL sterilt saltvand.
Bemærk: Alternative anæstesi metoder, såsom inhalerbar isofluran, kan anvendes ifølge retningslinjerne for institutionel pasning af dyr. - For at vende effekten af medetomidine hydrochlorid efter operationen, bland 0,1 mL Atipamezol (5 mg/mL) med 4,9 mL sterilt saltvand.
- For at forberede en samlet maengde paa 5 mL bedøvelsesmiddel, mix 0,15 mL medetomidine hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL midazolam (5 mg/mL) og 0,25 mL butorphanol (10 mg/mL) med 4,2 mL sterilt saltvand.
- Forberede en aseptisk kirurgisk miljø af ordentlig desinfektion og sterilisation. Autoklave kirurgiske instrumenter før brug.
2. virus-levering til Murine prostata
- Bedøver dyret ved intraperitoneal injektion med en steril 1 mL sprøjte og en 27G x ½" nål. Bruge en anæstesi dosis 0,01 mL/g kropsvægt. Hvis proceduren, der varer længere end 30 min, opretholde anæstesi ved at indsprøjte 1/3 af start dosis hvert 30 min.
- Undersøge den bedøvende dybde ved at vurdere muskelafslapning, pedal tilbagetrækning og øjenlågenes reflekser. Når tab af reflekser er observeret, barbere den nedre del af maven af dyret.
- Omhyggeligt dæk dyrets øjne med veterinære oftalmologiske salve ved hjælp af en steril vatpind til at forebygge blindhed skyldes manglende cornea refleks.
- Tør den barberede underliv med 70% ethanol og 10% povidon-jod til at desinficere kirurgiske område. Krat det kirurgiske område fra midten af det kirurgiske område mod periferien.
- Udføre en lodret hud indsnit på lav-abdominal midterlinjen af ca. 1 cm ved hjælp af en steril kirurgiske saks.
- Løft bughinden ved hjælp af en fin spids pincet til at forebygge skader de organer, der lægger nedenunder. Omhyggeligt gøre et < 8 mm snit ved hjælp af kirurgiske saks gennem bughinden.
Bemærk: I modsætning til menneskelige, en gnaver prostata består af fire separate kamre. Den anteriore lap er knyttet til sædblæren. - Forsigtigt flytte fedtvæv til side for at afdække sædblæren. Ved hjælp af en ring pincet, løft forsigtigt sædblæren indtil den forreste prostata kan være identificeret (figur 1).
- Indsprøjtes en samlet maengde paa 30 µL virus (3 x 1010 viruspartikler) løsning i den forreste prostata epitel ved hjælp af en 0,5 mL insulin sprøjte med en 30G x 8 mm kanyle. Minimere udsivning og sikre væsken absorberes i væv, danner en lille boble. Placer sædblæren tilbage i bughulen.
- Sutur bughinden med 2-3 simple afbrudt sting ved hjælp af 6-0 resorberbare suturer med en 13 mm, 3/8 cirkel og taper punkt nål.
- Hæft huden med 3 sterile 4,8 x 6,5 mm klip løft huden med pincet til at undgå at beskadige bughinden.
- Bedre inddrivelse, anvende anæstesi modgift i en dosis på 0,01 mL/g kropsvægt ved intraperitoneal injektion ved hjælp af en steril 1 mL sprøjte og en 27G x ½" nål. Omhyggeligt placere den animalske tilbage i sit bur.
3. post-kirurgi procedurer
- Holde buret med mus, der blev opereret på en varmepude til 1 time efter proceduren, at forhindre hypotermi indtil fuldt tilbagebetalt. Hvis modgift anvendes, skal dyret være vågen et par minutter efter injektion.
- Overvåge dyrene dagligt til passende sår healing og smerte indikationer. Hvis det er nødvendigt, administrere ekstra smertestillende medicin efter institutionelle dyrs pleje retningslinjer.
- Fjern hud klip efter 4-5 dage, når såret er lukket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere virus levering til murine prostata, blev prøver analyseret tre måneder efter operationen. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP mus12 udtryk for normal god landbrugspraksis i celler, der har været udsat for Cre protein udtrykt af virus. De prostata prøver blev undersøgt med en Fluorescens mikroskopi til at identificere områder med normal god landbrugspraksis signal (figur 2A). Normal god landbrugspraksis signal angiver Cre aktivitet i prostata epitel, men ikke om gen redigering er blevet induceret af CRISPR guide. Immunhistokemiske sektioner viste fokale områder af celler med højt udtryk af pAKT (figur 2B), som angiver tab af Yvonne_h_p13. En immunofluorescens Co-farvning af pAKT og normal god landbrugspraksis identificeret dobbelt positive celler (figur 2 c). Dette bekræftede omdannelsen af prostata celler af de Adeno-associeret virus. Samlet, disse resultater viser, at in vivo CRISPR/Cas9 gen redigering kan udføres i prostata epitel ved hjælp af Adeno-associeret virus og Rosa26-LSL-Cas9-EGFP musen.
Fig. 1: Illustration af fremgangsmåden. Proceduren er udført i Rosa26-LSL-Cas9-EGFP musen genereret af Platt et al. 12 den forreste prostata (AP) er knyttet til sædblæren (SV). Viruspartikler udtrykker guide RNA og en Cre protein injiceres i den forreste prostata til at ændre genekspression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: gen ændring i murine prostata gennem orthotopic virus levering. 7 uger gamle mandlige Rosa26-LSL-Cas9-EGFP mus blev sprøjtet med Adeno-associeret virus som indeholder et guide RNA for PT og koder for et protein, der Cre. Prøverne blev analyseret 3 måneder efter virus injektion. (A) NGL fluorescens billeddannelse af anterior prostata. (B) histologiske sektion (4 µm) farvet for pAKT (brun) markerer det klonede område med tab af Yvonne_h_p udtryk. Boksen stiplet markerer den høj forstørrelse gemt. (C) immunofluorescens farvning for normal god landbrugspraksis (grøn) og pAKT (rød). Nukleare syrer var plettet med DAPI. Venstre: farvning af ikke-indsprøjtning anteriore lap viser ingen signal for normal god landbrugspraksis eller pAKT. Højre: farvning af den injicerede lap viser Co lokalisering af normal god landbrugspraksis (cytoplasmatisk farvning) og pAKT (cellemembranen lokalisering). (D) PTflox/flox musene injiceret med Cre-udtrykker Adenovirus. H & E farvning af en histologiske sektion (4 µm) af den anteriore lap 6 måneder efter virus levering. Punkteret ellipse markerer området af high grade prostata intraepitelialneoplasi. For nærmere oplysninger se reference 9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi en metode til at ændre genekspression i den forreste lap af murine prostata af virus injektion, at skabe en kraftfuld ny musemodel for prostatakræft (figur 2). Succesfuld administration af en Adenovirus blev første gang beskrevet af dishtvserver et al. 20058. Vi har tidligere vist, hvordan en Adenovirus kodning for en Cre recombinase protein kan erstatte tidskrævende krydsning af en Cre allel for væv-specifikke sletning 9 (figur 2D). Da virus inficerer et par celler9, denne model efterligner det menneskelige scenario af klonal ekspansion14,15 og er optimal for kræft undersøgelser (figur 2B).
Opdagelsen af CRISPR/Cas9 teknologi har åbnet nye muligheder for i vivo gen redigering. Det er nu muligt at ændre flere gener samtidig, giver en yderst værdifuld teknik for denne heterogenic kræft i en både omkostningsbesparende og tid-effektive måde. Forskning ved hjælp af dyremodeller nyder godt af fordelen, at generere gen ændringer, ikke kun i germline, men også i voksent væv. Endvidere giver udvikling af Cas9 udtrykker mus viral levering af både Cre og sgRNAs (figur 1). Som guider har ingen indflydelse på genom uden Cas9 udtryk, er arbejde med denne virus ufarligt.
Adeno-associeret virus fremkalde meget lav immunrespons, og selv om nuværende for op til et år, virus kan ikke integreres i vært genom, som gør det hensigtsmæssigt for i vivo knockout undersøgelser16. I denne forbindelse skal det bemærkes, at forskellige serotyper kan påvirke transduktion effektivitet i forskellige vævstyper. Optimering for de målrettede væv er derfor afgørende for at opnå høj effektivitet. Ved hjælp af genom-integrere Lentivirus kan på den anden side tillade langsigtede onkogen udtryk10.
Menneskelig prostata er ikke adskilt i forskellige lapper og det har været diskuteret, hvilken af de murine prostata lapper bedste repræsenterer den menneskelige prostata. Mens den laterale lap blev foreslået, har vist sig ingen signifikant forskel mellem de forskellige kamre med hensyn til tumor indledning9,17,18,19. Et andet afgørende aspekt af virus levering er den mulige infektion i andre celler i kroppen. Vi har observeret prostata stroma celler, der har været transduced. Risikoen kan minimeres under orthotopic levering procedure, at undgå blodkar og forhindrer lækage samtidig indsprøjtning. Yderligere kunne virus design herunder en prostata specifikke promotor, såsom Probasin promotor og serotype, øge celle-specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Hr. blev finansieret af et stipendium fra Kræftens Bekæmpelse (R146-A9394-16-S2). MFB og MKT blev finansieret af AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Hr. og MFB var medfi nansieret af Graduate School, sundhed, AU. E.F.W. laboratorium understøttes af tilskud fra det spanske ministerium for økonomi (SAF2015-70857, medfinansieres af EFRU-EU) og en ERC advanced grant (741888 - CSI-sjov).
Vi vil gerne takke Liliana Fajardo Mellor (gener, udvikling og sygdom; National Cancer Research Center) for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
