Свет лист микроскопии для трехмерной визуализации иммунных клеток человека

Summary

Здесь мы представляем протокол визуализировать клетки иммунной системы, внедренные в матрицу трехмерного (3D) коллагена, с помощью микроскопии свет лист. Этот протокол также рассматриваются как отслеживать миграции клеток в 3D. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в матрице 3D.

Abstract

В естественных условиях, активации, распространением и функции всех иммунокомпетентные клетки происходят в трехмерных (3D) среде, например в лимфатических узлах или тканей. До даты большинство систем в vitro полагаются на двухмерный (2D) поверхности, такие как культура клетки пластин или coverslips. Чтобы оптимально мимических физиологических условиях в пробиркемы используем простой 3D коллагеновой матрицы. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и широко используется в качестве 3D матрицы. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) отличен с высокой скоростью, большие глубины, низкий отбеливания и photocytotoxicity. Кроме того свет лист микроскопии является особенно выгодным для долгосрочных измерений. Здесь мы описываем оптимизированный протокол как создать и обработать человека иммунные клетки, например первичного человека цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и природные убийца (НК) клетки в 3D коллагеновой матрицы для использования с свет лист микроскопии для живых клеток и фиксированных выборок. Процедура приобретения изображений и анализа миграции клеток представлены. Особое внимание уделяется выделить важные шаги и факторы для пробоподготовки и анализа данных. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в 3D коллагеновой матрицы и не ограничивается иммунных клеток.

Introduction

Большинство знаний о миграции клеток происходит от 2D экспериментов^1,2,3, которая обычно проводится в стеклянные или пластмассовые поверхности культуры/изображений блюдо. Однако, в большинстве случаев, физиологические сценарий требует 3D микроокружения, в котором внеклеточного матрикса (ECM) играет решающую роль. ECM не только обеспечивает эфирное 3D структуры для поддержания надлежащего клеток морфологии, но также предлагает выживания сигналов или направленного подсказки для оптимального функционирования многих клеток^4,5

Protocol

Исследования, проведенные для этого исследования с человеческого материала (лейкоцитов сокращения системы камер от человеческой крови доноров) уполномоченным местным этике (декларация от 16.4.2015 (84/15; Профессор д -р Rettig-Stürmer)) и соответствующие руководящие принципы.

1. Подготовка нейтрализованы коллагена раствор (500 мкл)

1. Передача 400 мкл охлажденные коллагена раствор (10,4 мг/мл) в стерильных 1,5 мл трубку под капотом культуры клеток. Медленно добавьте 50 мкл охлажденные 10 x PBS (рН 7,0-7.3) до 400 мкл охлажденные коллагена раствор. Mix решение, нежно черепица трубки.
   Примечание: Все шаги в части 1 должно быть сдела....

Results

Формирования протрузии во время миграции клеток T является весьма динамичный процесс, который является актина зависимых. Чтобы визуализировать выступ формирование первичных человеческих CTL, мы временно transfected mEGFP плавленый белка на этикетке Цитоскелет актина в CTL как описано до¹¹. Один день после трансфекции, клетки были внедрены в коллагеновой матрицы. Стеки изображений были приобретены каждые 40 s с размером шаг 1 мкм при 37 ° C, с помощью микроскопии св.......

Discussion

Большинство анализов в vitro осуществляется на 2D поверхности, например в культуре клеток тарелки, чашки Петри или на coverslips, тогда как в естественных условиях клетки, особенно иммунные клетки, опыт работы главным образом 3D микроокружения. Новые свидетельства показывает, что миграции иммунных клеток отличаются между 2D и 3D сценарии¹⁷. Кроме того выражение профили опухолевых клеток также являются различными в 2D - и 3D-культурной ткани^18,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фибрикол, раствор бычьего коллагена	Advanced Biomatrix	#5133-20ML	Коллагеновая матрица
0,5 М NaOH Раствор	Merck	1091381000	для нейтрализации раствора фибрикола
Ультранизкоплавкая агароза	Affymetrix	32821-10GM	Подготовка образцов с низким содержанием c[Col]
Dynabeads Нетронутые человеческие CD8 Т-клетки Набор	Thermo Fisher	11348D	Выделение первичных человеческих CD8+ Т-клеток из PBMC
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28 для расширения и активации Т-клеток	Thermo Fisher	11132D	Активация популяций CTL
Человеческий рекомбинантный интерлейкин-2	Thermo Fisher	PHC0023	Стимуляция культивируемого CTL
P3 Набор для первичного раствора	Lonza	V4XP-30XX	Transfection
α-PFN1 антитело, кролик, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Plasma membrane	Stain Thermo Fisher	C10045	Флуоресцентная клеточная метка
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Фопсфатный буферный физиологический раствор DPBS Dulbecco	Thermo Fisher	14190250	IF
Бычий сывороточный альбумин	Sigma	A9418-100G	IF
Goat α Кролик 568, IgG, кролик	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Светолистовая микроскопия)	Zeiss	N.A.
Колпак для клеточных культур	Thermo Fisher	HeraSafe KS
Инкубатор для клеточных культур HERACell 150i	Термо Фишер	Н.А.
Центрифуга 5418 и 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Наконечники Pippette	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
15 мл пробирки	Sarstedt	62.554.002
Капилляры 50 & микро; L	VWR (Бренд)	613-3373	Zeiss LSFM Плунжер
для капилляров	VWR (Бренд)	BRND701934	"Штампы с тефлоновым наконечником" LSFM Пробоподготовка
MColorPhast pH tips	Merck	1095430001	для проверки pH нейтрализованных Fibricol
BD Plastipak 1mL шприцев	BD	Z230723  ALDRICH	Альтернативная подготовка образцов
Пластилин для лепки (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Конвертер файлов Imaris	Bitplane	доступен по адресу http://www.bitplane.com	Конвертация файлов изображений в формат файлов Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	доступен по адресу http://www.bitplane.com	Анализ данных 3D и 4D изображений