Summary
Imagerie moléculaire avec laser assistée par matrice désorption/ionisation-basée d’imagerie spectrométrie de masse (MALDI-IMS) permet la cartographie simultanée de plusieurs analytes dans des échantillons biologiques. Nous présentons ici un protocole pour la détection et la visualisation de la protéine β-amyloïde sur les tissus cérébraux de la maladie d’Alzheimer et d’angiopathie amyloïde échantillons à l’aide de MALDI-IMS.
Abstract
La neuropathologie de la maladie d’Alzheimer (ma) est caractérisée par l’accumulation et l’agrégation des peptides β-amyloïde (Aß) en plaques extracellulaires du cerveau. Les peptides bêta-amyloïdes, composées de 40 acides aminés, sont générés à partir des protéines de précurseur de l’amyloïde (APP) par β - et γ-sécrétases. Bêta-amyloïdes sont déposées non seulement dans le parenchyme cérébral, mais aussi en méningées et les parois des vaisseaux cérébraux, appelées angiopathie amyloïde (CAA). Bien qu’une variété de peptides bêta-amyloïdes ont été identifiés, détaillé de production et de distribution de différents peptides Aß dans les tissus pathologiques des AD et CAA n’ont pas été entièrement réglés. Ici, nous développons un protocole laser assistée par matrice désorption/ionisation-basée d’imagerie de spectrométrie de masse (MALDI-IMS) sur les tissus du cerveau humain autopsie afin d’obtenir la cartographie complète de protéine. À cet effet, les prélèvements humains corticales ont été extraites de la banque de cerveaux à la Tokyo Metropolitan Institut de gérontologie. Cryosections congelées sont coupées et transférées à oxyde indium-étain (ITO)-revêtement des lames de verre. Les spectres sont recueillies à l’aide du système MALDI avec une résolution spatiale jusqu'à 20 µm. acide Sinapique (SA) est uniformément réparti sur la diapositive en utilisant un pulvérisateur manuel ou automatique. Avec les avantages techniques actuelles de MALDI-IMS, un ensemble de données typique de diverses espèces de bêta-amyloïdes dans les mêmes sections de cerveaux autopsiés humains peut être obtenu sans sondes spécifiques. En outre, à haute résolution (20 µm) imagerie d’un cerveau et de la grave CAA échantillon montre clairement que Aβ1-36 à Aβ1-41 ont été déposés dans des vaisseaux méningées, tandis que Aβ1-42 et Aβ1-43 ont été déposés au parenchyme cérébral comme plaque sénile (SP). Il est possible d’adopter une approche standard en combinaison avec les observations cliniques, génétiques et pathologiques dans la compréhension de la pathologie d’Alzheimer, CAA, MALDI-IMS et autres maladies neurologiques basé sur la stratégie actuelle.
Introduction
Afin de faire le diagnostic et pour comprendre la pathogenèse des maladies neurodégénératives, identification moléculaire précise des dépôts pathologiques est essentiel1. Dans le cadre de l’AD, Aβ est produit pour rendre le SPs dans le parenchyme cérébral et déposé dans des récipients bien avant la maladie survenue2,3,4,5,6. Aβ1-42 est le peptide prédominant dans le SP de cerveaux Alzheimer, autres variantes Aβ, par exemple N-terminal ou C-terminal tronqués ou modifiés Aβs, sont également identifiés dans touchés AD cerveau7,8,9, 10. Un tableau complet de l’espèce de large gamme de bêta-amyloïdes dans le cerveau humain, surtout avec les AD et cérébral angiopathie amyloïde cérébrale (CAA)11, aidera les scientifiques comprennent la production de bêta-amyloïdes, du métabolisme et des dépôts.
L’approche classique de la neuropathologie, immunohistochimie (IHC) a été la méthode la plus concluante pour déterminer l’emplacement de Aβs dans le cerveau tissus12,13,14,15. En général, IHC ne peut distinguer des molécules lorsque plusieurs épitopes coexistent simultanément. En revanche, une analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique émergente est une approche valable surtout pour l’analyse des diverses espèces de bêta-amyloïdes dans les tissus du cerveau, qui ne peuvent pas être différenciés avec anticorps16,17. L’analyse conventionnelle de basé sur la spectrométrie de masse des lysats de cerveau et immuno-précipité des échantillons ne parvient pas à détecter de petits peptides bêta-amyloïdes et perd les informations de distribution de bêta-amyloïdes dans le tissu cérébral.
Dans des œuvres antérieures, visualisation des dépôts de bêta-amyloïdes dans le cerveau de souris a été réussie à l’aide d’un modèle animal transgénique de AD, tels que APP23. Toutefois, ce processus doit encore des progrès techniques pour comparer IMS et IHC en ce qui concerne la résolution et la sensibilité de19,18,20. Neuropathologie devrait être étudiée sur le cerveau humain, et nous avons utilisé la technologie MALDI-IMS sur les tissus du cerveau humain autopsie afin d’obtenir des protéines complètes cartographie21. À cette fin, nous avons développé un protocole pour un type de pointe de spectrométrie de masse qui a des avantages à sa rapidité, la sensibilité et la reproductibilité.
Protocol
Ici, les échantillons de tissus ont été prélevés à l’hôpital gériatrique de Tokyo Metropolitan, qui fournit des services médicaux communautaires pour les personnes âgées au Japon. Les échantillons d’autopsie de cerveau utilisés dans l’étude ont été enregistrés à la banque de cerveau pour la recherche vieillissement (BBAR) avec le consentement éclairé des parents du défunt. Le BBAR est approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital gériatrique de Tokyo Metropolitan et l’Institut de gérontologie. Pour tous les cerveaux, enregistrée à la banque de cerveaux, nous avons obtenu écrit consentement éclairé pour leur utilisation pour la recherche médicale de patients ou de leurs familles. Les patients ont été placés en chambre froide (4 ° C) dans les 2 h après la mort de réduire les changements post-mortem du cerveau. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Université Doshisha et la banque de cerveaux pour vieillissement recherche, hôpital gériatrique de Tokyo Metropolitan et Institut de gérontologie.
1. préparation des Sections de tissu pour IMS
- Traitement des échantillons de tissu d’un cerveau humain autopsié
Remarque : Vérifiez que l’étape de préparation d’échantillon pour IMS conserve l’état original du tissu. Éviter les changements de contamination et post-mortem. L’étape suivante est crucial.- Obtenir des spécimens humains corticales pour IMS de cerveaux qui ont été enlevés, traitées et stockées à-80 ° C dans les 8 h post-mortem. Prendre l’échantillon de cerveau du cortex occipital d’Alzheimer et témoins du même âge21.
- Préparation des coupes de tissus congelés
- Couper les sections de tissu sur un cryostat. Placer les lames de verre conducteur microscope ITO-enduit à l’intérieur du cryostat21.
- Chauffer l’échantillon de cerveau d’autopsie de-80 ° C à-22 ° C à l’intérieur du cryostat.
- Fixer une nouvelle lame jetable au cryostat pour chaque expérience. Toujours essayer d’utiliser une partie propre de la lame.
- Mettre le cerveau congelé autopsie sur la scène avec une petite quantité de composé de l’OCT (assez pour couvrir la zone centrale de la scène ; voir Table des matières).
- Choisir les conditions pour la coupe mince. Pour IMS, utiliser une épaisseur de 10 – 12 μm pour les sections du cerveau humain. Pour IMS et IHC, cinq ou six coupes de chaque échantillon de tissu.
- Lorsque la lame ne fait que commencer couper le tissu, tournez la roue et le « visage » du bloc jusqu'à ce que tous les tissus est exposée. S’il y a une petite rayure ou une déchirure dans l’ensemble de la section, attendre un peu plus dans le cryostat jusqu'à ce que le réglage de la température il corrige automatiquement. Compter quelques secondes avant d’ouvrir l’antiroulis avec un tissus dessous.
- Placer immédiatement la tranche de tissu sur le côté recouvert ITO de la lame de verre. Dégelez la tranche de tissu en plaçant un doigt sous la glissière sur le côté non-ITO-enduit. Le tissu s’en tiendra à la diapositive ; Assurez-vous que le tissu est aussi plat que possible avec aucune rides. Effectuez cette étape à la température ambiante.
Note : Porter des masques, des gants et une blouse de laboratoire car les échantillons humains peuvent contenir des contaminants biologiques. Lorsque toutes les sections ont été apportées pour la journée, nettoyer le cryostat, brosses et mandrins avec laboratoire lingettes et 200 mL d’éthanol à 100 %.
- Rinçage des coupes de tissus
- Immerger les exemples de 40 à 100 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 s pour supprimer les lipides endogènes et les sels inorganiques. Utiliser un verre pot de coloration.
- Laver les échantillons avec 40 – 100 mL d’éthanol à 100 % pendant 30 s, 40 – 100 mL de solution de Carnoy pour 3 min, 40 à 100 mL d’éthanol à 100 % pendant 30 s, 40 – 100 mL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) pendant 1 min et 40 – 100 mL d’éthanol à 100 % pour 30 s. utiliser un verre pot de coloration.
Remarque : Solution de Carnoy est un fixateur, composé de six parties d’éthanol, acide acétique trois parties et une partie chloroforme. - Sec dans le vide pendant 30 min.
- Traitement des coupes de tissus avec une vapeur de l’acide formique pour une meilleure ionisation des protéines bêta-amyloïdes de tissus cérébraux autopsie
- Préparer la lame de verre du four et l’incubation à utiliser pour la vaporisation subséquente avec 5 mL d’acide formique à 100 %. Pour parvenir à un traitement acid satisfaisant, garder l’humidité de l’air dans le plat en verre au niveau de saturation tout au long de cette étape d’incubation et maintenir la température à 60 ° C. Placez les lames de tissu dans le plat en verre d’incubation tout en évitant l’immersion dans l’acide formique et traiter pendant 6 min.
- Prendre une image optique des échantillons à l’aide d’un scanner film, scanner de gel, ou un microscope numérique, etc. pour effectuer l’installation à la température ambiante. L’alignement de l’image optique des échantillons est nécessaire lorsque la cible de l’échantillon est placée à l’intérieur de l’instrument. Habituellement, il ne sera pas possible de reconnaître la section de tissu sous la couche de la matrice.
Remarque : La manière la plus facile de prendre une image optique est d’utiliser un scanner de bureau. C’est une bonne idée pour enregistrer l’image dans le dossier de stockage de données d’imagerie. - Pour mettre en corrélation les images optiques avec les échantillons, faire des marques guide qui sont visibles dans l’optique de l’image et sous la couche de la matrice dans l’optique de la caméra. Le moyen le plus simple est de taches correction au moins trois fluide autour de l’échantillon avant de prendre l’image optique.
- Application de la matrice
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Préparation de la solution de matrice
- Dans un microtube tolérants aux solvants organique, préparer un 10 mg/mL solution SA dans 50 % d’acétonitrile (ACN) et 0,1 % TFA. Soigneusement dissoudre la SA composée par vortex ou sonication bref pendant environ 10 minutes Store la solution à température ambiante avant utilisation.
Remarque : Il existe trois options différentes pour la pulvérisation de la matrice : à l’aide d’un aérographe, un pulvérisateur à ultrasons ou un pulvérisateur automatique.
- Dans un microtube tolérants aux solvants organique, préparer un 10 mg/mL solution SA dans 50 % d’acétonitrile (ACN) et 0,1 % TFA. Soigneusement dissoudre la SA composée par vortex ou sonication bref pendant environ 10 minutes Store la solution à température ambiante avant utilisation.
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Vaporisation de la matrice à l’aérographe
- Effectuer l’opération à une température ambiante constante (20 – 23 ° C) et humidité (40-60 %). Les paramètres à régler pour une pulvérisation optimale comprennent la taille de la goutte, la quantité de brouillard, l’angle et la distance entre la buse et la section de tissu et le laboratoire de température et d’humidité. Réglez ces conditions en vérifiant les résultats de la microscopie.
Remarque : Comme facteurs limitants comprennent la taille des cristaux et l’homogénéité de la couverture de la matrice et la migration/diffusion indésirable des analytes, plus petit est mieux pour la taille des gouttes. Homogénéité est aussi le point d’inspection.
- Effectuer l’opération à une température ambiante constante (20 – 23 ° C) et humidité (40-60 %). Les paramètres à régler pour une pulvérisation optimale comprennent la taille de la goutte, la quantité de brouillard, l’angle et la distance entre la buse et la section de tissu et le laboratoire de température et d’humidité. Réglez ces conditions en vérifiant les résultats de la microscopie.
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La matrice de pulvérisation avec un pulvérisateur à ultrasons
- Retirez le tissu pour être refoulé par le dessiccateur et placez-le dans la chambre. Assurez-vous que le tissu ne recouvre pas la fenêtre du capteur.
- Commencer la préparation en appuyant sur le bouton Démarrer ; temps de préparation est généralement environ 90 min. La préparation sera régulée automatiquement via le contrôle de l’épaisseur de couche de matrice et l’humidité. Une fois la préparation terminée, retirer la glissière et stockez-la dans le dessiccateur pendant 15 min avant de la lire dans l’acte MALDI.
- Nettoyer le pulvérisateur avec 2 à 3 mL de 100 % MeOH jusqu'à ce qu’apparaisse la tête de pulvérisation nettoyer.
Remarque : Un fin brouillard de gouttelettes de matrice est autorisé à s’enfoncer dans le tissu par une feuille gravitationnelle. Une taille de gouttelette moyenne de 20 μm est générée ; tous les diamètres de gouttelettes sont moins de 50 μm.
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La matrice de pulvérisation avec un pulvérisateur automatique
- Vaporiser la solution de matrice sur la surface du tissu avec un pulvérisateur automatique. Un débit constant des gaz (N2, fixé à 10 lb/po2 et 75 ° C) de la gaine chauffée est exécuté conjointement avec le spray de solution de matrice. Utiliser un système de pompe solvant (fixé à 10 lb/po2 et 0,15 mL/min) pour fournir la solution de matrice.
Note : Surtout, travailler sous une hotte pour éviter toute inhalation d’aérosols de la matrice de sécurité. Contrôler la température ambiante et l’humidité pour reproduire la cristallisation de la matrice homogène.
- Vaporiser la solution de matrice sur la surface du tissu avec un pulvérisateur automatique. Un débit constant des gaz (N2, fixé à 10 lb/po2 et 75 ° C) de la gaine chauffée est exécuté conjointement avec le spray de solution de matrice. Utiliser un système de pompe solvant (fixé à 10 lb/po2 et 0,15 mL/min) pour fournir la solution de matrice.
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Préparation de la solution de matrice
2. MALDI-IMS
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Effectuer ultra-haute spectrométrie de masse.
- Réaliser des expériences d’imagerie haut-débit et haute-résolution spatiale avec MALDI-IMS, équipé d’un ND : YAG de 10kHz (355 nm) laser.
- Pour les mesures de spectrométrie de masse, définir les zones de tissus en utilisant le logiciel de contrôle MALDI et le logiciel d’analyse de données.
- Acquisition de spectres en mode linéaire positif avec une gamme de masses de m/z 2 000 – 20 000 et une résolution spatiale de 20 et 100 µm.
- Pour effectuer l’étalonnage standard, dissoudre l’étalon de peptide et la protéine étalon avec un ratio de 1:4 avec de l’acide alpha-Cyano-4-hydroxyle-Cinnamique (ACSSD) en solution TA30 (TFA ACN:0.1% = 30 : 70) et puis le diluer 10 x. Placer 1 μL d’étalonnage standard sur la diapositive à quatre endroits différents.
- À l’aide de logiciels de l’histologie moléculaire (voir Table des matières), superposition de plusieurs images individuelles pour trouver la corrélation spatiale des signaux différents, tels que les différents peptides Aß co-localisant SPs et les parois artérielles.
3. traitement des données
- Pour l’alignement spectrale, aligner tous les spectres à une liste sélectionnée de m/z d’une précédente publication21.
- Importer l’ensemble de données de MALDI-IMS dans le logiciel d’analyse statistique (voir Table des matières) avec soustraction de base.
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Tracer des zones d’intérêt (ROIs) basé sur des connaissances histologiques.
- Effectuer une analyse univariée pour les intensités moyennes, écarts-types, découvrant de m/z-marqueurs discriminatif (analyse ROC), tests d’hypothèse et découverte d’épididymaire valeurs m/z.
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Créez un plan de segmentation.
- Effectuer une analyse multivariée non supervisée pour la segmentation spatiale de grands ensembles de données et une analyse en composantes pour l’extraction des tendances sous-jacentes.
- Sélectionnez des ROIs anatomiques fondées sur des caractéristiques histologiques, tels que le parenchyme et l’espace sous-arachnoïdien.
- Attribuer les structures comme des ROIs et leur corrélation avec les données traitées du MS afin d’identifier les peptides associés qui ont permis la segmentation de l’image de la région.
Representative Results
Patients atteints de la ma sporadiques avec CAA (n = 5 ; âge moyen = 83,2 y) et âgés de sujets avec plaque sénile gratuit (SP O) et la CAA (n = 5 ; âge moyen = 77,2 y) ont été analysés (tableau 1). Les phénotypes de la CAA de patient #3 ont été plus importants dans cette étude. Distributions de Aβ1-40 et dépôts Aβ1-42 dans le tissu cérébral du patient #3 ont été visualisées avec MALDI-IMS (Figure 1). Il n’y a aucun signal significatif dans le cerveau contrôle incriminés (patients #9 et #10), comme illustré à la Figure 1. Ici, MALDI-IMS clairement visualisé que Aβ1-42 a été préférentiellement déposé comme SPs dans le parenchyme cérébral. En revanche, Aβs plus courts, par exemple Aβ1-36 à 41-1, déposaient préférentiellement sur les zones vasculaires leptoméningées (Figure 1).
Distributions de Aβ40 et Aβ42 étaient encore validées avec IHC à l’aide de coupes congelées adjacentes des tissus. L’anticorps anti-Aβ40 étiqueté CAA (flèches dans la Figure 2 b), qui est en contraste avec la répartition des Aβ42 dans le parenchyme cérébral comme SPs. Pour Aβ1-41, nous sommes les premiers à détecter ce fragment dans le cerveau humain, et nous avons produit des anticorps spécifiques qui peuvent différencier Aβ41 du Aβ40 andAβ4221.
La résolution spatiale de l’ISM-MALDI est généralement le facteur le plus important à être amélioré. Dans la Figure 1 et Figure 2 show MALDI-IMS avec résolution 100 µm pitch et obtenir un profil global de distribution pour une zone relativement large de21. Il est difficile de définir des dépôts amyloïdes exactement à l’espace sous-arachnoïdien, y compris la structure vasculaire. Pour représenter les structures fines de tissus des vaisseaux sous-arachnoïdienne et la surface du cortex, une imagerie MALDI (40 µm : Figure 3; 20 µm : Figure 4 et Figure 5) a été réalisée. En conséquence, MALDI-IMS a clairement démontré que Aβs plus courts, par exemple Aβ1-36 à 41-1, sont distribués dans les parois des artères, ce qui est comparable avec l’IHC.
MALDI-IMS a démontré la répartition détaillée de Aβx-40 et 42-Aβx (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 11pE) dans AD accompagné de cerveau de CAA modérée. Par exemple, alors que Aβx à 40 espèces a montré un profil de distribution similaires à Aβ1-40, Aβx-42 espèces a montré un patron de distribution différent avec Aβ1-4221. Par le protocole actuel, images d’ion unique des peptides bêta-amyloïdes individuels observés avec l’ISM-MALDI sont assignés à espèces Aβ. En revanche, l’acquisition image données puissent être étudiées à l’aide de statistiques multivariées non surveillées afin d’obtenir la segmentation d’images des régions anatomiques d’intérêt pour l’analyse des protéines non définies. Figure 5 montre une carte de segmentation obtenue avec une analyse de k-means bisectrice appliquée à la même section du patient 3 #21. Cette méthode de groupement identifié avec succès les structures ressemblant à des plaque dans le parenchyme (en bleu dans la Figure 5) et des structures vasculaires dans l’espace sous-arachnoïdien (vert dans la Figure 5). Il est intéressant de trouver une petite zone circulaire dans le parenchyme, qui est détecté à proximité une petite artériole dans le parenchyme, ainsi que dans l’espace sous-arachnoïdien (violet dans la Figure 5). Cela est vérifié par des images d’ion unique de ces peptides bêta-amyloïdes individuels dans la Figure 5-5F.
Figure 1 : section du cerveau MALDI-IMS d’une gelée AD/CAA. C-terminal divers tronqué Aβ peptides dans AD grave CAA (patient #3) d’accompagnement sont visualisées dans le panneau de gauche et les contrôles (patient #9 sur le droit et le patient #10 sur la gauche dans toutes les images) dans le panneau de droite. Aβ1-36 à Aβ1-41 se déposent préférentiellement dans les vaisseaux sanguins méningées, tandis que Aβ1-42 et Aβ1-43 sont déposés dans le parenchyme cérébral sous forme de plaques séniles dans le cas où #3, bien qu’il n’y avait aucun signal chez les patients de contrôle' brains (cas #9 et #10). Résolution = 100 μm. Echelle = 5 mm. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Kakuda Al21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : MALDI-IMS de gelée AD/CAA cerveau sections et des parties adjacentes du cortex occipital de cerveaux Alzheimer. (A - C) les coupes congelées de cerveau AD/CAA et sections adjacentes (D et E) du cortex occipital de cerveaux étaient tachés immunitaire et centrées sur artériole et parenchyme cérébral, utilisant des anticorps contre Aβ40 (D: BA27) ou Aβ42 (E: polyclonal anti-Aβ42). Les deux analyses ont démontré que Aβ40 est préférentiellement déposé dans les vaisseaux sanguins leptoméningées (flèches en panneau D) et artérioles dans l’espace sous-arachnoïdien et le parenchyme cérébral formant CAA. En revanche, Aβ42 est principalement déposés au SPs. Pour IMS, résolution = 100 μm. Echelle = 5 mm (A, Bet C) = 5 mm, 500 (D et E). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Kakuda Al21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : MALD-IMS de gelée AD/CAA cerveau sections (patient #3) avec une résolution de 40 µm. Diverses C-terminale et N-terminal tronqué et modifié les peptides bêta-amyloïdes dans AD accompagnant grave CAA (patient #3). Aβ1-36 à Aβ1-41 se déposent préférentiellement dans les vaisseaux sanguins méningées, tandis que Aβ1-42 et Aβ1-43 sont déposés dans le parenchyme cérébral sous forme de plaques séniles. Barreaux de l’échelle = 1 mm (A-B), 2 mm (coin supérieur gauche). Résolution = 40 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : MALDI-IMS de gelée AD/CAA cerveau sections (patient #3) avec une résolution de 20 µm. Ce panneau montre différents C-terminale et N-terminal tronqué et modifié les peptides bêta-amyloïdes dans AD accompagnant grave CAA (patient #3). Aβ1-36 à Aβ1-41 se déposent préférentiellement dans les vaisseaux sanguins méningées, tandis que Aβ1-42 et Aβ1-43 sont déposés dans le parenchyme cérébral sous forme de plaques séniles. Barreaux de l’échelle = 200 μm (a, b, c), 1 mm (coin supérieur gauche). Résolution = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : carte de Segmentation, obtenue par MALDI-IMS d’une section de cerveau AD congelée, révèle plaque sénile putatif, des structures sous-arachnoïdienne de gros vaisseaux et petites artérioles parenchymateux. (A) plan de Segmentation obtenus d’une analyse d’image multivariée des données MALDI-IMS. (B) Bisecting k-means, base d’une analyse clusters identifiés type navire et plaque structures du cortex occipital. Les grappes et les sous-structures et leurs relations sont affichées en tant que nœuds (e.g.,1-0-0). Modèles de localisation de peptide (C) distincte Aβ ressemblant à plaques (bleu), navires sous-arachnoïdienne (verts) et les structures de l’artériole (rouge). Notez que quelques grappes rouges sont également distribués dans l’espace sous-arachnoïdien. Cela est vérifié par des images d’ion unique de ces peptides bêta-amyloïdes individuels à une résolution de 20 µm : Aβ (D) 1-40, (E) bêta-amyloïdes 1-41 et (F) Aβ 1-42. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Cas | Entre les sexes | L’âge au moment du décès | Braak SP | CAA |
| 1 | M | 83 | C | 0,5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
Tableau 1 : données cliniques et anatomopathologiques des AD avec le cas de la CAA et les sujets âgés de SP O. Les prélèvements humains corticales pour IMS et IHC ont été extraites de la banque de cerveaux au Tokyo Metropolitan Institut de gérontologie. Chaque échantillon de cerveau a été prise du cortex occipital de cinq Alzheimer et cinq témoins du même âge. L’étendue des dépôts amyloides tel qu’illustré par un anticorps monoclonal de bêta-amyloïdes a été défini par stades de Braak SP (amyloïde). Au stade O, il n’y a presque aucune plaques séniles tout au long de l’isocortex. Au stade C, pratiquement toutes les zones d’isocortical sont touchés. LES cerveaux Alzheimer sont invariables au stade C. Cette table a été modifiée avec la permission de Kakuda Al21.
Discussion
Ici, nous avons démontré un protocole détaillé et les résultats de la visualisation d’Aβ et de ses isoformes de plusieurs cerveaux autopsiés avec AD et CAA avec MALDI-IMS. Le profil de dépôts de Aβs a été radicalement changé de Aβ1-42 à ses variations N - et C-terminale. Aβ1-41 a été identifié et visualisé dans les cerveaux humains avec le protocole actuel et a été également validé avec IHC21. Considérant que la morphologie des Aβ déposé par IMS avec une analyse à haute résolution (20 μm) doit être en bon accord avec l’IHC, IMS et IHC tout aussi contribuent à distinguer les dépôts Aβ par leur emplacement et le contenu de protéines, ainsi que par leur morphologie. Comme l’expérience entière décrite ici a été réalisée dans le cortex occipital, étudier la localisation des différentes espèces de bêta-amyloïde dans toutes les régions du cerveau va être généralisé avec des expériences futures en utilisant le protocole actuel.
Étapes critiques au sein du protocole sont des étapes de préparation des tissus pour obtenir un ionisation efficace des protéines agrégées dans les tissus du cerveau humain. Une couche de la matrice est nécessaire pour absorber l’énergie du laser et induire la désorption et ionisation des analytes. Dans ce processus, une section entière de tissu est homogènement recouvert de petits cristaux. Cocristallisation homogène de l’analyte et la matrice est cruciale pour l’imagerie de haute sensibilité et sans artefact. Chacune des méthodes de trois pulvérisation a ses propres avantages. Revêtement de spray manuel est l’une des méthodes plus fréquemment utilisées. L’aérographe est commode ; Cependant, elle nécessite une opération habile. Comme une technique expérimentale précise et reproductible est essentielle, à l’aide d’un pulvérisateur à ultrasons et/ou un pulvérisateur automatique tel que décrit dans les protocoles actuels est recommandé. En ce qui concerne un pulvérisateur à ultrasons, il ne sera pas influencé par l’humidité et la température de la pièce car il est pulvérisé dans une chambre. Pendant ce temps, avec un pulvérisateur automatique, résolution spatiale relativement préservée avec bonne reproductibilité est obtenue. En règle générale, la résolution spatiale obtenue avec l’augmentation de trois méthodes dans l’ordre 1) aérographe 2) automatisme et pulvérisateur 3) par ultrasons.
Plus important encore, ce protocole a été généré pour détecter et visualiser les Aβs dans des échantillons de cerveau autopsiés. La visualisation de Aβs avec l’ISM-MALDI chez les souris APP23 qui est générée comme un modèle animal de AD issu de la mutation de type suédois d’application humaine, ont été signalée plus tôt par d’autres avec une méthode existante18,19. Toutefois, l’ancien protocole appliqué à APP23 n’était pas suffisant pour visualiser Aβ dans sa résolution latérale et la sensibilité. Œuvres antérieures discuté que des concentrations élevées de bêta-amyloïdes à l’extérieur de la limite de tissus sont clairement des artefacts dans APP23 d’imagerie avec leur protocole18,19. Cela signifie que ce qu’on appelle « blur » entre real SPs et IMS images en raison de l’étape d’extraction matrice était inévitable avec l’imagerie MALDI-type. Toutefois, dans le protocole actuel, le flou a disparu et chaque spectre représenté chaque SP unique dans le parenchyme du cerveau.
Comme indiqué ici, nous pouvons retracer Aβ1-41 pour la première fois dans l’AD et la cervelle de CAA MALDI-IMS, ainsi qu’avec l’IHC, avec un anticorps spécifique de notre propre génération21. Selon le modèle de traitement de bêta-amyloïdes, Aβ1-38 dérive Aβ1-45 via Aβ1-42, tandis que Aβ1-41 dérive de Aβ1-45 par γ-sécrétase clivage par étape27,28,29,30,31 . Cela signifie que le protocole actuel prend en charge ce modèle. En ce qui concerne les limites de cette technique, nous devons considérer l’hétérogénéité des échantillons du cerveau humain autopsie. L’étape la plus critique, dans un sens, est d’évaluer le tissu cérébral autopsie qualifié avec la preuve éthique. Avec le protocole actuel sur les tissus du cerveau autopsie qualifié, MALDI-IMS permet de suivre individuellement la toute distribution des molécules complexes ayant de multiples modifications, ainsi que des facteurs inconnus réglementant la pathogenèse de la ma, qui doivent encore être défini. En outre, dans la compréhension de la pathogenèse globale de neuropathologie différentes dans les cerveaux humains âgés, il doit être possible d’adopter une approche standard, en combinaison avec les observations cliniques, génétiques et pathologiques dans les maladies neurologiques MALDI-IMS .
Une autre étape critique de MALDI-IMS est le processus d’exploration de données de l’ensemble des données obtenue, qui est toujours beaucoup de temps. Extraction manuelle des données de chaque distribution de pointe oblige les utilisateurs à cliquer sur chaque image et chercher des distributions qui peuvent être corrélés à la morphologie de l’échantillon analysé. La segmentation spatiale automatique peut être utilisée comme première étape du data mining, donnant un aperçu de l’ensemble de données et permettant la détection rapide des traits marquants. Dans cette approche, les similitudes entre les spectres d’une région donnée sont déterminées statistiquement et spectres similaires sont regroupés dans un seul cluster. Tous les pixels sont codés par couleurs selon leur affectation de cluster (Figure 5). Dans la présente étude AD/CAA, la zone d’intérêt est l’espace des dépôts Aβ en plaque parenchymateuse et les structures vasculaires sous-arachnoïdienne et parenchymateux. Les deux sommets distinctifs qui ont été également validées avec IHC étaient les valeurs de m/z de Aβ1-40 et Aβ1-4221. Ainsi, il est facile de trouver épididymaire m/z avec Aβ1-40 et Aβ1-42, qui a déjà été annoté N - et C-terminal Aβ tronquée, ainsi que des peptides inconnues, pour une analyse ultérieure.
Weller et ses collègues ont signalé que Aβ s’accumule dans les parois des vaisseaux, plus autour des artères que les veines autour de21. En outre, il a été proposé que le liquide interstitiel (ISF) comprend Aβs excrétés par le parenchyme cérébral pour le ganglion via un périvasculaires drainage voie22,23,24,25 ,26. Le protocole actuel pour générer une carte de segmentation basée sur un ensemble de données de MALDI-IMS à 20 µm résolution prend en charge l’existence éventuelle de périvasculaires des voies de drainage du cerveau (Figure 5), qui contribuent de manière significative à la CAA en AD21 , 32. en outre, nous pouvons découvrir les protéines marqueur colocalisés avec plaque et vascularisation méningée en calculant la corrélation entre les valeurs de chaque m/z. Dans la compréhension de la pathogenèse globale de neuropathologie différentes dans les cerveaux humains âgés, il doit être possible d’adopter le MALDI-IMS comme une approche puissante en combinaison avec des données d’IHC établies de clinique, génétique, ainsi que des observations pathologiques dans neurologiques maladies.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par la subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (protéine de Brain Aging et démence contrôle 26117004 ; à M.I. et T.M.). Cette recherche a été partiellement prises en charge par le programme de recherche stratégique des Sciences du cerveau de l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED). Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives d’arrivée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
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