Summary
Vitro dejeneratif tenocytes ne zaman tendinopathy roman tedavi etkinliğinin araştırılması temel kullanımıdır. Ancak, çoğu araştırma çalışmaları sadece hayvan modeli veya sağlıklı bir tenocyte kullanın. Biz insan dejeneratif tenocytes ameliyat sırasında yalıtmak için aşağıdaki iletişim kuralı öneriyoruz.
Abstract
Artan fiziksel aktivite ve daha uzun yaşam beklentisi nedeniyle gelişmiş dünyada yükselişte Tendinopathy, tendon dejenerasyon, tepki olarak gelişen acı bir sorunu var. Artan yaygınlık rağmen temel Patogenez hala belirsizdir ve genellikle semptomatik tedavidir. Son zamanlarda, büyüme faktörleri, kök hücre ve gen tedavisi, dahil olmak üzere çok sayıda tedavi olanakları dejeneratif tendon şifa potens arttırmak umuduyla araştırıldı. Ancak, bu araştırma çalışmaları çoğunluğu sadece hayvan modelleri ya da sağlıklı insan tenocytes yapılmıştır. Patolojik tenocytes kullanarak bazı çalışmalar rağmen bizim bilgi en iyi şekilde işte şu anda insan dejeneratif tenocytes edinme açıklayan protokol yok. Bu çalışmada insan dejeneratif tenocytes edinme standart protokol tarif etmektir. Başlangıçta, tendon doku ameliyat sırasında lateral Epikondilitte ile bir hastadan hasat. O zaman biyopsi örnekleri ameliyat anında gözlemlenen yapısal değişikliklere karşılık gelen ekstansiyon carpi komplikasyon brevis tendon dan alınmıştır. Tüm hasat ve tendonların sıkıcı, gri, kırılgan olduğu ortaya çıktı ve ödemli, onları görsel olarak sağlıklı olanlardan ayrı yapıldığı. Tenocytes kültürlü ve deneyler için kullanılan. Bu arada, yarısı hasat dokuların histolojik olarak analiz edildi ve aynı anahtar şekil-in tendinopathy (angiofibroblastic displazi veya hiperplazi) paylaşılan gösterildi. İmmunocytochemistry göre ikincil bir analiz kültürlü hücreleri mohawk ve tenomodulin proteinler için olumlu lekeleri sahip hücreleri çoğunluğu ile tenocytes olduğunu doğruladı. Tenocytes dejeneratif doğası nitelikleri sonra hücrelerin proliferasyonu tahlil veya qRT-PCR kullanarak sağlıklı kontrol ile karşılaştırarak belirlenmiştir. Dejeneratif tenocyte daha yüksek bir yayılma hızı ve önceki raporlar eşleşen tendinopathy benzer gen ifade biçimleri görüntülenir. Genel olarak, bu yeni iletişim kuralı tendinopathy gelecekteki çalışmaları için yararlı bir araç sağlayabilir.
Introduction
Tendinopathy vücudun çeşitli bölgelerinde geliştiren bir Kronik dejeneratif kas-iskelet durumdur. Son zamanlarda, tendinopathy, servis taleplerinin sayısı büyük ölçüde gelişmiş dünyada eğlence spor ve artan yaşam süresi1,2katılım büyüyen nedeniyle artmıştır. Tendinopathy nedeninin multifaktöriyel olarak kabul edilir ve bu nedenler iskemi, oksijen serbest radikal yaralanmaları, vasoconstrictor ve vazodilatör innervations, iç mikro-gözyaşları ve nöro-yönetmelik3 yapılan değişiklikler arasında bir dengesizlik ,4,5,6,7,8. En tedaviler tendinopathy için sadece onun belirtileri ortadan kaldırmaz. Ayrıca, doku rejenerasyonu olmadan tedavi rehabilitasyon için uzun zaman gerektirir ve doktorlar9için klinik bir meydan okuma dayatır yaralı tendon, sınırlı bir yanıttan elde etmek.
Mevcut tedavi seçenekleri ile birlikte duyulursa dejeneratif tendon'ın yetenek eksikliği yetersizlik kurşun araştırmacılar ormanda alternatif tedavi stratejileri keşfetmek için vardır. Son zamanlarda, yeni çalışmalar büyüme faktörleri kullanarak tendinopathy tendonlar şifalı etkinliğinin artırılması için çok umut verici sonuçlar bildirdi, kök hücre terapisi ve gen terapisi10,11,12dayalı.
Bir literatür ile ilgili çalışmalar onların analiz materyaller üzerinde dayalı iki kategoriler halinde bölünmüş bulduk: hayvan modelleri bir sıçan, fare veya bir tavşan; gibi ve insan modelleri. Hayvan modeli ile ilgili olarak, şu anda tendinopathy oluşturmak için iki popüler yöntem vardır: yaralanma veya model aşırı mekanik kimyasal indüksiyon. Ancak, her hayvan modeli karmaşık insan tendinopathy patoloji13,14üreyen sınırlı.
İnsan numuneleri kullanılarak en kartları histolojik olarak analiz edildi veya vitro gerçekleştirilen deneme dayalı bir dejeneratif tenocyte15,16,17,18 yerine sağlıklı bir insan tenocyte , 19 , 20 , 21. bir insan dejeneratif tenocyte kullandılar ama onlar insan22,23dejeneratif tenocyte almak için kullanılan iletişim kuralı ayrıntılı bir şekilde tanımlamak değil yalnızca birkaç kağıt bildirdi. Bu bağlamda, bu başarılı sonuçları hayvan modeli veya sağlıklı doku/tenocyte mutlaka insan etkinliği veya tendon dejenerasyon karmaşık bir süreç olduğu ve Patogenez etkili dozaj tahmin değil ki unutulmamalıdır hala tam olarak anlayamadım.
Topluca, donör için olumsuz etkilere yol açmadan dejeneratif tenocyte insan dokusu elde etmek için standart iletişim kuralı tanımlamak gereklidir. Bu makalede insan dejeneratif tenocyte elde etmek nasıl bir protokolünü açıklar. Protokol doğrulamak için hasat doku histolojik olarak analiz edildi. O zaman, kültürlü hücre immunocytochemistry (ICC), bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve canlılığı tahlil kullanarak dejeneratif tenocyte doğrulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol uyarınca Helsinki bildirimi yapılmıştır ve protokol CHA: Bundang Tıp Merkezi Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi.
1. dejeneratif Tendon doku hasat hastadan
- Bir tıp tarihi dersi ve fizik muayene bulguları kullanarak yanal Epikondilitte teşhis: lateral epicondyle; yakın tendinous kökeni üzerinde hassasiyet ağrı direndi uzantısı el bileği eklemin tarafından uyarılmış.
- Aşağıdaki dahil ölçütleri kullanın: 18 yaşını doldurmuş; en az altı ay için yanal Epikondilitte öyküsü; inatçı non-operatif tedavi için; en az üç ay beri kortikosteroid, trombosit zengin plazma veya botulinum toksin enjeksiyon geçti
- Şu hariç: hamile kadınlar; Servikal omurga hastalığı, dirsek ve sinir sıkışması sendromu çevresinde cerrahi dirsek artrit, romatolojik hastalık öyküsü olan hastalar; hastaların doku bağış reddederek.
-
Cerrahi teknik
Not: Resim 124bakın.- Genel anestezi isoflurane ve endotrakeal entübasyon sonra kol masanın üstüne koy ve turnike uygulanır. O zaman tüm kol ve örtüsü bir aseptik cerrahi levha ile betadine Ajan uygulayın.
- No. 15 Cerrahi neşter bıçak sadece anteromedial lateral epicondyle ve eklem seviyesine proksimal ile 3-5 cm kesi aracılığıyla yanal dirsek maruz.
- Görsel olarak ekstansiyon carpi komplikasyon longus (ECRL) ve ekstansiyon aponeurosis arabirim tanımlama ve yarma kesi 2-3 mm derinlik ECRL ve ekstansiyon aponeurosis No. 15 Cerrahi neşter bıçak tanımlanan arayüz ile arasında yapabilirsiniz.
- ECRL anteriorly, hangi-ecek getirmek patolojik ekstansiyon carpi komplikasyon longus brevis (ECRB) kökenli aşağıda doğrudan görünüme ayıklayın.
- Görsel olarak onun karakteristik mat grimsi rengi tarafından patolojik dejeneratif doku ve genellikle ödemli ve kırılgan doku tanımlar.
- Kimlik sonra dikkatli bir şekilde keskin No. 15 Cerrahi neşter ve mini-bıçakları kullanarak tüm dejeneratif doku çıkarabileceğim.
- (Yaklaşık 1 cm3) rezeke doku hemen fosfat tamponlu tuz (PBS) embed ve tendon doku dışında tüm çevreleyen doku en kısa zamanda dikkatlice yaklaşık 10 mL PBS kaldırın.
- Kemikli Ekzostoz, lateral epicondyle bulunan olgularda, Ekzostoz bir rongeur kullanarak kaldırmak ve bir törpülemek ile düzeltmek. Birden çok matkap delik yapmak (çapı 1.6 mm, yaklaşık 6 – 8 delikler) vasküler tedarik geliştirmek için anterolateral düzgün içinde. İsteğe bağlı bu.
- Yara katman katman absorbe olmayan suture maddi kullanarak kapatın.
-
Sağlıklı kontrol tenocyte
- Sağlıklı tenocytes auto-hamstring veya auto-patella tendon kalan tendon ön çapraz bağ rekonstrüksiyonu sırasında elde etmek ve için aşağıdaki deney25denetimi olarak kullanabilirsiniz.
Not: Bu çalışmada kullanılan örnekleri sayısı her grupta üçüydü.
- Sağlıklı tenocytes auto-hamstring veya auto-patella tendon kalan tendon ön çapraz bağ rekonstrüksiyonu sırasında elde etmek ve için aşağıdaki deney25denetimi olarak kullanabilirsiniz.
2. Histoloji
- Hasat doku yaklaşık yarısı tarafsız tampon % 10 formalin kimyasal duman hood veya eşdeğer saklayın.
- Doku parafin blok (4-5 mL) katıştırabilir ve coronally 4-5 µm bölümlerde bölüm.
-
Denetim ve Hematoksilen ve eozin leke (H & E) ve Alcian mavi leke 2.5 pH ile dejeneratif tendon bölümleri leke. H & E bir otomatik leke makinede aşağıdaki gibi boyama gerçekleştirmek.
- Ksilen kullanarak deparaffinize (3 defa, 5 dk, sırasıyla).
- Kademeli Alkoller (%100 alkol, 4 dk %100 alkol, 3 dk % 95 alkol, 2 dk; % 70 alkol, 1 min; su, 2 dk) su için hidrat.
- Hematoksilen içinde 5 dk. 2 min için de suda yıkama leke.
- % 1 asit alkol ayırt etmek (% %1 70 alkol HCl) için 3 s. 3 dk de suda yıkayın.
- HCl %10 0.5 amonyak daldırma tarafından nötralize s, 3 dk su yıkama tarafından takip.
- Eosion içinde 5 min için leke.
- Alkoller kurutmak (% 80 alkol, 30 s; % 95 alkol, 1 min; %100 alkol 1 dk, %100 alkol 2 dk).
- Ksilen içinde açık (3 defa, 2 dk, 2 dk ve 3 dak, sırasıyla).
- Bir kapak slayt ile bağlayın.
-
Küçük değişiklikler ile üretici yönergelerine göre Bond polimer rafine algılama seti kullanarak immunohistochemitry (IHC) gerçekleştirin.
- Ksilen kullanarak deparaffinization sonra 100 ° C'de 30 dk için Bond Epitope alma çözüm kullanarak bir antijen alma yordamı gerçekleştirmek Bond Epitope alma çözüm tabanlı sitrat tampon ve yüzey aktif (1 L, pH 5,9-6.1) içerir.
- Endojen peroxidases 5 min için hidrojen peroksit ile doku kuluçka tarafından gidermek.
- Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) (1: 200), tenomodulin (1: 200) veya mohawk (1: 200) karşı birincil antikorlar ile bölümleri bir ortam sıcaklığı (21-22 ° C), 15 dk için kuluçkaya.
- İkincil antikor biotin ücretsiz polimer horseradish peroksidaz-bağlayıcı antikor eşlenik sistemiyle etiketleme gerçekleştirin.
- Kullanım ikincil tavşan anti IgG Tris arabelleğe alınmış saline/0.09% 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one çözümünde fare antikorlar yerelleştirmek için % 10 (v/v) hayvan serumda fare.
- Polimer Anti-tavşan Poly-HRP-IgG kullanın (< 25 µg/mL) Tris tamponlanmış saline/0.09% tavşan antikorlar yerelleştirmek için % 10 (v/v) hayvan serum içeren.
- Karmaşık bir kahverengi küçülmesinihızlandırmalı üzerinden görselleştirmek için bir sabitleyici çözümde kullanmak 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hidrat.
- İle counterstain < % 0,1 hematoksilen (mavi) hücre çekirdeği görselleştirmek için.
- H ile lekeli slaytlar gözlemlemek & E, Alcian VEGF, tenomodulin ve mohawk için ışık mikroskop altında mavi lekeler ve IHC ve her slaytın altında bir yüksek güç alan (400 X) temsilcisi mikroskobik görüntü elde.
3. Tenocyte kültür
-
Doku hazırlık
- Tendon örnek mikro-makas ve forseps ile iyice çevreleyen doku kaldırarak hazırlayın.
- (Yaklaşık 1 mm3 veya daha az) küçük parçalara kıyma ve PBS ile yıkayın.
- Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile 30 mg/mL Collagenase II 37 ° C'de 30 ml 1 h için doku sindirmek
- Hücreleri 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
- Collagenase II 1 mL fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek devre dışı bırakın.
- 196 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
-
Hücre kültürü
- 3 x 105 hücreleri 100 mm çanak içine tohum ve %10 FBS ve % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de % 1 antibiyotik Antimycotic çözüm ile 1 hafta için takıma DMEM ile kültür.
- Kültür orta % 80 izdiham oluşana kadar üç günde değiştirin. Sağlıklı kontrol ve dejeneratif hücre örnekleri geçiş kadar dört kültür ve deneme için kullanın.
4. Immunocytochemistry (ICC)
- Kültürlü hücre (2 x 105 hücreleri) 200 µL odası slayt sekiz kuyu aktarmak ve 1 gün için taze medya eklenmesi ile izdiham için hücreleri büyümek.
- PBS hücrelerle yıkama ve 500 µL % 4 formaldehit iyi ücret ile düzeltmek.
- % 0.5 ile slaytlar kuluçkaya Triton X-100 PBS membranlar permeabilization için 10 dakika içinde.
- PBS içinde % 0.05 ile % 1 sığır serum albümin engellemek ara-20 mohawk ve tenomodulin, anılan sıraya göre.
- Fare Anti-mohawk monoklonal antikor (1: 100 seyreltme) ve keçi anti-tenomodulin antikor (1: 100 seyreltme) 4 ° C'de karanlık gecede kuluçkaya.
- Kuluçkaya ikincil antikorlar (Alexa 555-anti keçi (1: 200) için tenomodulin; Mohawk için Alexa 488-anti fare (1: 200)) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için.
- Bir floresan montaj orta 0.5 µL ile bağlayın.
- Floresan mikroskop (400 X) kullanarak analiz.
5. nükleer silahların yayılmasına karşı tahlil
-
Suda çözünen tetrazolium (WST) -1 kullanarak hücre viabilities ölçmek.
- Sağlıklı ve dejeneratif hücreleri iyi 24, 72 ve 120 saat başına 2 x 103 hücre yoğunluğu, 96 iyi tabak içine tohum.
- Kuluçka sonra her şey için 10 µL % 10 WST-1 çözüm ekleyin.
- Plakayı %5 CO237 ° C'de 3 h için kuluçkaya.
- 450 de optik yoğunluğunu ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm. Okuma tüm zaman puan her örnek için en az üç kez atın.
-
Ölçü hücresel DNA tutarı BrdU tahlil kullanarak.
- Her ikisi de sağlıklı tohum ve dejeneratif 96 hücreye de iyi 24, 72 ve 120 saat başına 2 x 103 hücre yoğunluğu tabaklar..
- Kuluçka sonra her şey için 10 µL % 10 BrdU çözüm ekleyin.
- Plakayı %5 CO237 ° C'de 3 h için kuluçkaya.
- 100 µL/iyi sabitleme/Denaturing çözüm ekleyin (% 60-70 etanol, 0.1 – %0.5 sodyum hidroksit) ve plaka, oda sıcaklığında 30 dakika tutun.
- 100 µL/iyi 1 x algılama antikor çözüm ve tutmak plaka oda sıcaklığında 1 h için hazırlanan ekleyin.
- Çözüm kaldırma ve plaka üç kez 1 yıkama arabellek x ile yıkayın.
- 1 x ikincil antikor HRP Birleşik çözüm 100 µL/iyi hazırlanan ekleyin ve plaka 30 dk için oda sıcaklığında kalmasını sağlayın.
- Üç kez 1 yıkama arabellek x ile çözüm ve yıkama plaka kaldırın.
- 100 µL % 50 TMB substrat ekleyin.
- Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- 100 µL STOP çözüm ekleyin.
- 450 de optik yoğunluğunu ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.
Not: Take okuma en az üç kez puan her örnek için ne zaman istersen.
6. istatistiksel analiz
- Toplamak ve SPSS ile veri analiz.
- Veri demek tarafından ortalama ± standart hatasını tasvir.
- Kullanım Mann Whitney U testi.
- Farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı dikkate p değeri 0,05 azdır (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histolojik analizler yanal Epikondilitte hasat dokudan tendinopathic tendon özellikleri olduğunu ortaya koydu. Tendinopathy dejeneratif tendon H & E bölümünü dağınık kollajen paket kaybı Polarite ve iyi düz, güçlü Paketli paralel elyaf yapıları ile saptandı. Histolojik işaretleri dejenerasyonu daha yüksek cellularity ve tipik iğ şekli olmadan genişlemiş çekirdeği gibi düşündüren örneklerinde yaygındı. Ayrıca, kolajen demetleri dejenere tendon nispeten zayıf eozin H & E tarafından lekeli vardı ama olumlu tarafından artan proteoglikanlar ve glikozaminoglikan madde gösteren Alcian mavi lekeli.
Her durumda, kan damarlarının sayısında artış ve lifler arasında gömülü alanlarda işgal toplamları normal yarık gibi kan damarları için karşılaştırıldı. IHC boyama hücreleri dejenere tendonların sitoplazmik taneli olumlu tepki VEGF ile karşılaştırıldığında kontrol olanlar olumsuz tepki gösterdi. Toplu olarak, bu bulgular yanal Epikondilitte hasat dokulardan dejeneratif doku olduğunu doğruladı ve dejeneratif tenocyte kültür için uygun (bkz. Şekil 2).
Kültürlü hücreleri tenocytes ICC tarafından teyit edildi ve hasat doku IHC tendon doku olarak tarafından teyit edildi. En kültürlü hücreleri ve tendon doku hücrelerinde gösterdi temsilcisi tenocyte işaretçileri için olumlu bir leke bilinen mohawk (yeşil) protein ve tenomodulin (kırmızı) proteinler ile mikroskobu altında uzun bir görünüm olarak (bkz. Şekil 3). Ayrıca, hasat doku mohawk protein ve tenomodulin protein immunohistochemically için ( ek Şekil 1bakınız) pozitif boyama vardı. Bunlar hasat doku tendon doku tarafından oluşturuldu önerdi.
Yanal Epikondilitte hasat dokusundan kültürlü tenocytes tendinopathy için karşılık gelen karakteristik özellikleri vardı. Sağlıklı ve dejeneratif tenocytes aynı koşul altında 4 gün boyunca kültürlü. Her zaman noktası, nükleer silahların yayılmasına karşı oranı BrdU tahlil ve WST-1 tahlil tarafından ölçüldü. Dejeneratif hücre proliferasyon oranı önemli ölçüde daha daha önce bildirilen denetimlere göre, sonuçlar gösterdi (p < 0,05) (bkz. Şekil 4A).
Up-dejeneratif tendon düzenlenmiş olduğu bilinen beş gen qRT-PCR tarafından analiz edildi. Genler, COL3A1, ACTA2, TAC1 (SP), TAC reseptör 1, ifadeler ve PTGS2 (COX2) daha da önemlisi hücrelerdeki sağlıklı olanlardan tendon dejeneratif kültürlü hücrelerden artış. Tüm genler için göreceli deyimler Şekil 4B ve Tamamlayıcı Şekil 2gösterilir.
Resim 1 : Cerrahi dejeneratif tendon hasat fotoğrafı. (A) cilt kesi ve diseksiyon sonra patolojik dejeneratif doku üzerinde ortak ekstansiyon kökenli, karakteristik bir donuk grimsi renk ödemli değişikliği (kırmızı çizgi) ile gösterilen maruz kalmış. Bunun tersi olarak, normal tendon doku genel görünümü parlak ve sert bir hafif grimsi sesi (siyah çizgi). (B) tüm tanımlanmış dejeneratif doku keskin rezeke ve o zaman radyal kafa kemik maruz kalmış. (C) tüm rezeke dokularda hemen fosfat tamponlu tuz gömülü ve çevresindeki tendinous doku dikkatle en kısa zamanda disseke. ECRB: ekstansiyon carpi komplikasyon brevis. EDC: ekstansiyon digitorum communis. ECU: ekstansiyon carpi ulnaris. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İþleminizin onayýný dejeneratif tendon histolojik olarak. (A) içinde H & E boyama, dejeneratif örnekleri yanal Epikondilitte polarite kaybı kolajen demetleri dağınık ve sağlıklı denetimine göre hücre sayısı arttı. (B). Alcian mavi boyama gösterdi dejeneratif tendon zemin proteoglikanlar ve glikozaminoglikan birkaç mukoid yamalar ve çarpıtmalar lifleri (ok) arasında oluşan madde artmıştı. (C). Buna ek olarak, kontrol örnekleri karşılaştırıldığında dejeneratif tendon örneklerinde damar oluşumunda boyama gösterdi VEGF immünhistokimya arttı. VEGF: Vasküler endotelyal büyüme faktörü. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Tenocyte tarafından ICC tanımlaması. Kültürlü hücreleri ve tendon doku hücrelerinin tenocyte ICC tarafından teyit edildi. Hücrelerin çoğu mohawk (yeşil) ve tenomodulin (kırmızı) mikroskobu altında uzun görünümü ile de dahil olmak üzere temsilci tenocyte işaretçisi için olumlu leke gösterdi. Kondrosit negatif kontrol kullanıldı. ICC: Immunocytochemistry. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Özellikleri dejeneratif tenocyte. (A, B) Dejeneratif tenocytes (kırmızı) daha yüksek bir nükleer silahların yayılmasına karşı oranı dikkate değer bir artış ile cellularity içinde vardı. Tendinopathy gelişiminde ilgili olabilir bilinmektedir (C) beş gen önemli ölçüde dejeneratif tenocytes yüksek. Gen ifade düzeyleri GAPDHkarşı normalleştirilmiş. *: demek < 0,05, **: demek < 0,01, anılan sıraya göre. SP: madde s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Şekil 1: hasat dokusu histolojik teyidi tendon doku olarak. Hasat doku aynı zamanda IHC mohawk ve tenomodulin hasat doku tendon doku yeterli özellikleri vardı olup olmadığını belirlemek analiz edildi. IHC: immünhistokimya. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek resim 2: tendinopathy ifadesi ile ilgili tenocyte genlerinde. Beş gen aktin ifade tarafından normalleştirilmiş transkript dejeneratif tenocytes önemli ölçüde yükseltilmiş ve Şekil 4için benzer eğilimler var. Gen ifade düzeyleri normalleştirilmiş aktin bir ortalamaya sahip karşı < 0,05 ve < 0,01, anılan sıraya göre. SP: madde s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki çalışmalar bir dizi nasıl collagenase ya da kartogenin enjeksiyon, koşma koşu bandı ve daha fazla26,27gibi farklı prosedürler kullanarak kronik tendinopathic hayvan modelleri oluşturmak için rapor. Birçok çalışma bu hayvan modelleri alan umut verici tedavi edici etkileri olsa da, insan dejeneratif tenocyte kullanarak deneyler tendinopathy alanında tedavi etkinliğinin çoğaltmak için çok önemli olacaktır. Bu makalede, başarılı bir şekilde hasat ve sürekli insan dejeneratif tenocytes kültür için bir protokol kurduk. Her ikisi de tendon doku hasat ve kültürlü tenocyte28dejeneratif tendon ve tenocyte7,ortak özelliklerini gösterdi.
Deneyim, başarılı doku hasat zamanı, çok sık dejeneratif tendon ile ilişkili morfolojik değişiklikler anlamak ve doğru bir şekilde ameliyat sırasında bu alanda betimlemek için esastır. Dejeneratif doku genellikle gri veya kahverengi renk ve doku ince, kırılgan ve gevşek doku ile dağınık. Protokol içerme ve dışlama kriterleri kesinlikle önceki tedaviler hasat önce dikkatli değerlendirilmesi ile tutulmalıdır.
Doku boyutu da başarılı hücre kültürü için önemlidir. Biz daha fazla 1 cm3hasat öneririz. Genellikle, tüm dejeneratif çevrenin kaldırılır sürece toplanan doku miktarı yeterli hücre kültürü olurdu. Son olarak, biz tenocytes tüm deneyler altı pasajda üzerinden kullanmak vermedi. Geçit altı kadar kültürlü hücreler hala dejenerasyon özellikleri vardı inanıyoruz.
Bizim iletişim kuralı birçok avantajı vardır. Dejeneratif doku ameliyat gerekli doku miktarı yeterli deneme için son derece sağlıklı dokuları yok ihlali nedeniyle etik olduğundan verimliliği sırasında kaldırılması gerekiyordu beri bu avantajları hastaya zarar dahil, insanlar bu patolojik dokularda tekrarlanabilirlik kolayca ameliyat sırasında elde edilebilir ve son olarak, uygulama bir kez cerrahi teknikler kolaylığı aşina olmak.
Ancak, bizim deneme bazı sınırlamaları vardır kabul. Biz sadece en az üç ay önceki herhangi bir tedavi gören geçmişti hastalar dahil olsa bile önce tamamen önceki kortikosteroid ya da trombosit zengin plazma enjeksiyon kalıntı etkisi dışlayamazsınız. Ayrıca, bu iletişim kuralı ' Biz sadece ECRB tendon ve hasat ECRB tendon ameliyatı ile birlikte rotator cuff ve Aşil tendon için ortak bir tendinopathy sitesine bu yana kültür dejeneratif tenocytes için kullanılır. Daha fazla çalışmaları çeşitli tendinopathy siteler arasında herhangi bir fark odaklanarak daha büyük bir örnek boyutu ile yapılmalıdır.
Sonuç olarak, insan dejeneratif tenocytes edinme için doğrulanmış bu protokol test roman tedavi müdahaleler ve tendon biyolojide gelecekteki araştırmalar için yararlı bir araç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Kore sağlık teknoloji R & D proje ile Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (hangi Sağlık Bakanlığı ve sosyal yardım, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen KHIDI), bir hibe tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: HI16C1559).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
References
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J.
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).
