Summary
इस प्रोटोकॉल murine प्रोस्टेट के लिए वायरस के वितरण के लिए एक नव स्थापित विधि का वर्णन । या तो CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी, जीन एक्सप्रेस, या Cre recombinase वितरण का प्रयोग, तकनीक जीन अभिव्यक्ति के orthotopic परिवर्तन की अनुमति देता है और प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक उपंयास माउस मॉडल लागू करता है ।
Abstract
प्रोस्टेट कैंसर की बढ़ती घटनाओं के साथ, नए ट्यूमर ड्राइवरों या मॉडुलन की पहचान महत्वपूर्ण है । आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (प्रोस्टेट कैंसर के लिए GEMM) ट्यूमर विविधता और उसके जटिल microevolution गतिशीलता से प्रभावित कर रहे हैं । पारंपरिक प्रोस्टेट कैंसर माउस मॉडल शामिल हैं, दूसरों के बीच, germline और सशर्त नॉकआउट, oncogenes की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, और xenograft मॉडल । इन मॉडलों में de नोवो उत्परिवर्तनों की पीढ़ी, जटिल समय लेने वाली है, और महंगा है । इसके अलावा, पारंपरिक मॉडलों के अधिकांश प्रोस्टेट उपकला के बहुमत लक्ष्य, जबकि मानव प्रोस्टेट कैंसर अच्छी तरह से केवल कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट में एक अलग घटना के रूप में विकसित करने के लिए जाना जाता है. मूल्यवान मॉडल न केवल प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा अनुकरण करने की आवश्यकता है, लेकिन यह भी उन्नत रोग के लिए प्रगति.
यहाँ हम वायरल कणों द्वारा transducing कोशिकाओं द्वारा प्रोस्टेट उपकला में कुछ कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक विधि का वर्णन. murine प्रोस्टेट के लिए एक इंजीनियर वायरस के वितरण प्रोस्टेट epithelia में जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन की अनुमति देता है । वायरस के प्रकार और मात्रा इसके द्वारा जीन परिवर्तन के लिए लक्षित कोशिकाओं की संख्या को transducing कैंसर दीक्षा और जीन थेरेपी के लिए कई कोशिकाओं के लिए कुछ कोशिकाओं को परिभाषित करेगा । पूर्वकाल पालि में सर्जरी आधारित इंजेक्शन के माध्यम से, मूत्र ट्रैक से बाहर, इस मॉडल में ट्यूमर जानवर के मूत्र समारोह बिगड़ने के बिना विस्तार कर सकते हैं । इसके अलावा, केवल प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं तकनीक का एक सबसेट लक्ष्यीकरण द्वारा ट्यूमर के क्लोनल विस्तार सक्षम बनाता है, और इसलिए मानव ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, साथ ही साथ बेसल झिल्ली के माध्यम से आक्रमण की नकल ।
यह उपंयास तकनीक बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता के साथ एक शक्तिशाली प्रोस्टेट कैंसर मॉडल प्रदान करता है । पशु पीड़ित सीमित है, और के बाद से कोई अतिरिक्त प्रजनन की आवश्यकता है, समग्र पशु गिनती कम है । एक ही समय में, नए उंमीदवार जीन और रास्ते के विश्लेषण में तेजी आई है, जो बारी में अधिक लागत कुशल है ।
Introduction
पता लगाने और प्रोस्टेट कैंसर के उपचार में काफी पिछले दशक में सुधार हुआ है । फिर भी, प्रोस्टेट कैंसर की घटना बढ़ रही है, जीवन प्रत्याशा के बाद । एक अनुमान के साथ १,१००,००० नए मामलों दुनिया भर में, यह कैंसर के सबसे आम कारणों में से है पुरुषों में मौत से संबंधित 1। प्रोस्टेट कैंसर के विकास में धीमी है, लेकिन जब कैंसर एक उंनत मेटास्टेटिक राज्य में प्रगति की है, रोग का निदान सीमित उपचार के विकल्प के कारण गरीब है । अब तक, केवल कुछ जीन इस कैंसर में आम ड्राइवरों के रूप में पहचान की गई है, और इसकी विविधता और multifocality में बाधा उत्पंन कर रहे है और मार्क्स का पता लगाने के लिए लक्षित रोग ड्राइवरों2,3।
GEMMs पैदा करने की शास्त्रीय तकनीक अक्सर उनकी जटिलता, समय पर खर्च, और लागत से ख़राब कर रहे हैं । सशर्त नॉकआउट मॉडल व्यापक रूप से प्रोस्टेट कैंसर उंमीदवार जीन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, भ्रूण घातकता में परिणाम है कि जब germline में निष्क्रिय4। सबसे आम मॉडल एक प्रोस्टेट विशेष Cre या तो एक संशोधित बेसिन5 या एक पीएसए6 प्रमोटर अतिरिक्त पार से GEMM में एकीकृत द्वारा संचालित recombinase शामिल प्रजनन । इन मॉडलों में, ब्याज की जीन प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं के बहुमत में लक्षित किया जाएगा, पूरे अंग में हाइपरप्लासिया पैदा कर रहा है, जो जानवरों के मूत्र पथ समारोह7ख़राब हो सकता है.
murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि में इंजेक्शन द्वारा Cre प्रोटीन का वायरल वितरण केवल कुछ कोशिकाओं को लक्षित करके इस समस्या को हल कर सकते हैं8. प्रयोगशालाओं तकनीकी पूर्वापेक्षाएं, विशेषज्ञता, और उद्देश्यों को ध्यान में रखते हुए, विधि लाभ संभव विविधताओं की एक विस्तृत श्रृंखला से । सफल एडीनोवायरस लक्ष्यीकरण JunB और Pten9 या Lentivirus लक्ष्यीकरण Pten और Trp5310 के उपयोग के दृष्टिकोण दूसरों के बीच दिखाया गया है । transgenes जोड़ने, इस तरह के luciferase के रूप में वायरल का निर्माण करने के लिए या GEMM इसके अलावा bioluminescence इमेजिंग के माध्यम से रोग प्रगति के गैर इनवेसिव निगरानी सक्षम हो जाएगा11.
जीनोम CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के आधार पर संपादन एक नया और तेजी से दैहिक पीटकर12के तेजी से उत्पादन के माध्यम से कैंसर का अध्ययन करने का अवसर पता चलता है । murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि के लिए निर्देशित एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के वायरल प्रसव प्रोस्टेट कैंसर के एक शारीरिक रूप से अधिक प्रासंगिक मॉडल स्थापित करता है । इस तरह से, एकल कोशिकाओं को चुना उत्परिवर्तनों ले जा क्लोन है कि विस्तार और आक्रमण में सक्षम है फार्म कर सकते हैं । इसके अलावा, कई लक्ष्य जीन के लिए गाइड RNAs का उपयोग अलग जीन में परिवर्तन के साथ सेल क्लोन उत्पंन करेगा । यह ट्यूमर विविधता और कैंसर प्रगति, जो प्रत्येक जीन परिवर्तन या epistatic तंत्र के महत्व को प्रकट कर सकते है पर एक प्राकृतिक चयन दबाव की अनुमति होगी ।
यहां हम जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन के लिए murine प्रोस्टेट को वायरल कणों देने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । एक छोटे से उदर चीरा द्वारा, murine पूर्वकाल प्रोस्टेट पालि उजागर और वायरल कणों पालि में इंजेक्ट कर रहे हैं । पांच दिनों के बाद सर्जरी, सर्जिकल क्लिप त्वचा से हटाया जा सकता है और प्रोस्टेट कैंसर से 8 सप्ताह के बाद विश्लेषण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, यह एक तेजी से और लागत कुशल प्रक्रिया है, जो माउस पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है और बड़ा ट्यूमर माउस समझौता किए बिना विकसित करने की अनुमति देता है ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों में एक शल्य प्रक्रिया शामिल है । सभी पशु प्रयोगों को एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा व्यक्तिगत रूप से समीक्षा और अनुमोदित किया जाना चाहिए । दृष्टिकोण के रूप में पशु वसूली और अस्तित्व पर आधारित है, उचित संज्ञाहरण, दर्द प्रबंधन, और हर समय एक अपूतित सर्जिकल वातावरण सुनिश्चित करते हैं । सर्जरी के दौरान और संज्ञाहरण से वसूली तक हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक हीटिंग पैड का प्रयोग करें ।
1. विचार शुरू
- इस्तेमाल किया वायरस के आधार पर, विभिन्न titer आवश्यकताओं लागू हो सकता है; तदनुसार वायरस पतला ।
नोट: इस उदाहरण में, पंजाब में Adeno-संबद्ध वायरस को 1 x 1012 IU/एमएल के titer पर इंजेक्ट कर रहा है । वायरस 9 सीरोटाइप है और एक ubiquitin मोटर (चित्रा 1) के तहत Pten और Cre प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए गाइड शाही सेना शामिल है । Pten की हानि में वृद्धि हुई pAKT और प्रोस्टेटिक उपकला के प्रसार13. - पर्याप्त प्रोस्टेट विकास सुनिश्चित करने के लिए शल्य चिकित्सा के समय 8 सप्ताह की आयु में पुरुष चूहों का प्रयोग करें ।
नोट: चूहों इस प्रयोग में दिखाया गया है Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin चूहों पर C57BL/6J पृष्ठभूमि12 (चित्रा 1). - हौसले से एक सामान्य संज्ञाहरण मिश्रण तैयार है और यदि संभव हो तो यह बाँझ रखना.
नोट: सर्जरी के बाद बेहतर पशु वसूली के लिए, एक संज्ञाहरण मारक अत्यधिक की सिफारिश की है ।- 5 मिलीलीटर संवेदनाहारी की कुल मात्रा तैयार करने के लिए, ०.१५ मिलीलीटर medetomidine हाइडरोक्लॉराइड (1 mg/एमएल), ०.४ एमएल मिदाजोलम (5 मिलीग्राम/एमएल), और ०.२५ एमएल butorphanol (10 मिलीग्राम/एमएल) के साथ ४.२ मिलीलीटर बाँझ खारा पानी मिलाएं ।
नोट: वैकल्पिक संज्ञाहरण तरीकों, ऐसे सांस isoflurane के रूप में, संस्थागत पशु देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है । - medetomidine हाइडरोक्लॉराइड पोस्ट सर्जरी के प्रभाव को रिवर्स करने के लिए, ४.९ मिलीलीटर बाँझ खारा पानी के साथ ०.१ मिलीलीटर atipamezole (5 मिलीग्राम/एमएल) मिश्रण ।
- 5 मिलीलीटर संवेदनाहारी की कुल मात्रा तैयार करने के लिए, ०.१५ मिलीलीटर medetomidine हाइडरोक्लॉराइड (1 mg/एमएल), ०.४ एमएल मिदाजोलम (5 मिलीग्राम/एमएल), और ०.२५ एमएल butorphanol (10 मिलीग्राम/एमएल) के साथ ४.२ मिलीलीटर बाँझ खारा पानी मिलाएं ।
- उचित संक्रमण और बंध्याकरण द्वारा एक अपूतित शल्य चिकित्सा वातावरण तैयार करते हैं । उपयोग करने से पहले आटोक्लेव सर्जिकल उपकरणों ।
2. Murine प्रोस्टेट को वायरस डिलिवरी
- एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 27G एक्स ½ सुई "के साथ intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा पशु Anesthetize. ०.०१ मिलीलीटर/जी शरीर के वजन के एक संज्ञाहरण खुराक का प्रयोग करें । प्रक्रिया 30 मिनट से अधिक समय तक रहता है, तो हर 30 मिनट शुरू खुराक के 1/3 इंजेक्शन द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखने के.
- मांसपेशी छूट, पैडल वापसी, और palpebral सजगता का आकलन करके संवेदनाहारी गहराई की जांच करें । जब सजगता के नुकसान मनाया जाता है, जानवर के निचले पेट दाढ़ी ।
- ध्यान से पशु की आंखों पशु चिकित्सा नेत्र एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए corneal पलटा की कमी के कारण अंधापन को रोकने के मरहम के साथ कवर ।
- ७०% इथेनॉल और 10% povidone आयोडीन के साथ मुंडा पेट पोंछ शल्य क्षेत्र को संक्रमित करने के लिए । परिधि की ओर शल्य क्षेत्र के केंद्र से सर्जिकल क्षेत्र साफ़ ।
- लगभग 1 सेमी की कम पेट midline पर एक ऊर्ध्वाधर त्वचा चीरा एक बाँझ शल्य कैंची का उपयोग कर प्रदर्शन.
- एक ठीक बिंदु संदंश का उपयोग करने के लिए अंगों है कि नीचे बिछाने रहे है हानिकारक को रोकने के लिए ऊपर उठा । ध्यान से एक < 8 mm चीरा के माध्यम से शल्य कैंची का उपयोग कर ।
नोट: मानव के विपरीत, एक चूहे की प्रोस्टेट ग्रंथि चार अलग पालियों शामिल है । पूर्वकाल पालि प्राथमिक पुटिका से जुड़ा हुआ है । - धीरे वसा ऊतक एक तरफ ले जाने के लिए लाभदायक पुटिका उजागर । एक अंगूठी संदंश का प्रयोग, ध्यान से ऊपर लाभदायक पुटिका उठा जब तक पूर्वकाल प्रोस्टेट (चित्रा 1) की पहचान की जा सकती है ।
- एक 30G एक्स 8 मिमी सुई के साथ एक ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर पूर्वकाल प्रोस्टेट उपकला में 30 µ एल वायरस (3 एक्स 1010 वायरल कणों) का एक कुल मात्रा इंजेक्षन. रिसाव को कम करने और सुनिश्चित करें कि द्रव ऊतक के भीतर अवशोषित कर लेता है, एक छोटा सा बुलबुला बनाने. उदर गुहा में प्राथमिक पुटिका वापस प्लेस ।
- एक 13 मिमी, 3/8 सर्कल, और एक शंकु बिंदु सुई के साथ 6-0 अवशोषित टांके का उपयोग कर 2-3 सरल बाधित टांके के साथ योनि टांका ।
- स्टेपल त्वचा के साथ 3 बाँझ ४.८ x ६.५ mm संदंश के साथ त्वचा उठाने क्लिप्स को संक्रमण से बचने के लिए ।
- बेहतर वसूली के लिए, एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 27G एक्स ½ "सुई का उपयोग intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा ०.०१ मिलीलीटर/जी शरीर के वजन की एक खुराक में संज्ञाहरण मारक लागू होते हैं । ध्यान से जानवर अपने पिंजरे में वापस जगह है ।
3. सर्जरी के बाद की प्रक्रिया
- चूहों कि प्रक्रिया के बाद 1 ज के लिए एक हीटिंग पैड पर सर्जरी से गुजरा के साथ पिंजरे रखो, हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए पूरी तरह से बरामद जब तक । अगर मारकर आवेदन किया जाए तो इंजेक्शन लगाने के कुछ ही मिनटों बाद पशु को जगाए रखना चाहिए ।
- उचित घाव भरने और दर्द संकेत के लिए दैनिक जानवरों की निगरानी । यदि आवश्यक हो, संस्थागत पशु देखभाल दिशा निर्देशों के अनुसार अतिरिक्त दर्द हत्यारों प्रशासन ।
- 4-5 दिनों के बाद त्वचा क्लिप्स निकालें, एक बार घाव बंद कर दिया है ।
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Representative Results
murine प्रोस्टेट को वायरस डिलीवरी का आकलन करने के लिए, नमूनों की सर्जरी के तीन महीने बाद विश्लेषण किया गया । Rosa26-LSL-Cas9-EGFP चूहों की कोशिकाओं में१२ व्यक्त GFP जो विषाणु द्वारा व्यक्त Cre प्रोटीन से अवगत कराया गया है. प्रोस्टेट के नमूनों को GFP सिग्नल (चित्र 2a) के साथ क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की गई । GFP संकेत प्रोस्टेट उपकला में Cre गतिविधि इंगित करता है, लेकिन नहीं है कि जीन संपादन CRISPR गाइड द्वारा प्रेरित किया गया है. Immunohistochemical वर्गों की उच्च अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के फोकल क्षेत्रों में दिखाया pAKT (चित्रा बी1), Ptenके नुकसान का संकेत13. pAKT और GFP की एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस सह दाग दोहरे सकारात्मक कोशिकाओं (चित्रा 2c) की पहचान की । यह Adeno-जुड़े वायरस द्वारा स्थिर कोशिकाओं के परिवर्तन की पुष्टि की । कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि vivo CRISPR/Cas9 जीन संपादन में Adeno-जुड़े वायरस और Rosa26-LSL-Cas9-EGFP माउस का उपयोग करके प्रोस्टेट उपकला में किया जा सकता है ।
चित्र 1: प्रक्रिया का चित्रण. प्रक्रिया Rosa26-LSL-Cas9-EGFP एमेंडमेंट एट अल द्वारा उत्पंन माउस में किया जाता है । 12 पूर्वकाल प्रोस्टेट (एपी) लाभदायक पुटिका (एसवी) से जुड़ा हुआ है । विषाणु गाइड आरएनए व्यक्त कणों और एक Cre प्रोटीन पूर्वकाल प्रोस्टेट में इंजेक्शन के लिए जीन अभिव्यक्ति बदल रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: orthotopic वायरस डिलिवरी के माध्यम से murine प्रोस्टेट में जीन परिवर्तन । 7 सप्ताह पुराने पुरुष Rosa26-LSL-Cas9-EGFP चूहों Adeno के लिए एक गाइड आरएनए युक्त वायरस के साथ इंजेक्शन थे Pten और एक Cre प्रोटीन के लिए कोडिंग. नमूने वायरस इंजेक्शन के बाद 3 महीने विश्लेषण किया गया । (क) पूर्वकालिक प्रोस्टेट की GFP प्रतिदीप्ति इमेजिंग. (ख) ऊतकवैज्ञानिक खंड (४ µm) सना के लिए pAKT (ब्राउन) Pten अभिव्यक्ति की हानि के साथ क्लोनर क्षेत्र को चिह्नित करता है. डैश्ड बॉक्स उच्च आवर्धन दायर चिह्नित करता है । (ग) GFP (green) और pAKT (red) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग । परमाणु एसिड DAPI के साथ दाग थे । वाम: गैर के धुंधला-पूर्वकाल GFP या pAKT के लिए कोई संकेत नहीं दिखा पालि इंजेक्शन । सही: GFP के सह स्थानीयकरण (cytoplasmic धुंधला) और pAKT (कोशिका झिल्ली स्थानीयकरण) दिखा इंजेक्शन पालि के धुंधला । (D) Ptenflox/flox चूहों ने Cre-व्यक्त एडीनोवायरस के साथ इंजेक्शन लगाया. एच एंड ई पूर्वकाल पालि के एक ऊतकवैज्ञानिक खंड (4 µm) के दाग वायरस प्रसव के बाद 6 महीने । डॉटेड दीर्घवृत्त उच्च ग्रेड प्रोस्टेटिक intraepithelial neoplasia के क्षेत्र को चिह्नित करता है । विवरण के लिए 9संदर्भ देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए वायरस इंजेक्शन द्वारा murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक शक्तिशाली नए माउस मॉडल बनाने (चित्रा 2) । एक एडीनोवायरस के सफल प्रशासन पहले Leow एट अल द्वारा २००५8में वर्णित किया गया था । हमने पहले दिखाया है कि कैसे एक Cre recombinase प्रोटीन के लिए एक एडीनोवायरस कोडन समय लेने वाली पार-ऊतक विशिष्ट विलोपन के लिए एक Cre एलील के प्रजनन 9 (चित्रा 2d) की जगह ले सकता है । चूंकि वायरस कुछ कोशिकाओं को संक्रमित9, इस मॉडल क्लोनी विस्तार के मानव परिदृश्य14,15 नकल और कैंसर के अध्ययन के लिए इष्टतम है (आंकड़ा 2 बी) ।
CRISPR/Cas9 टेक्नोलॉजी की खोज ने वीवो जीन एडिटिंग में नए अवसर खोले हैं । अब यह एक साथ कई जीन को बदलने के लिए संभव है, एक दोनों लागत में बचत और समय कुशल तरीके से इस heterogenic कैंसर के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान तकनीक प्रदान । germline में न केवल जीन परिवर्तन पैदा करने के लाभ से पशु मॉडल लाभ का उपयोग कर अनुसंधान, लेकिन यह भी वयस्क ऊतकों में. इसके अलावा, Cas9 एक्सप्रेस चूहों के विकास दोनों Cre और sgRNAs (चित्रा 1) के वायरल वितरण की अनुमति देता है । के रूप में गाइड Cas9 अभिव्यक्ति के बिना जीनोम पर कोई प्रभाव नहीं है, इस वायरस के साथ काम गैर खतरनाक है ।
Adeno-जुड़े वायरस बहुत कम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित, और यहां तक कि एक साल तक के लिए मौजूद है, वायरस मेजबान जीनोम, जो यह बेहतर करने के लिए बनाता है में एकीकृत नहीं है vivo नॉकआउट अध्ययन16 में । इस संदर्भ में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिन्न serotypes अलग ऊतक प्रकार में transduction दक्षता प्रभाव हो सकता है. इसलिए, लक्षित ऊतक के लिए अनुकूलन उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरे हाथ पर जीनोम-घालमेल Lentivirus का उपयोग कर सकते है दीर्घकालिक oncogene अभिव्यक्ति10अनुमति देते हैं ।
मानव प्रोस्टेट अलग पालियों में अलग नहीं है और यह murine प्रोस्टेट पालियों के जो सबसे अच्छा मानव प्रोस्टेट का प्रतिनिधित्व करता है चर्चा की गई है । पार्श्व पालि का प्रस्ताव किया गया था, जबकि ट्यूमर दीक्षा9,17,18,19के संबंध में अलग पालियों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया गया है । वायरस के वितरण का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू शरीर में अंय कोशिकाओं के संभावित संक्रमण है । हम प्रोस्टेट स्ट्रोमा कोशिकाओं है कि transduced किया गया है मनाया । जोखिम orthotopic वितरण प्रक्रिया के दौरान कम किया जा सकता है, रक्त वाहिकाओं से परहेज और इंजेक्शन के दौरान रिसाव को रोकने. इसके अलावा एक प्रोस्टेट विशेष प्रवर्तक, जैसे कि बेसिन प्रवर्तक और सीरोटाइप के रूप में, कोशिका-विशिष्टता को बढ़ा सकता है सहित वायरस डिजाइन ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
श्री डेनिश कैंसर सोसायटी (R146-A9394-16-S2) से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । MFB और मार्केट AUFF नोवा (AUFF-E-२०१५-एफ़एलएस-9-8) द्वारा वित्त पोषित किया गया । श्री और MFB स्नातक स्कूल, स्वास्थ्य, AU द्वारा सह वित्त पोषित किया गया । E.F.W. प्रयोगशाला से अनुदान द्वारा समर्थित है स्पेनी अर्थव्यवस्था के मंत्रालय (SAF2015-70857, सह ERDF द्वारा वित्त पोषित-यूरोपीय संघ) और एक ईआरसी उंनत अनुदान (७४१८८८-सीएसआई-मज़ा) ।
हम Liliana Fajardo Mellor (जीन, विकास और रोग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; राष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान केंद्र) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
References
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