Summary
In vitro gebruik van degeneratieve tenocytes is essentieel bij het onderzoeken van de doeltreffendheid van nieuwe behandeling van tendinopathie. Echter de meeste onderzoeken gebruiken alleen het dierlijk model of een gezonde tenocyte. Wij stellen het volgende protocol om te isoleren van de menselijke degeneratieve tenocytes tijdens de operatie.
Abstract
Tendinopathie, een pijnlijke aandoening die zich in reactie op de degeneratie van de pees ontwikkelt, is op de stijging in de ontwikkelde wereld als gevolg van toenemende lichamelijke activiteit en de langere levensverwachting. Ondanks de toenemende prevalentie, de onderliggende pathogenese is nog steeds onduidelijk en behandeling is over het algemeen symptomatisch. Onlangs, talrijke therapeutische opties, en factoren die de groei, stamcellen, gentherapie, werden onderzocht in de hoop op verbetering van de helende kracht van de degeneratieve pees. De meeste van deze studies werden echter uitgevoerd alleen op dierlijke modellen of gezonde menselijke tenocytes. Ondanks sommige studies met behulp van pathologische tenocytes, tot de beste van onze kennis is er momenteel geen protocol met een beschrijving van het verkrijgen van menselijke degeneratieve tenocytes. Het doel van deze studie is om te beschrijven een standaardprotocol voor het verkrijgen van menselijke degeneratieve tenocytes. Aanvankelijk was het weefsel van de pees van een patiënt met laterale epikondylitis geoogst tijdens de operatie. Vervolgens werden biopsie monsters genomen uit de extensor carpi radialis brevis pees overeenkomt met structurele veranderingen waargenomen ten tijde van de operatie. Alle van de geoogste pezen bleek te zijn saaie, grijze, brokkelige, en edematous, waardoor ze visueel onderscheiden van de gezonde ones. Tenocytes werden gekweekt en gebruikt voor experimenten. Ondertussen, de helft van de geoogste weefsels histologisch werden geanalyseerd, en werd aangetoond dat zij dezelfde sleutel functies van tendinopathie (angiofibroblastic dysplasie of hyperplasie deelden). Een secundaire analyse door immunocytochemie bevestigd dat de gekweekte cellen waren tenocytes met de meerderheid van de cellen met positieve vlekken voor mohawk en tenomodulin eiwitten. De kwaliteiten van de degeneratieve aard van tenocytes werden vervolgens vastgesteld door vergelijking van de cellen met de gezonde controle met behulp van een proliferatie assay of qRT-PCR. De degeneratieve tenocyte weergegeven een hoger tarief van proliferatie en soortgelijk gen expressiepatronen van tendinopathie die overeenkomen met eerdere verslagen. Dit nieuwe protocol kan over het algemeen een nuttig instrument bieden voor toekomstige studies van tendinopathie.
Introduction
Tendinopathie is een chronische degeneratieve musculoskeletal aandoening die ontwikkelt zich in verschillende delen van het lichaam. Onlangs, heeft het aantal gevallen van tendinopathie sterk toegenomen in de ontwikkelde wereld als gevolg van groeiende deelname aan recreatieve sporten en toegenomen levensverwachting1,2. De oorzaak van tendinopathie wordt beschouwd als multifactoriële en deze oorzaken omvatten ischemie, zuurstof vrije radicalen verwondingen, een gebrek aan evenwicht tussen vasoconstrictor en vaatverwijdende innervations, interne micro-tranen en wijzigingen van neuro-verordening3 ,4,5,6,7,8. De meeste behandelingen voor tendinopathie alleen de symptomen te verlichten. Bovendien behandelingen zonder weefselregeneratie vereisen een lange tijd voor revalidatie en bereiken een beperkte reactie van benadeelde pezen, die een klinische uitdaging voor artsen9oplegt.
De incompetentie van de huidige behandelmogelijkheden samen met het ontbreken van de degeneratieve pees vermogen om self-heal heeft lood onderzoekers te nemen van belang in het verkennen van alternatieve behandelingsstrategieën. Onlangs, nieuwe studies gerapporteerd veel veelbelovende resultaten voor het verbeteren van de helende werkzaamheid van de pezen van de tendinopathie met behulp van groeifactoren, stamcel gebaseerde therapie en gene therapie10,11,12.
Via een literatuuronderzoek, vonden we dat de betrokken studies kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun analyse materialen: diermodellen zoals een rat, een muis of een konijn; en menselijke modellen. Met betrekking tot de diermodel, momenteel zijn er twee populaire technieken voor het genereren van tendinopathie: chemische inductie van letsel of mechanische overbelasting van het model. Elke diermodel werd echter beperkt in het weergeven van de complexe menselijke tendinopathie pathologie13,14.
De meeste papieren met behulp van menselijke specimens histologisch werden geanalyseerd of de in vitro uitgevoerd experiment op basis van een gezonde menselijke tenocyte in plaats van een degeneratieve tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. alleen een paar papieren gemeld dat zij een menselijke degeneratieve tenocyte gebruikt, maar ze niet in detail het protocol gebruikt beschrijven om de degeneratieve tenocyte van de menselijke22,-23. In dit verband opgemerkt moet worden dat succesvolle resultaten van het dierlijk model of het gezonde weefsel/tenocyte niet noodzakelijkerwijs voorspellen kunnen menselijke werkzaamheid of werkzame dosering omdat degeneratie van de pees een ingewikkeld proces is en de pathogenese nog steeds niet volledig begrepen.
Collectief, is het noodzakelijk om te beschrijven het standaardprotocol voor het verkrijgen van de degeneratieve tenocyte van menselijk weefsel zonder nadelige gevolgen voor de donor. Dit artikel beschrijft een protocol over hoe te verwerven van de menselijke degeneratieve tenocyte. Voor het valideren van het protocol, zijn de geoogste weefsels histologisch geanalyseerd. De gekweekte cel werd vervolgens bevestigd als de degeneratieve tenocyte door middel van immunocytochemie (ICC), een kwantitatieve real-time-polymerase-kettingreactie (qRT-PCR), en een test van de levensvatbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van Helsinki en het protocol is goedgekeurd door de institutionele Review Board in CHA Bundang Medical Center.
1. degeneratieve pees oogst van het weefsel van de patiënt
- Diagnosticeren van laterale epikondylitis door een medische geschiedenis nemen en het gebruik van fysieke examen bevindingen: tederheid over de tendinous oorsprong dicht bij de laterale epicondylus; pijn opgeroepen door verzette uitbreiding van het gewricht van de pols.
- Gebruik de volgende criteria: ouder dan 18 jaar; een geschiedenis van laterale epikondylitis gedurende ten minste zes maanden; recalcitrant voor niet-operatieve behandeling; ten minste drie maanden zijn verstreken sinds de injectie van corticosteroïden, platelet rich plasma of Botulinetoxine
- Uitsluiten van het volgende: zwangere vrouwen; patiënten met een geschiedenis van de cervicale wervelkolom ziekte elleboog artritis, reumatologisch ziekte, operatie rond elleboog en zenuw entrapment syndrome; patiënten te weigeren om te doneren van weefsel.
-
Operatietechniek
Opmerking: Zie Figuur 124.- Na narcose door Isofluraan en Endotracheale intubatie, de arm op tafel gelegd en een tourniquet toe te passen. Vervolgens breng betadine agent op de hele arm en draperen met een aseptische chirurgische blad.
- Bloot de laterale elleboog via een incisie van 3 – 5 cm met No. 15 chirurgische scalpel blad slechts anteromedial aan de laterale epicondylus en proximale naar het niveau van het gewricht.
- Visueel identificeren de extensor carpi radialis longus (ECRL) en extensor aponeurosis interface en maak een splitsing incisie van 2-3 mm in diepte tussen de ECRL en extensor aponeurosis met een mes chirurgische scalpel No. 15 op de geïdentificeerde interface.
- Pak de ECRL anteriorly, die zal de pathologische extensor carpi radialis longus brevis (ECRB) oorsprong onder direct zicht.
- Visueel identificeren de pathologische degeneratieve weefsel door de karakteristieke saai grijsachtig kleur en meestal edematous en brokkelige weefsel.
- Na identificatie, resect zorgvuldig alle degeneratieve weefsel scherp met behulp van No. 15 chirurgische scalpel en mini-bladen.
- Het resected weefsel (ongeveer 1 cm3) insluiten in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) onmiddellijk en verwijder alle het omringende weefsel behalve pees weefsel zorgvuldig in ongeveer 10 mL PBS zo spoedig mogelijk.
- In gevallen met bony Exostose op de laterale epicondylus verwijderen van Exostose met behulp van een rongeur en het glad met een rasp. Maken van meerdere boorgaten (diameter 1,6 mm, ongeveer 6-8 gaten) in de condyle anterolateral om vasculaire levering. Dit is optioneel.
- Sluit de wond laag voor laag met behulp van niet-absorbeerbare hechtdraad materiaal.
-
Gezonde controle tenocyte
- Gezonde tenocytes verkrijgen bij de resterende pees van de auto-hamstring of auto-patella pees tijdens de voorste cruciate ligament reconstructie en gebruiken als het besturingselement voor de volgende experiment25.
Opmerking: Het aantal monsters gebruikt in deze studie waren er drie in elke groep.
- Gezonde tenocytes verkrijgen bij de resterende pees van de auto-hamstring of auto-patella pees tijdens de voorste cruciate ligament reconstructie en gebruiken als het besturingselement voor de volgende experiment25.
2. histologie
- Bewaar ongeveer de helft van het geoogste weefsel in neutrale gebufferde 10% formaline in een chemische zuurkast of een vergelijkbare groep.
- Het weefsel insluiten in een blok van paraffine (4 – 5 mL) en het punt in 4 – 5 µm secties coronally.
-
Vlek secties van controle en degeneratieve pees met haematoxyline en eosine vlek (H & E) en Alcian blauwe vlek op een pH van 2.5. H & E kleuring in een geautomatiseerde vlek machine als volgt uitvoeren
- Deparaffinize met behulp van xyleen (3 keer, 5 min, respectievelijk).
- Hydrateren van graded alcoholen tot water (100% alcohol, 4 min 100% alcohol, 3 min. 95% alcohol, 2 min; 70% alcohol, 1 min; water, 2 min).
- Vlek in de Haematoxyline gedurende 5 minuten wassen goed in water gedurende 2 min.
- Differentiëren in 1% zuur alcohol (1% HCl in 70% alcohol) voor 3 s. Wash goed in water gedurende 3 minuten.
- HCl neutraliseren door dompelen in een 0,5% ammoniak voor 10 s, gevolgd door een 3 min water wassen.
- Vlek in Eosion voor 5 min.
- Uitdrogen door alcoholen (80% alcohol, 30 s; 95% alcohol, 1 min; 100% alcohol 1 min, 100% alcohol 2 min).
- Duidelijk in xyleen (3 keer, 2 min en 2 min 3 min, respectievelijk).
- Monteren met een cover dia.
-
Uitvoeren van immunohistochemitry (IHC) met behulp van de Bond polymeer verfijnen detectie kit volgens de instructies van de fabrikant met kleine wijzigingen.
- Voer na het deparaffinization met behulp van xyleen, een antigeen ophalen procedure met behulp van de oplossing van de gegevensherwinning van Bond epitoop gedurende 30 minuten bij 100 ° C. De oplossing van de gegevensherwinning van Bond epitoop bevat een citraat gebaseerd buffer en oppervlakteactieve stof (1 L, pH 5,9-6.1).
- Endogene Peroxidasen doven door het weefsel met waterstofperoxide gedurende 5 minuten aan het broeden.
- Incubeer de secties voor 15 min bij een omgevingstemperatuur (21-22 ° C) met primaire antilichamen tegen de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200) of mohawk (1:200).
- Secundair antilichaam coderen met een polymere Biotine-vrije mierikswortel peroxidase-linker antilichaam geconjugeerde systeem uitvoeren
- Gebruik secundaire konijn anti muis IgG in de dierlijke serum 10% (v/v) in Tris-gebufferd saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one oplossing voor het lokaliseren van muis-antilichamen.
- Gebruik anti-konijn polymeer Poly-HRP-IgG (< 25 µg Mo/mL) met de dierlijke serum 10% (v/v) in Tris-gebufferd saline/0.09% te lokaliseren konijn antilichamen.
- Gebruik 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydraat in een stabilisator-oplossing voor het visualiseren van het complex via een bruin neerslag.
- Counterstain met < 0,1% Haematoxyline (blauw) te visualiseren de celkernen.
- Observeren van de dia's gekleurd met H & E, Alcian blauwe vlekken, en IHC voor VEGF, tenomodulin en mohawk onder lichte Microscoop en representatieve microscopische beelden van elke dia onder één hoogvermogen veld (400 X) te verkrijgen.
3. Tenocyte cultuur
-
Weefsel voorbereiding
- Bereid het monster van de pees door het verwijderen van alle van het omringende weefsel grondig met micro-schaar en pincet.
- Wassen met PBS en gehakt in kleine stukjes (ongeveer 1 mm3 of minder).
- Het verteren van weefsels voor 1 h in 30 mL Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM), aangevuld met Collagenase II 30 mg/mL bij 37 ° C.
- Cellen passeren door een zeef van 100 µm cel.
- Deactiveren Collagenase II door toevoeging van 1 mL van foetale runderserum (FBS).
- Centrifugeer bij 196 x g gedurende 5 min.
-
Celcultuur
- Zaad van 3 x 105 cellen in een schotel van 100 mm en cultuur met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% antibioticum-Antimycotic oplossing bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 1 week.
- Wijzig het kweekmedium elke drie dagen totdat 80% samenvloeiing optreedt. Zowel gezonde controle en degeneratieve celsteekproeven tot passage vier cultuur en gebruiken voor experiment.
4. immunocytochemie (ICC)
- Breng 200 µL van gekweekte cellen (2 x 105 cellen) aan de acht putjes van de dia van een kamer en de cellen groeien tot de samenkomst met de toevoeging van nieuwe media voor 1 dag.
- De cellen met PBS wassen en op te lossen met 500 µL van 4% formaldehyde per putje.
- Incubeer de dia's met 0,5% Triton X-100 in PBS voor 10 min voor permeabilization van de membranen.
- Blokkeren in PBS met 1% bovien serumalbumine en 0,05% TWEEN-20 voor mohawk en tenomodulin, respectievelijk.
- In het donker met muis anti-mohawk monoklonaal antilichaam (1:100 verdunning) en geit anti-tenomodulin antistof (1:100 verdunning) bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
- Incubeer de secundaire antilichamen (Alexa 555-anti geit (1:200) voor tenomodulin; Alexa 488-anti-muis (1:200) voor mohawk) in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Mount met 0,5 µL van een fluorescentie montage medium.
- Analyseren met behulp van een fluorescentie Microscoop (400 X).
5. verspreiding Assay
-
Maatregel cel viabilities met behulp van in water oplosbare tetrazolium (WST) -1.
- Beënt, zowel in gezonde als degeneratieve cellen in 96 goed platen bij een dichtheid van 2 x 103 cellen per putje voor 24, 72 en 120 h.
- Na incubatie, voeg toe 10 µL van de 10% WST-1-oplossing aan elk putje.
- Incubeer de platen gedurende 3 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
- Meet de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer. Lezingen ten minste driemaal op alle tijdstippen voor elk monster nemen.
-
Maatregel cellulaire DNA bedrag met behulp van de BrdU assay.
- Beide gezond zaad en degeneratieve cel 96 platen goed bij een dichtheid van 2 x 103 cellen per putje voor 24, 72 en 120 h.
- Na incubatie, voeg toe 10 µL van 10% BrdU-oplossing aan elk putje.
- Incubeer de platen gedurende 3 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
- Voeg 100 µL per putje van de Fixing/Denaturing-oplossing (60-70% ethanol, 0,1-0,5% natriumhydroxide) en houd de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg 100 µL per putje voorbereid 1 h 1 x detectie antilichaam oplossing en houd de plaat bij kamertemperatuur.
- Verwijder oplossing en wassen plaat driemaal met 1 x wassen Buffer.
- Voeg 100 µL per putje bereid 1 x HRP-geconjugeerde secundair antilichaam oplossing en houden de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder de oplossing en wassen plaat driemaal met 1 x wassen Buffer.
- Voeg 100 µL van 50% TMB substraat.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 µL van eindeoplossing.
- Meet de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.
Opmerking: Neem lezingen ten minste driemaal ten allen tijde punten voor elk monster.
6. statistische analyse
- Verzamelen en analyseren van gegevens met behulp van SPSS.
- Verbeelden gegevens door gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde.
- Gebruik Mann-Whitney U test.
- Overwegen verschillen statistisch significant wanneer de p -waarde kleiner dan 0,05 is (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologische analyses bleek dat de geoogste weefsel van laterale epikondylitis had de kenmerken van een tendinopathic pees. H & E gedeelte van tendinopathie degeneratieve pees bleek een ongeorganiseerd collageen bundel met een verlies van polariteit en fijne rechte, sterk verpakt parallelle vezel structuren. Histologische tekenen suggestief van degeneratie zoals hogere buiten en uitgebreide kernen zonder de typische spindle vorm voorkwamen in monsters. Bovendien, collageen bundels van de ontaarde pees waren relatief zwakke eosine gekleurd door H & E maar positief werden gekleurd door Alcian blue die verhoogde proteoglycans en glycosaminoglycanen stof aangeeft.
In alle gevallen, bloedvaten zijn toegenomen in aantal en aggregaten bezetten spaties ingebed tussen de vezels werden vergeleken met normale gleuf-achtige bloedvaten. In de IHC kleuring toonde cellen van ontaarde pezen cytoplasmatische granulaire positief hebben gereageerd op VEGF in vergelijking met de negatieve reactie van besturingselement ones. Gezamenlijk deze bevindingen bevestigd dat de geoogste weefsels van laterale epikondylitis degeneratieve weefsels waren en geschikt voor de cultuur van de degeneratieve tenocyte (Zie Figuur 2).
De gekweekte cellen werden bevestigd als tenocytes door ICC en de geoogste weefsels werden bevestigd door IHC als pees weefsel. De meeste gekweekte cellen en cellen in de pees weefsel toonde een positieve vlek van de representatieve tenocyte markeringen bekend als eiwitten mohawk (groen) en tenomodulin (rood) eiwitten met een langgerekte verschijning onder microscopie (Zie Figuur 3). De geoogste weefsels had ook de positieve kleuring voor mohawk eiwitten en tenomodulin eiwitten immunohistochemisch (Zie aanvullende figuur 1). Deze stelde dat de geoogste weefsels werden gecomponeerd door het weefsel van de pees.
Gekweekte tenocytes van het geoogste weefsel van laterale epikondylitis had de meest karakteristieke kenmerken die overeenkomen met tendinopathie. Zowel de gezonde als de degeneratieve tenocytes werden gekweekt voor 4 dagen onder dezelfde voorwaarde. Op elk tijdstip, was de proliferatie gemeten door BrdU assay en WST-1 kwantitatieve analyse. De resultaten toonden aan dat het tarief van de proliferatie van de degeneratieve cellen was aanzienlijk hoger in vergelijking met de controles zoals eerder gemeld (p < 0.05) (Zie Figuur 4A).
Vijf genen waarvan bekend is dat ze omhoog-geregeld in de degeneratieve pees werden geanalyseerd met qRT-PCR. Uitingen van de genen, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC receptor 1, en PTGS2 (COX2) in de gekweekte cellen van de degeneratieve pees dan in de cellen van gezonde degene meer aanzienlijk waren toegenomen. De relatieve expressies voor alle genen worden weergegeven in Figuur 4B en aanvullende figuur 2.
Figuur 1 : Chirurgische foto van degeneratieve pees oogst. (A) na de huid incisie en dissectie, het pathologische degeneratieve weefsel op de gemeenschappelijke oorsprong van de extensor was blootgesteld, een karakteristiek saai-grijs kleur met edematous verandering (rode lijn). Daarentegen was het algemene uiterlijk van normale pees weefsel glanzend en stevig met een lichtjes grijsachtig Toon (zwarte lijn). (B) alle geïdentificeerde degeneratieve weefsels waren scherp gereseceerd en vervolgens het radiale hoofd bot was blootgesteld. (C) alle resected weefsels zijn ingebed in de fosfaatgebufferde zoutoplossing onmiddellijk en het omringende weefsel van de niet-tendinous werd zorgvuldig zo spoedig mogelijk ontleed. ECRB: extensor carpi radialis brevis. EDC: extensor digitorum communis. ECU: extensor carpi ulnaris. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Bevestiging van degeneratieve pees histologisch. (A) had In de H & E kleuring, degeneratieve monsters van de laterale epikondylitis ongeorganiseerd collageen bundels met verlies van polariteit en verhoogd celaantal in vergelijking met de gezonde controle. (B). Alcian blauw kleuring bleek dat de degeneratieve pees grond stof die bestaat uit proteoglycans en glycosaminoglycanen met verschillende mucoid patches en vacuolen tussen vezels (pijl) had verhoogd. (C). bovendien verhoogd VEGF immunohistochemistry aangetoond bij de vorming van het vaartuig in degeneratieve pees monsters ten opzichte van de controlemonsters kleuring. VEGF: Vasculaire endotheliale groeifactor. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Identificatie van tenocyte door ICC. De gekweekte cellen en cellen in de pees weefsel werden bevestigd als tenocyte door ICC. Allermeest naar de cellen toonde positieve vlek voor de markering van de representatieve tenocyte, met inbegrip van mohawk (groen) en tenomodulin (rood) met verlengde verschijning onder microscopie. Chondrocyten werd gebruikt als de negatieve controle. ICC: immunocytochemie. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Kenmerken van degeneratieve tenocyte. (A, B) Degeneratieve tenocytes (rood) had een hoger tarief van de proliferatie met een opmerkelijke toename in buiten. (C) vijf genen waarvan bekend is dat het te maken in de ontwikkeling van tendinopathie werden aanzienlijk verhoogd in de degeneratieve tenocytes. Gen expressie niveaus werden genormaliseerd tegen GAPDH. *: bedoel < 0,05, **: bedoel < 0,01, respectievelijk. SP: stof P. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: histologische bevestiging van het geoogste weefsel als de pees weefsel. Het geoogste weefsel was ook geanalyseerd door IHC voor mohawk en tenomodulin om te bepalen of de geoogste weefsel had de toereikende eigenschappen van pees weefsel. IHC: Immunohistochemistry. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2: uitdrukking van tendinopathie gerelateerde genen in tenocyte. De transcripties van vijf genen genormaliseerd door de actine expressie waren aanzienlijk verhoogde in de degeneratieve tenocytes en hebben soortgelijke trends naar Figuur 4. Gen expressie niveaus waren tegen actine met een gemiddelde genormaliseerde < 0,05 en < 0,01, respectievelijk. SP: stof P. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aantal eerdere studies hebben gemeld hoe om chronische tendinopathic dierlijke modellen met gebruikmaking van verschillende procedures zoals collagenase of kartogenin injectie, loopband lopen en meer26,27te maken. Hoewel talrijke studies veelbelovende therapeutische effecten op basis van deze dierlijke modellen toonden, zou experimenten met behulp van de menselijke degeneratieve tenocyte cruciaal belang op het gebied van de tendinopathie te vervangen en de doeltreffendheid van behandeling. In dit artikel, we een protocol met succes oogsten en menselijke degeneratieve tenocytes consequent cultuur opgericht. Beide geoogst pees weefsel en de gekweekte tenocyte toonde de gemeenschappelijke kenmerken van de degeneratieve pees en tenocyte7,28.
In onze ervaring is voor de oogst succesvol weefsel het onmisbaar voor het begrijpen van de morfologische veranderingen vaak geassocieerd met degeneratieve pees en nauwkeurig af te bakenen dat gebied tijdens de operatie. Degeneratieve weefsel is meestal grijs of bruin van kleur en het weefsel is dun, kwetsbaar, en ongeorganiseerd met losse textuur. De integratie en uitsluiting criteria van het protocol moeten strikt worden bewaard met zorgvuldige evaluatie van de vorige behandelingen vóór oogst.
Weefsel grootte is ook belangrijk voor een succesvolle celkweek. Het is raadzaam om meer dan 1 cm3oogsten. Meestal, zolang alle van de degeneratieve gebied is verwijderd, zou de hoeveelheid verzamelde weefsel genoeg zijn voor de cultuur van de cel. Tot slot, gebruikten we niet tenocytes over zes passage in alle experimenten. Tot passage zes, wij zijn van mening dat de gekweekte cellen nog de kenmerken van degeneratie.
Ons protocol heeft verschillende voordelen. Deze voordelen omvatten geen schade aan de patiënt, omdat de degeneratieve weefsel worden verwijderd tijdens de operatie, efficiëntie moest, aangezien de hoeveelheid weefsel vereist genoeg voor het experiment, uiterst ethische wegens geen overtreding van gezonde weefsels is, reproduceerbaarheid in dat pathologische weefsels van de mens kan gemakkelijk worden verkregen tijdens de operatie, en, ten slotte, gemak van toepassing eenmaal chirurgische technieken vertrouwd te raken.
Wij erkennen echter dat ons experiment verscheidene beperkingen heeft. Ten eerste, we niet volledig uitsluiten het restant effect van vorige corticosteroïden of platelet rich plasma injectie hoewel we alleen patiënten die ten minste drie maanden verstreken waren ontvangen een eerdere behandeling opgenomen. Bovendien, in dit protocol, we alleen geoogst van de ECRB pees en gebruikte het om cultuur degeneratieve tenocytes aangezien de ECRB pees een gemeenschappelijke site van de tendinopathie voor chirurgie samen met Achilles en de rotator cuff pezen is. Verdere studies moeten worden uitgevoerd met een grotere grootte van de steekproef, gericht op geschillen tussen verschillende tendinopathie sites.
Tot slot zullen dit gevalideerde protocol voor de verwerving van menselijke degeneratieve tenocytes een nuttig hulpmiddel voor toekomstige onderzoeken in de pees biologie en testen nieuwe therapeutische interventies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Korea Health Technology R & D Project via de Korea gezondheid industrie Development Institute (KHIDI), die werd gefinancierd door het ministerie van gezondheid & welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
