Summary
השתמש במבחנה של tenocytes ניוונית חיוני כאשר החוקר את היעילות של טיפול חדשניים על tendinopathy. עם זאת, רוב המחקרים להשתמש רק את המודל החייתי או של tenocyte בריא. אנו מציעים הפרוטוקול. הבא כדי לבודד tenocytes ניוונית אנושי במהלך הניתוח.
Abstract
Tendinopathy, מצב כואב שמתפתח בתגובה ניוון בגיד, נמצאת בעלייה בעולם המפותח בשל הגדלת פעילות גופנית, תוחלת חיים ארוכה יותר. למרות השכיחות הגוברת שלה, המשמש כבסיס בפתוגנזה עדיין נשאר לא ברור, הטיפול הוא בדרך כלל סימפטומטי. לאחרונה, אפשרויות טיפוליות רבות, לרבות גורמי גדילה, תאי גזע, ריפוי גנטי, נחקרו בתקווה לשיפור את הפוטנציה הריפוי של הגיד ניוונית. עם זאת, הרוב המכריע של מחקרים אלו נערכו רק על מודלים בעלי חיים או tenocytes אדם בריא. למרות מחקרים באמצעות tenocytes פתולוגית, לפי מיטב ידיעתנו אין כרגע שום פרוטוקול המתאר כיצד ניתן להשיג את האדם tenocytes ניוונית. מטרת מחקר זה היא לתאר את פרוטוקול תקני לרכישת tenocytes ניוונית אנושי. בתחילה, הרקמה גיד היה נקצרו מחולה עם epicondylitis לרוחב במהלך הניתוח. אז נלקחו דגימות ביופסיה פושט carpi radialis הקצר הגיד המתאימים לשינויים מבניים ציין בזמנו של הניתוח. כל הגידים שנקטפו נראה משעמם, אפור, לעזאזל, בצקי, אשר הפך את אותם ויזואלית שונה מזו הבריאים. Tenocytes היו תרבותי ומשמשים לניסויים. בינתיים, מחצית הרקמות שנקטפו נותחו בהיסטולוגיה, זה הוצג כי הם חלקו את אותן תכונות מפתח של tendinopathy (angiofibroblastic דיספלזיה או היפרפלזיה). ניתוח משני מאת immunocytochemistry אישר כי התאים בתרבית היו tenocytes עם רוב התאים שיש כתמי חיובי המוהוק, tenomodulin חלבונים. האיכויות של הטבע ניוונית של tenocytes ואז נקבעו על-ידי השוואת התאים הפקד בריא שימוש assay התפשטות או לרביעיית-PCR. Tenocyte ניוונית מוצג שיעור גבוה יותר של התפשטות דפוסים דומים של ביטוי גנים של tendinopathy שתאמו את הדוחות הקודמים. בסך הכל, פרוטוקול חדש זה עשוי לספק כלי שימושי עבור מחקרים עתידיים של tendinopathy.
Introduction
Tendinopathy היא כרונית מצב של ניוון שרירים ושלד שמתפתח בחלקים שונים של הגוף. לאחרונה, מספר המקרים של tendinopathy גדל באופן משמעותי בעולם המפותח בשל גידול ההשתתפות ספורט ופנאי תוחלת החיים מוגברת1,2. הגורם tendinopathy נחשבת multifactorial, גורמים אלה כוללים איסכמיה, פציעות רדיקלים חופשיים של חמצן, חוסר איזון בין מצר את כלי הדם, מרחיב כלי דם innervations, מיקרו פנימי-דמעות, ושינויים נוירו-תקנה3 ,4,5,6,7,8. רוב הטיפולים עבור tendinopathy רק להקל על הסימפטומים שלה. יתר על כן, טיפולים ללא התחדשות רקמות דורשים זמן רב לשיקום ולהשיג לתגובה מוגבלת של הגידים פצוע, שהטילו אתגר קליני עבור רופאים9.
היכולת של אפשרויות הטיפול הנוכחי יחד עם חוסר היכולת של הגיד ניווניות self-heal יש חוקרים עופרת להתעניין לחקור אסטרטגיות טיפול אלטרנטיבי. לאחרונה, מחקרים חדשים דיווחו על תוצאות מבטיחות רבות לשיפור יעילות הריפוי של הגידים tendinopathy באמצעות גורמי גדילה, תאי הגזע מבוסס טיפול וג'ין טיפול10,11,12.
באמצעות ביקורת ספרות, מצאנו כי המחקרים מעורב ניתן לחלק לשתי קטגוריות מבוסס על חומרים ניתוח שלהם: חיה דגמים כמו חולדה, עכבר או ארנב; לדוגמניות אנושיות. לגבי המודל בעלי חיים, כיום ישנם שתי שיטות פופולרי כדי להפיק tendinopathy: אינדוקציה כימי של פציעה או מכונות העמסת המודל. עם זאת, כל דגם בעלי חיים היה מוגבל מתרבה tendinopathy האנושית מורכבת פתולוגיה13,14.
רוב המסמכים באמצעות דגימות האנושי נותחו בהיסטולוגיה או ביצע את במבחנה הניסוי המבוסס על tenocyte אנושי בריא ולא ניוון tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. רק על כמה מסמכים דיווחו כי הם השתמשו tenocyte ניוונית של האדם, אך הם לא מתארים בפרוטרוט את פרוטוקול המשמש כדי לקבל את tenocyte ניוונית מ האנושי22,23. בהקשר זה יצוין כי תוצאות מוצלחות מן המודל בעלי חיים או את הרקמות/tenocyte בריא מאי לא בהכרח לנבא את היעילות האנושית או מינון אפקטיבי כי ניוון בגיד הוא תהליך מסובך והוא בפתוגנזה עדיין לא לגמרי מובן.
באופן קולקטיבי, זה הכרחי לתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי להשגת את tenocyte ניוונית של רקמה אנושית מבלי לגרום תופעות לוואי על התורם. מאמר זה מתאר פרוטוקול על איך לרכוש את tenocyte ניוונית אנושי. כדי לאמת את הפרוטוקול, נותחו בהיסטולוגיה הרקמות שנקטפו. לאחר מכן, לתא בתרבית אושר כמו tenocyte ניוונית באמצעות immunocytochemistry (ICC), של כמותיים בזמן אמת-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ואת וזמינותו של הכדאיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול נערך בהתאם הצהרת הלסינקי, הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית במרכז הרפואי Bundang צ'ה.
1. ניוונית גיד הקציר רקמות מן המטופל
- לאבחן epicondylitis לרוחב על-ידי לקיחת היסטוריה רפואית באמצעות ממצאי בדיקה גופנית: רגישות מעל המקור tendinous קרוב העלי הרוחבית; כאב עורר התנגד סיומת של מפרק כף היד.
- השתמש לקריטריוני ההכללה הבאה: מעל גיל 18; היסטוריה של epicondylitis לרוחב במשך לפחות שישה חודשים; עקשניים לטיפול פעיל לפרקים; לפחות שלושה חודשים חלפו מאז הזרקה של סטרואידים, פלזמה עשיר טסיות או בוטולינום טוקסין
- אל תכלול את הדברים הבאים: נשים בהריון; למטופלים עם היסטוריה של מחלות בעמוד השדרה הצווארי, המרפק דלקת פרקים, מחלת והראומטולוגיים, ניתוח סביב המרפק, תסמונת מלכוד עצב; חולים מסרב תרום רקמות.
-
טכניקה כירורגית
הערה: ראה איור 124.- לאחר הרדמה כללית על-ידי איזופלוריין צנרור אנדוטרכאליות, לשים את היד על השולחן, עורקים. הסוכן betadine להחיל על כל הזרוע, מאסו עם גיליון כירורגי אספטי.
- לחשוף את המרפק לרוחב דרך חתך 3-5 ס מ עם מס 15 באזמל כירורגי להב רק anteromedial העלי הרוחבית, מקורב לרמה של המפרק.
- מבחינה חזותית לזהות את פושט carpi radialis הארוך (ECRL) ואת ממשק aponeurosis פושט ולעשות חתך פיצול 2 – 3 מ מ לעומק בין aponeurosis ECRL, פושט עם להב באזמל כירורגי מס 15-הממשק שזוהה.
- לחלץ את ECRL anteriorly, אשר תביא פושט פיפטות carpi radialis הארוך הקצר (ECRB) מקורו מתחת לתצוגה ישירה.
- חזותית לזהות את רקמות ניוונית פיפטות מאת צבעו אפרפר משעמם האופיינית ורקמות בדרך כלל בצקי ומתפורר.
- לאחר זיהוי, בזהירות נכרות כל רקמות ניוונית בחדות באמצעות אזמל כירורגי מס 15 ומיני-להבים.
- להטביע את הרקמה resected (כ- 1 ס מ3) לתוך פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) מיד ולהסיר כל הרקמה שמסביב חוץ רקמות גיד בזהירות לתוך בערך 10 מ"ל של PBS ככל האפשר.
- במקרים עם גרמי המולדים בעצם המוח-העלי הרוחבית, הסר המולדים בעצם המוח באמצעות rongeur של, להחליק את זה עם rasp. לעשות חורים לקדוח מרובים (בקוטר 1.6 מ מ, כ 6-8 חורים) ב המפרקתי הנמוך anterolateral כדי לשפר את אספקת הדם. פעולה זו היא אופציונלית.
- לסגור את הפצע שכבה אחרי שכבה באמצעות חומר תפרים נספגים.
-
Tenocyte בקרה בריאים
- להשיג tenocytes בריא של הגיד הנותרים של הגיד שריר הירך-אוטומטי או אוטומטי-צלחית במהלך שחזור צולבת קדמית, ולהשתמש בו בתור לפקד על הניסוי הבא25.
הערה: מספר דגימות המשמשות במחקר זה היו שלושה בכל קבוצה.
- להשיג tenocytes בריא של הגיד הנותרים של הגיד שריר הירך-אוטומטי או אוטומטי-צלחית במהלך שחזור צולבת קדמית, ולהשתמש בו בתור לפקד על הניסוי הבא25.
2. היסטולוגיה
- חנות כמחצית הרקמה שנקטפו בפורמלין נייטרלי במאגר 10% הוד fume כימי או שווה ערך.
- להטביע את הרקמה בבלוק פרפין (4 – 5 מ"ל), סעיף זה בסעיפים 4-5 מיקרומטר coronally.
-
כתם מקטעים של גיד ניוונית עם Hematoxylin ו Eosin כתם (H & E), הכתם Alcian כחולה ב- pH של 2.5 ובקרה. לבצע H & E מכתים במכונה אוטומטית כתם כדלקמן.
- Deparaffinize באמצעות קסילן (3 פעמים, 5 דקות, בהתאמה).
- מימה של כהלים מדורגת למים (100% אלכוהול, 4 דקות 100% אלכוהול, 3 דקות; 95% אלכוהול, 2 דקות; 70% אלכוהול, 1 דקות; מים, 2 דקות).
- כתם ב Hematoxylin עבור 5 דק לשטוף היטב במים למשך 2 דקות.
- להבדיל ב 1% אלכוהול חומצה (1% HCl ב-70% אלכוהול) עבור 3 ס' לשטוף היטב במים למשך 3 דקות.
- לנטרל HCl בטבילת של אמוניה 0.5% 10 s, ולאחריה שטיפה במים 3 דקות.
- כתם ב Eosion במשך 5 דקות.
- מייבשים דרך כהלים (80% אלכוהול, 30 s; 95% אלכוהול, 1 דקות; 100% אלכוהול 1 דקות, 100% אלכוהול 2 דקות).
- ברור של קסילן (3 פעמים, 2 דקות, 2 דקות ו- 3 דקות, בהתאמה).
- הר עם מגלשת כיסוי.
-
לבצע immunohistochemitry (IHC) באמצעות ערכת בונד פולימר לחדד זיהוי על-פי הוראות היצרן עם שינויים מזעריים.
- לאחר deparaffinization באמצעות קסילן, לבצע הליך אחזור אנטיגן באמצעות בונד Epitope אחזור פתרון במשך 30 דקות ב- 100 מעלות צלזיוס. הפתרון אחזור Epitope בונד מכיל מאגר ציטראט המבוסס על חומרים פעילי שטח (1 ליטר, pH 5.9 – 6.1).
- להרוות אנדוגני peroxidases על ידי המקננת הרקמה עם מימן על-חמצני במשך 5 דקות.
- דגירה הסעיפים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (21-22 מעלות צלזיוס) עם ראשי נוגדנים נגד כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200) או מוהוק (1:200).
- לבצע נוגדנים משניים תיוג עם חזרת נטולת ביוטין פולימריים peroxidase-מקשר נוגדן תרכיב מערכת.
- שימוש משני ארנב אנטי עכבר IgG בנסיוב בבעלי חיים 10% (v/v) בתמיסה 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one saline/0.09% באגירה טריס למקם העכבר נוגדנים.
- השתמש פולימר אנטי-ארנב פולי-HRP-אג ' (< µg 25/mL) המכיל 10% (v/v) בסרום בעלי חיים בבאגירה טריס saline/0.09% כדי להתאים לשפה ארנב נוגדנים.
- השתמש 3, 3'-Diaminobenzidine מימה tetrahydrochloride בפתרון מייצב להמחיש המתחם דרך התמיסה חום.
- Counterstain עם < hematoxylin 0.1% (כחול) כדי להמחיש את גרעין התא.
- לצפות בשקופיות מוכתם H & E, Alcian כחול כתמי ולאחר IHC VEGF, tenomodulin של מוהוק במיקרוסקופ אור ולקבל תמונות מיקרוסקופיות נציג של כל שקופית תחת מתח גבוה אחד שדה (400 X).
3. Tenocyte תרבות
-
הכנת הרקמה
- הכינו את הדגימה גיד על-ידי הסרת כל הרקמה שמסביב ביסודיות עם מיקרו-מספריים וחדים.
- לשטוף עם PBS, מינצ לחתיכות קטנות (על 1 מ מ3 או פחות).
- מעכלים רקמת עבור 1 h ב- 30 מ ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) בתוספת 30 מ"ג/מ"ל Collagenase II ב 37 º C.
- עוברים תאים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
- לבטל את Collagenase השני על-ידי הוספת 1 מ"ל של נסיוב שור עוברית (FBS).
- צנטריפוגה ב g x 196 במשך 5 דקות.
-
תרבית תאים
- זרע 3 x 105 תאים לתוך תבשיל 100 מ מ, תרבות עם DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פתרון אנטיביוטיקה-Antimycotic-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% במשך שבוע.
- לשנות את המדיום תרבות כל שלושה ימים עד 80% הנהרות מתרחשת. תרבות בקרה בריאים והן דגימות תאים ניוונית עד המעבר ארבע ולהשתמש לניסוי.
4. Immunocytochemistry (ICC)
- להעביר 200 µL של תאים בתרבית (2 x 105 תאים) הבארות שמונה של שקופית קאמרית ולגדול התאים למפגש עם התוספת של מדיה חדשה עבור יום אחד.
- לשטוף את התאים עם PBS ותקן עם 500 µL של 4% פורמלדהיד לכל טוב.
- דגירה של השקופיות עם 0.5% X-100 Triton ב- PBS 10 דקות עבור permeabilization של הממברנות.
- לחסום ב- PBS עם אלבומין פרה 1% ל- 0.05% TWEEN-20 המוהוק, tenomodulin, בהתאמה.
- דגירה בחושך עם העכבר מוהוק נגד נוגדנים חד שבטיים (דילול מטריים), נוגדן anti-tenomodulin עזים (דילול מטריים) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- דגירה הנוגדנים משני (אלכסה 555-נגד עז (1:200) עבור tenomodulin; אלקסה 488-אנטי עכבר (1:200) עבור מוהוק) בחושך לשעה בטמפרטורת החדר.
- הר עם 0.5 µL מדיום הרכבה זריחה.
- לנתח באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (400 X).
5. התפשטות Assay
-
למדוד תא viabilities באמצעות tetrazolium מסיסים במים (wst, מרץ)-1.
- זרע תאים בריאים והן ניוונית לוחות טוב 96-צפיפות של 2 x 103 תאים לכל טוב של 24, 72 ו- 120 h.
- לאחר דגירה, להוסיף 10 µL של הפתרון WST-1 10% מכל קידוח.
- דגירה על עומדי 3 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
- מודדים את צפיפות אופטית-450 nm באמצעות קורא microplate. את הקרינה לפחות שלוש פעמים בכל הנקודות הזמן עבור כל דגימה.
-
מדד הסלולר DNA סכום באמצעות וזמינותו BrdU.
- זרע שניהם בריאים, ניוון תאים לתוך 96 טוב צלחות על צפיפות של תאים3 עונה 2 פרק 10 לכל טוב של 24, 72 ו- 120 h.
- לאחר דגירה, להוסיף 10 µL של 10% BrdU פתרון טוב לכל.
- דגירה על עומדי 3 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
- להוסיף 100 µL טוב של הפתרון תיקון/Denaturing (60-70% אתנול, 0.1-0.5% נתרן הידרוקסידי) ולשמור את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הוסף µL 100/טוב מוכן 1 x זיהוי נוגדנים פתרון ולשמור הצלחת בטמפרטורת החדר 1 h.
- הסרת פתרון, לשטוף צלחת שלוש פעמים עם 1 x מאגר לשטוף.
- להוסיף µL 100/טוב מוכן 1 x מצומדת HRP נוגדנים משניים פתרון ולהשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר את לוחית פתרון ושטוף שלוש פעמים עם 1 x מאגר לשטוף.
- להוסיף 100 µL של 50% שוייץ המצע.
- תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 100 µL של להפסיק פתרון.
- מודדים את צפיפות אופטית-450 nm באמצעות קורא microplate.
הערה: לקחת קריאות לפחות שלוש פעמים על כל נקודות זמן עבור כל דגימה.
6. ניתוח סטטיסטי
- לאסוף ולנתח את הנתונים באמצעות SPSS.
- מתארים את הנתונים על-ידי זאת אומרת ± לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע.
- השתמש מאן ויטני U במבחן.
- לקחת בחשבון הבדלים משמעותיים סטטיסטית בעת ערך p הוא פחות מ- 0.05 (p < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוחים היסטולוגית חשף כי הרקמה שנקטפו מן epicondylitis לרוחב היו המאפיינים גיד tendinopathic. סעיף H & E של גיד ניוונית tendinopathy חשף צרור קולגן לא מאורגן עם הפסד של קוטביות ומבנים בסדר ישר, חריפה ארוזה סיבים מקבילים. רמיזות של ניוון כגון cellularity גבוה יותר, גרעינים מוגדלת בלי צורת פלך טיפוסי היסטולוגית סימנים היו נפוצים בדגימות. בנוסף, צרורות הקולגן של הגיד מנוונת היו אאוזין חלשה יחסית מוכתמת H & E, אבל באופן חיובי היו מוכתמת כחול Alcian המציינת את החומר proteoglycans ו- glycosaminoglycans מוגברת.
בכל המקרים, כלי הדם היו גדל במספר, אגרגטים הכובש רווחים מוטבעים בין סיבי הושוו לכלי הדם נורמלי שדמו לחריצים. ההכתמה IHC, תאים של הגידים מנוונת הראו cytoplasmic תגובה חיובית פרטנית כדי VEGF לעומת התגובה השלילית של שליטה אלה. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה אישר כי הרקמות שנקטפו מן epicondylitis לרוחב היו רקמות ניוונית ומתאים התרבות tenocyte ניוונית (ראה איור 2).
התאים בתרבית היו מאושרות כמו tenocytes על ידי ICC, הרקמות שנקטפו שאושרו על-ידי IHC כמו רקמות גיד. רוב התאים בתרבית תאים ברקמת הגיד הראה כתם חיובי עבור הסמנים tenocyte נציג ידועים כמו חלבונים מוהוק (ירוק), tenomodulin (אדום) חלבונים עם מראה מוארך תחת מיקרוסקופ (ראה איור 3). הרקמות שנקטפו היה גם, ההכתמה חיובי עבור מוהוק חלבונים ו tenomodulin חלבונים immunohistochemically (ראה איור 1 משלים). אלה הציע כי הרקמות שנקטפו חוברו על ידי הרקמה גיד.
Tenocytes בתרבית מן הרקמה שנקטפו של epicondylitis לרוחב היו התכונות האופייניות התואמים tendinopathy. Tenocytes ניוונית וגם בריא היו תרבותי ארבעה ימים תחת באותו המצב. בכל נקודה בזמן, קצב התפשטות נמדדה על ידי BrdU assay ואת וזמינותו WST-1. התוצאות הראו כי קצב התפשטות התאים ניוונית היה משמעותית גבוהה יותר בהשוואה הפקדים דיווח כאמור (p < 0.05) (ראה איור 4א).
חמישה גנים אשר ידועים להיות מוסדר למעלה בהגיד ניוונית נותחו על ידי לרביעיית-PCR. ביטויים של הגנים, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), קולטן טק 1, ו- PTGS2 (COX2) היו גדל באופן משמעותי יותר בתאים בתרבית של הגיד ניוונית יותר בתאים מן הבריאים. הביטויים היחסי עבור כל הגנים מוצגים באיור 4B ומשלימה באיור 2.
איור 1 : צילום ניתוח גיד ניוונית הקציר. (א) לאחר חתך ניתוח, הרקמה ניוונית פיפטות מוצא פושט נפוצות נחשף, מציג צבע אפרורי משעמם אופיינית עם שינוי בצקי (הקו האדום). לעומת זאת, המראה הכללי של רקמות גיד נורמליים היה מבריק ומוצק עם צליל מעט אפרפר (קו שחור). (B) לכל רקמות ניוונית שזוהו היו resected בחדות, ואז נחשף ראש העצם הרדיאלי. (ג) לכל רקמות resected הוטבעו לתוך תמיסת המלח פוספט באגירה מלאה באופן מיידי, הרקמה הלא-tendinous שמסביב היה גזור בקפידה בהקדם האפשרי. ECRB: פושט carpi radialis הקצר. EDC: פושט האצבעות מהשני. ECU: פושט carpi ulnaris. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אישור של גיד ניוונית בהיסטולוגיה. (א) ב H & E מוכתמים, ניווניות דגימות epicondylitis לרוחב לא מאורגן קולגן חבילות עם הפסד של קוטביות, גדל מספר התא בהשוואה הפקד בריא. (B). Alcian מכתים כחול הראה כי הגיד ניוונית גברה הקרקע חומר המורכב proteoglycans ו glycosaminoglycans עם מספר תיקונים mucoid, וקואלות בין סיבים (חץ). (ג). בנוסף, VEGF אימונוהיסטוכימיה הפגינו גדל מכתים במבנה כלי בדגימות גיד ניוונית לעומת הדגימות שליטה. VEGF: כלי הדם צמיחה אנדותל. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי של tenocyte על ידי ICC- תאים בתרבית של תאים ברקמת הגיד שאושרו על-ידי ICC כמו tenocyte. רוב התאים הראה הכתם חיובי עבור דה מרקר נציג tenocyte, כולל מוהוק (ירוק) tenomodulin (אדום) עם מראה מוארך תחת מיקרוסקופ. Chondrocyte שימש את הפקד שלילי. ICC: Immunocytochemistry. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מאפייני ניווניים tenocyte. (A, B) Tenocytes ניוונית (אדום) היה שיעור גבוה יותר של התפשטות עם עלייה הבולטים cellularity. (C) חמישה גנים ידועים כדי להיות קשורות להתפתחות tendinopathy היו גבוהות באופן משמעותי ב- tenocytes ניוונית. רמות ביטוי גנים היו מנורמל נגד GAPDH. *: אומר < 0.05, * *: אומר < 0.01, בהתאמה. SP: חומר עמ' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: אישור היסטולוגית של הרקמה שנקטפו כמו רקמות גיד. הרקמה שנקטפו נותחה גם על ידי IHC המוהוק, tenomodulin לקבוע אם הרקמה שנקטפו היו המאפיינים נאותה של רקמות גיד. IHC: אימונוהיסטוכימיה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 2: ביטוי tendinopathy הקשורים גנים tenocyte. התמלילים של חמישה גנים מנורמל אקטין לביטוי היו גבוהות באופן משמעותי tenocytes ניוונית, יש מגמות דומות באיור 4. רמות ביטוי גנים היו מנורמל נגד אקטין עם ממוצע < 0.05, < 0.01, בהתאמה. SP: חומר עמ' אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר מחקרים קודמים דיווחו על איך ליצור מודלים בעלי חיים tendinopathic כרונית, באמצעות הליכים שונים כגון collagenase או הזרקת kartogenin, הליכון ריצה26,עוד27. למרות מחקרים רבים הראו מבטיחים אפקטים טיפולית המבוססת על מודלים בבעלי חיים אלה, ניסויים באמצעות את tenocyte ניוונית האנושי יהיה מכריע בתחום tendinopathy כדי לשחזר את היעילות של הטיפול. במאמר זה, הקמנו פרוטוקול בהצלחה הקציר של התרבות האנושית tenocytes ניוונית באופן עקבי. שניהם שנקטפו רקמות גיד והראו tenocyte בתרבית המאפיינים הנפוצים של ניוון בגיד ו tenocyte7,28.
מניסיוננו, לקציר רקמות מוצלח, זה חיוני להבין את שינויים מורפולוגיים הקשורים לעתים קרובות עם גיד ניוונית להתוות במדויק את האזור במהלך הניתוח. רקמות ניוונית היא בדרך כלל אפור או חום בצבע, הרקמה דק, שביר, לא מאורגן עם מרקם רופף. הקריטריונים והדרה של הפרוטוקול צריך לשמור בקפדנות עם הערכה זהירה של טיפולים קודמים לפני הקציר.
רקמה בגודל חשוב גם תרבות תא מוצלחת. אנו ממליצים על קצירת יותר מ- 1 ס מ3. בדרך כלל, כל עוד כל השטח ניוונית מוסר, כמות רקמת שנאספו יהיה מספיק בשביל התרבות תאים. לבסוף, אנחנו לא השתמש tenocytes מעל המעבר שש כל ניסויים. עד מעבר 6, אנו מאמינים כי התאים בתרבית עדיין היו המאפיינים של ניוון.
פרוטוקול שלנו יש מספר יתרונות. יתרונות אלו כוללים שום נזק למטופל מאז הרקמה ניוונית היה אמור להסירו במהלך הניתוח, יעילות מכיוון שהסכום של רקמות הנדרש הוא מספיק בשביל הניסוי, אתית מאוד עקב אין הפרה של רקמות בריאה, הפארמצבטית ברקמות פתולוגיים הזה מבני ניתן להשיג בקלות במהלך הניתוח, ולהיות, לבסוף, להקל על יישום טכניקות ניתוחיות פעם מוכר.
עם זאת, אנו להכיר כי הניסוי שלנו יש מספר מגבלות. קודם, אנחנו לחלוטין לא יכולים להוציא את שריד ההשפעה של הסטרואידים הקודם או טסיות פלזמה עשיר הזרקת למרות כללנו רק מטופלים אשר עברו לפחות שלושה חודשים מקבלת שום טיפול קודמים. בנוסף, ב פרוטוקול זה, אנחנו רק לקצור הגיד ECRB והשתמשו בו כדי tenocytes ניוונית התרבות מאז הגיד ECRB הוא אתר tendinopathy נפוצות לניתוח יחד עם הגידים אכילס של מסובבי הכתף. מחקרים נוספים צריכה להתבצע עם גודל מדגם גדול יותר התמקדות על ההבדלים בין אתרים tendinopathy שונים.
לסיכום, פרוטוקול זה מאומתים לרכישת tenocytes ניוונית האנושי יהיה כלי שימושי עבור חקירות בעתיד בביולוגיה גיד ועבור בדיקות הרומן התערבויות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק של קוריאה בריאות טכנולוגיית R & D פרויקט דרך קוריאה בריאות תעשיית פיתוח המכון (KHIDI), אשר מומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
