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Immunology and Infection

मुद्रित Glycan सरणी: छोटे जानवरों में विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी परिचालित की प्रदर्शनों की एक साथ की गई है के विश्लेषण के लिए एक संवेदनशील तकनीक

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यह काम छोटे जानवरों में एंटी-कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी प्रसारित करने के विश्लेषण के लिए छपी glycan सरणी (पीजीए) तकनीक की क्षमता को दर्शाता है ।

Abstract

एक दिए गए व्यक्ति के विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी परिसंचारी की प्रदर्शनियां अक्सर अपनी प्रतिरक्षा स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है । न केवल व्यक्तिगत प्रतिरक्षा हालत आंतरिक और बाहरी संभावित खतरे संकेतों का मुकाबला करने में सफलता निर्धारित करता है, लेकिन यह भी विरोधी glycan एंटीबॉडी प्रसारित की एक विशेष पैटर्न के अस्तित्व (और उनके सीरम वैज्ञानिक स्तर भिन्नता) एक हो सकता है कुछ रोग की स्थिति की शुरुआत और प्रगति के महत्वपूर्ण मार्कर । यहां, हम एक मुद्रित Glycan सरणी (पीजीए) का वर्णन आधारित पद्धति है कि बहुत उच्च संवेदनशीलता के साथ Glycan लक्ष्यों के सैकड़ों उपाय करने का अवसर प्रदान करता है; नमूना है, जो एक आम मौजूद प्रतिबंध जब छोटे जानवरों (चूहों, चूहों, हंसटर, आदि) के लिए मानव रोगों के पहलुओं को संबोधित मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है की एक ंयूनतम राशि का उपयोग करना । इस दृष्टिकोण के एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम बालब/सी चूहों में प्राकृतिक विरोधी glycan एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की पड़ताल से प्राप्त परिणामों को दिखाते हैं । हम यह प्रदर्शित करते है कि प्रत्येक बालब/सी माउस के अध्ययन में शामिल है, आनुवंशिक रूप से समान होने के बावजूद और एक ही स्थिति के तहत बनाए रखा, प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी के एक विशेष स्वरूप विकसित करता है । इस काम के लिए पीजीए प्रौद्योगिकी के उपयोग का विस्तार करने के लिए प्रदर्शनों (विशिष्टताओं) और विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी, दोनों स्वास्थ्य में और किसी भी रोग हालत के दौरान परिचालित के स्तर की जांच का दावा है ।

Introduction

एंटीबॉडी सीधे वायरस1,2 और बैक्टीरिया2,3, के पूरक प्रणाली4,5 सक्रिय करके रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ हमारे बचाव में एक केंद्रीय भूमिका निभा और phagocytosis की बढोतरी6. इसके अतिरिक्त, वे कैंसर लक्ष्यीकरण और घातक कोशिकाओं7के उंमूलन में आवश्यक तत्व हैं, और homeostasis रखरखाव8,9।

प्रतिरक्षा प्रणाली के विकारों10 और कैंसर11-स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों में परिणाम कर सकते हैं । इन सभी रोग स्थितियों आदर्श एक कुशल उपचार के लिए एक त्वरित निदान की मांग । स्व-प्रतिरक्षित विकारों के मामले में, एंटीबॉडी के अधिकांश मामलों में सीरम वैज्ञानिक की उपस्थिति10,12प्रतिरक्षण के निदान के लिए एक कारक है । ये एंटीबॉडी कोशिका की सतह और extracellular के साथ प्रतिक्रिया एंटीजन और, वे अक्सर कई वर्षों के लिए स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रस्तुति से पहले मौजूद हैं10,12. प्रतिरक्षा की कमी और कैंसर भी रक्त परीक्षण है कि या तो एंटीबॉडी, या उनके कार्यात्मक गतिविधि11के रूप में प्रतिरक्षा तत्वों के स्तर को मापने के साथ का निदान कर रहे हैं ।

परिसंचारी एंटीबॉडी और उनके सीरम वैज्ञानिक स्तर के प्रदर्शन की प्रक्रिया की पहचान के लिए एक पूर्वानुमान स्थापित और उल्लेख किया रोग की स्थिति के सभी की प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए सर्वोपरि हैं । हम पहले विभिन्न पशु प्रजातियों में घूम एंटीबॉडी के विश्लेषण के लिए पीजीए तकनीक की क्षमता का प्रदर्शन किया है13-16, सीरम वैज्ञानिक नमूनों की बड़ी मात्रा के उपयोग को कम करने, समस्या से बचने एंटीबॉडी के पार से जुड़े-जेट17 और उच्च-15एंटीबॉडी के एक व्यापक प्रदर्शनों की रूपरेखा के प्रवाह की अनुमति ।

Glycan आधारित immunoassays मुख्य रूप से वातानुकूलित हैं, अंय कारकों के अलावा, मूल और कार्बोहाइड्रेट के उत्पादन, जो लाइगैंडों15,18,19,20 के संबध और बाध्यकारी निर्धारित द्वारा ,21. Glycan आधारित immunoassays निलंबन (microspheres) में विकसित किया जा सकता है15,21,22 या फ्लैट में सक्रिय सतहों15,21,22, २३,२४. पिछले शामिल एलिसा (इन तरीकों के सबसे पारंपरिक) और पीजीए । एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग15,25,26,27में इन तरीकों की तुलना में ज्यादा डेटा नहीं है । हमने पहले इन immunoassays की प्रभावकारिता और selectivity की तुलना प्रोफ़ाइल एंटी-glycan एंटीबॉडी में व्यक्तिगत मानव प्लाज्मा के नमूनों से की है15. ऐसे विरोधी लक्ष्यीकरण के रूप में कुछ एंटीबॉडी के लिए एक/बी रक्त समूह, सभी immunoassays उंहें सांख्यिकीय महत्व के साथ पता लगाने सकता है और वे सकारात्मक एक दूसरे के साथ संबंधित15,18,21। इस बीच, विरोधी P1 एंटीबॉडी मुख्य रूप से पीजीए द्वारा सबसे अधिक भेदभाव की शक्ति के साथ पता चला रहे थे, और विभिंन glycan द्वारा किए गए संकल्पों में कोई संबंध नहीं था आधारित15immunoassays,18, 21. तरीकों के बीच ये अंतर मुख्य रूप से एंटीबॉडी/प्रतिजन अनुपात और glycan उंमुखीकरण15से संबंधित थे । एलिसा और निलंबन arrays और अधिक पीजीए से अधिक विशिष्ट बाध्यकारी के लिए अतिसंवेदनशील होते है क्योंकि इन15तरीकों में एंटीबॉडी पर प्रतिजन के एक अतिरिक्त है । इसके अतिरिक्त, पीजीए में glycans के उंमुखीकरण और एलिसा और निलंबन15arrays में से अधिक प्रतिबंधित है । एलिसा सुविधाजनक है जब अध्ययन glycans के एक सीमित पैनल भी शामिल है । निलंबन arrays के साथ साथ, एलिसा व्यापक परख विंयास के बारे में लचीलापन प्रदान करता है । पीजीए खोज दृष्टिकोण15,18,21,28के लिए असाधारण सुविधाजनक है । इन स्पष्ट फायदे और नुकसान के बावजूद, तीन उल्लेख immunoassays glycan के विभिंन पहलुओं-एंटीबॉडी बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है । अध्ययन के अंतिम लक्ष्य है एक और अधिक उपयुक्त पद्धति के चयन का मार्गदर्शन करेंगे ।

वर्तमान कार्य का उद्देश्य छोटे जानवरों में एंटी-glycan एंटीबॉडी को प्रसारित करने की प्रदर्शनियों के लिए पीजीए टेक्नोलॉजी का उपयोग करना है । एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम यहां मौजूद एक विस्तृत प्रोटोकॉल पीजीए द्वारा वयस्क बालब/सी चूहों में प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की तरह का आकलन करने के लिए ।

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Protocol

1. Glycochips उत्पादन

  1. Microarray तयारी
    1. प्रिंट glycans (५० mm) और polysaccharides (10 µ जी/एमएल) में ३०० mM फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब, पीएच ८.५) 6 में N-hydroxysuccinimide-derivatized ग्लास स्लाइड पर दोहराने, गैर संपर्क रोबोट सरणी का उपयोग (ड्रॉप volume ~ ९०० पीएल) । प्रत्येक स्लाइड में 4 उप-सरणियों (चित्र 1a, रंगों में) 6 बार दोहराया जाता है । हर एक उप सरणी ११२ विभिंन glycan धब्बे, नियंत्रण सहित (8 पंक्तियों × 14 कॉलम) (आंकड़ा 1b) द्वारा बनाई है ।
      नोट: अनुपूरक तालिका 1में Glycan संबंधी जानकारी दी गई है । glycan पुस्तकालय मुद्रण माइक्रोचिप्स के लिए इस्तेमाल किया IBCh टीम के एक दीर्घकालिक सिंथेटिक प्रयास का परिणाम है; संश्लेषण के उदाहरण संबंधित प्रकाशनों में वर्णित हैं29,30,31,३२,३३,३४,३५,३६ ,३७,३८. glycan पुस्तकालय रक्त समूह एंटीजन और सबसे अक्सर होने वाली टर्मिनल oligosaccharides के कुछ शामिल हैं, साथ ही स्तनधारी एन के कोर रूपांकनों और ओ-लिंक्ड नच और glycolipids, ट्यूमर से जुड़े कार्बोहाइड्रेट एंटीजन, और रोगजनक बैक्टीरिया से polysaccharides ।
    2. नमी बॉक्स में स्लाइड मशीन (सापेक्ष आर्द्रता ~ ७०%) कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) के लिए 1 एच ।
    3. अवरुद्ध microarrays: कमरे के तापमान (१०० mm बोरिक एसिड, 25 मिमी ethanolamine, ०.२% (वी/वी) के बीच-20 ultrapure पानी में अवरुद्ध बफर के साथ १.५ एच के लिए स्लाइड ।
    4. glycochip को ultrapure पानी से धोकर उसे हवा से सुखा लें ।
  2. Glycochip गुणवत्ता नियंत्रण
    1. जटिल immunoglobulin तैयारी (CIP, युक्त आईजीजी, आईजीएम और IgA) का उपयोग कर प्रत्येक बैच से दो microarrays का विश्लेषण, µ बकरी विरोधी मानव biotinylated के 10 इम्युनोग्लोबुलिन जी/एमएल समाधान के रूप में एक माध्यमिक एंटीबॉडी (आईजीएम + आईजीजी + IgA), के बाद 1 µ जी/ इसी फ्लोरोसेंट streptavidin संयुग्मी का समाधान (नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के माध्यम से, चरण 2 देखें) ।
    2. स्कैन और विश्लेषण glycochips (चरण 3, glycan सरणी का विश्लेषण देखें) ।
    3. इंट्रा और अंतर चिप सहसंबंध ०.९ से अधिक के साथ microarray बैचों का उपयोग करें ।

2. Glycan सरणी तकनीक

  1. (ultrapure पानी में) निंनलिखित जलीय समाधान तैयार है और उंहें कमरे के तापमान पर स्टोर (25 डिग्री सेल्सियस):
    • बफर-1:1% (डब्ल्यू/v) पंजाबियों में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 1% (v/v) के बीच-20 और ०.०१% (w/v) नण य3
    • बफर-2:1% (डब्ल्यू/वी) BSA में, ०.१% (v/v) के बीच-20 और ०.०१% (w/
    • बफर-3:०.१% (वी/वी) के बीच-पंजाब में 20 ।
    • बफर-4:०.००१% (वी/वी) के बीच-पंजाब में 20 ।
  2. Glycochip व नमुना वडा
    1. मेज पर स्लाइड के साथ भंडारण बॉक्स रखो जब तक वे कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने ।
      नोट: पाउडर मुक्त लेटेक्स दस्ताने का उपयोग करें । glycochip, जहां बारकोड स्थित है कांच स्लाइड के नीचे भाग से हेरफेर किया जाना चाहिए । बारकोड आप सही पक्ष की पहचान करने के लिए, सतह जहां glycans मुद्रित कर रहे हैं के साथ संपर्क से बचने में मदद मिलेगी ।
    2. बॉक्स खोलें, glycochip ले लो और यह गर्मी कक्ष (25 डिग्री सेल्सियस), पहले से ही गीला फिल्टर कागज के साथ वातानुकूलित करने के लिए कक्ष के अंदर नमी निरंतर रखने में जगह है ।
    3. इस बीच, १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में बफर-1 (1:20) के साथ चूहों सीरम पतला । Homogenize सीरम समाधान (5 एस) एक भंवर मिक्सर के साथ ।
      नोट: एक एकल glycochip सतह को पूरी तरह कवर करने के लिए आवश्यक मात्रा लगभग 1 मिलीलीटर है ।
    4. homogenization के बाद, immunoglobulin एकत्रीकरण से बचने के लिए एक पानी स्नान में 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर पतला सीरम मशीन । १०,००० x g और 25 ° c पर 3 मिनट के लिए ट्यूबों केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा और किसी भी उपजी सामग्री को त्यागें ।
    5. glycochip ध्यान से मशीन कक्ष में रखें । glycochip की सतह पर किसी भी अवशिष्ट सामग्री को समाप्त करने के लिए-3 बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए यह मशीन ।
    6. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में glycochip पकड़ो और बफर की कुछ बूंदों के साथ इसे धो-3 एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर । ध्यान से बफ़र फ़िल्टर काग़ज़ का उपयोग करके glycochip सतह से निकालें ।
  3. प्रतिक्रिया: एंटीबॉडी बाइंडिंग
    1. glycochip को मशीन कक्ष में रखें । एक micropipette का उपयोग glycochip सतह पर पतला सीरम नमूना फैला. १.५ एच के लिए ३७ ° c पर कक्षीय आंदोलन (30 rpm) के साथ मशीन । सुनिश्चित करें कि glycochip सतह के सभी शुष्क क्षेत्र पिपेट की नोक का उपयोग पतला सीरम नमूना द्वारा कवर किया जाता है ।
    2. किसी भी अतिरिक्त नमूना निकालें और 5 मिनट के लिए glycochip में बफर-3 पर 25 डिग्री सेल्सियस विसर्जित कर दिया । फिर, बफर-4 (5 मिनट) के साथ एक कंटेनर के लिए glycochip कदम और अंत में धोने (5 मिनट) ultrapure पानी के साथ glycochip । १७५ x g और 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए glycochip के लिए तरल को दूर करने के लिए ।
  4. डिटेक्शन: द्वितीयक एंटीबॉडी
    1. glycochip को मशीन कक्ष में रखें । glycochip सतह पर फैले एक समाधान (5 µ g/एमएल) के बकरी विरोधी माउस (आईजीजी + आईजीएम) संयुग्मित बफर-2 में बायोटिन । 1 एच के लिए ३७ ° c पर कक्षीय आंदोलन (30 rpm) के साथ मशीन ।
    2. असीम अंश निकालें और धुलाई चरणों को दोहराएँ ।
    3. इस केंद्रापसारक के बाद, ४५ मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में glycochip मशीन (30 rpm) 2 µ g/एमएल के साथ इसी fluorochrome-लेबल streptavidin समाधान (बफर-2 में) ।
    4. अंधकार में, असीम अंश निकालें और धुलाई चरणों को दोहराएँ ।
    5. glycochip को हवा से सुखाएं ।
      नोट: Glycochip को जितनी जल्दी हो सके स्कैन करना चाहिए । लेकिन अगर यह धुंधला के बाद तुरंत स्कैन करना असंभव है, glycochips अंधेरे में एक शांत और शुष्क जगह में संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. Glycan सरणी का विश्लेषण

  1. सरणी स्कैन करें
    1. मेज पर glycochip छोड़ जब तक यह अंधेरे में कमरे के तापमान तक पहुंचता है । एक ही समय में, स्लाइड स्कैनर और लेज़र (६३३ एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) को चालू करें ।
    2. microarray होल्डिंग, स्लॉट में glycochip स्लाइड जब तक यह पीठ को छूता है ।
    3. स्कैन glycochip ("आसान स्कैन चलाएं"), और एक के रूप में स्कैन सहेजें "। TIFF "फ़ाइल ।
  2. सरणी ठहराव
    1. ScanArray विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके सरणी को बढ़ाता है । पहले स्कैन की गई छवियां खोलें, "फ़ाइल" को मुख्य विंडो पर "कॉंफ़िगर & फ़ाइल समूह" पर क्लिक करके (चित्र 1b-D)
    2. संबंधित सरणी फ़ाइल टेंपलेट को GAL स्वरूप में लोड करें (कांच स्लाइड पर मुद्रित glycans का स्वभाव) (आरेख 1C) ।
    3. ध्यान से छवि में धब्बे के साथ सरणी (ग्रिड) संरेखित करके GAL टेम्पलेट समायोजित करें और ठहराव (चित्र 1 d) आरंभ ।
    4. ठहराव पैरामीटर का चयन करें:
      • ठहराव प्रकार: भागो आसान क्वांट ।
      • ठहराव कृती: निश्चित वृत्ती
      • ऑटो स्पॉट खोजें: सभी विकल्प क्लिक करें
      • सामान्यीकरण विधि: LOWESS (स्थानीय रूप से भारित तितर बितर साजिश चिकनी) ।
    5. के रूप में quantified डेटा सहेजें "। CSV "फ़ाइल (चित्रा 1 डी) । इस डेटा को Microsoft Excel या अंय उपयुक्त अनुप्रयोग का उपयोग करके सामांय स्प्रेडशीट फ़ाइल में स्थानांतरित करें ।
    6. मुख्य सांख्यिकीय विधि के रूप में interquartile श्रेणी (IQR) का उपयोग करें: प्रत्येक ligand और interquartile विचलन (75 वें और 25वें शतमक, या ऊपरी और निचले quartiles Q3 और Q1, क्रमशः) के लिए सभी संकेतों के माध्य (चतुर्थक 2) की गणना.
    7. एक पदानुक्रम clustering Explorer अनुप्रयोग का उपयोग करके डेटा की सहभागी अन्वेषण निष्पादित करें ।
    8. clustering पैरामीटर का प्रयोग करें: औसत लिंकेज (UPGMA) और समानता दूरी उपाय के रूप में इयूक्लिडियन दूरी । पदानुक्रम के बिना सामान्य पंक्तियों द्वारा clustering निष्पादित करें ।

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Representative Results

यहां, हम प्रतिनिधि 20 बालब की आबादी में प्राकृतिक विरोधी glycan एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की ठहराव से प्राप्त परिणामों का एक सारांश प्रस्तुत/ इस अध्ययन में इस्तेमाल glycochips ४१९ विभिंन glycan संरचनाओं निहित । अधिकांश glycans के रूप में संश्लेषित किया गया-ch 2ch 2 ch 2 nh2 स्पेसर-सशस्त्र ओ-glycosides, के रूप मेंकई मामलों में ch 2 ch2nh2 या-NHCOCH2nh2 glycosides. सभी glycan संरचनाओं उच्च संकल्प (७००-या ८०० मेगाहर्ट्ज) एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, शुद्ध और HPLC द्वारा परीक्षण, उनके > 95% शुद्धता का संकेत द्वारा विशेषता थे । हम एक साथ आईजीएम + आईजीजी विरोधी glycan एंटीबॉडी माउस सीरम की मात्रा में एक प्रतिबंध के कारण निर्धारित किया है । पीजीए में, हम एंटीबॉडी बंधन के एक सकारात्मक संकेत के रूप में ४,००० RFU ऊपर मूल्यों पर विचार (यह मान ~ शीर्ष glycans RFU के 10% है) । इस कार्य में प्रस्तुत परिणाम glycan microarray-आधारित डेटा३९रिपोर्टिंग के लिए दिशानिर्देशों का अधिकांश का पालन करें । केवल 17% कार्बोहाइड्रेट संरचनाओं का प्रदर्शन किया ≥ ४,००० RFU में पीजीए (चित्रा 2, लाल में). glycochips में उजागर glycan संरचनाओं के अधिकांश बालब के विरोधी glycan एंटीबॉडी प्रसारित की प्रदर्शनियों द्वारा मांयता प्राप्त नहीं थे (चित्रा 2, नीले और सफेद में)28. बालब/सी के प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी के संरक्षित पैटर्न बहुत उच्च औसत संकेत एंटीबॉडी बाध्यकारी (≥ १०,००० RFU तालिका 1)28की तीव्रता के साथ 12 अलग glycan विशिष्टताओं, शामिल थे ।

Figure 1
चित्रा 1 : योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (स्केल पर नहीं) glycan सरणी कॉंफ़िगरेशन, मुद्रण, और विश्लेषण । (क) मुद्रित माइक्रोचिप्स ४१९ विभिंन glycan संरचनाओं के एक पुस्तकालय के साथ विकसित कर रहे हैं, एक उचित फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ पता लगाने के बाद । प्रत्येक स्लाइड 4 उप (रंग में) arrays के विभिंन ब्लॉकों में शामिल हैं, 6 बार दोहराया । हर एक उप सरणी ११२ अलग glycan धब्बे (8 पंक्तियों × 14 कॉलम), नियंत्रण सहित द्वारा बनाई है । (ख) एक प्रतिदीप्ति स्कैनर (छवि का तीसरा भाग) का उपयोग कर स्कैनिंग माइक्रोचिप से प्राप्त छवियों का एक प्रतिनिधि उदाहरण । (ग) हर एक उप-सरणी में धब्बों के लिए "ग्रिड" संरेखित करने की प्रक्रिया (ठहराव के दौरान टेम्पलेट समायोजन). (D) प्रत्येक स्थान के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाया जाता है और परिणाम एक सामांय स्प्रेडशीट फ़ाइल में स्थानांतरित किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : बालब के प्राकृतिक परिचालित विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी की प्रदर्शनियों/ माउस सीरम नमूने (1:20) glycochips के साथ मशीन और एक ScanArray रीडर का उपयोग कर स्कैन किया गया । डेटा एक microarray विश्लेषण प्रणाली के साथ विश्लेषण किया गया और परिणाम सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों में व्यक्त किए गए (RFU) माध्य ± माध्य निरपेक्ष विचलन (पागल) के रूप में । नीले और सफेद रंग ४,००० RFU (पृष्ठभूमि) से कम बाइंडिंग संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं; लाल रंग संकेत ≥ ४,००० RFU (सकारात्मक बाध्यकारी) का प्रतिनिधित्व करता है । च: स्त्री; एम: पुरुष (n = 20) । यह आंकड़ा Bello-गिल, डी. एट अलसे reproduced किया गया है । 28. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Glycan
ID (#)		 संरचना सामांय नाम माध्य और RFU के रूप में पागल RFU ≥ ४००० (%)
६० 6-ओ-र-Galβ-एसपीबी ६१११३ ११५६ १००
२७१ Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp ५३६२२ १९३४ १००
८०२ Galβ1-3GalNAc (फरग) β-sp ५१३४८ २३२४ १००
१७६ 3-ओ-र-Galβ1-4 (6-o-र) Glcβ-sp ४३००८ ९३४२ १००
१६६ GlcAβ1-6Galβ-sp ३९१०५ २९९३ ८५
१५० 3-ओ-र-Galβ1-3GalNAcα-sp ३७९४३ ३२३२ १००
४३७ GalNAcα1-3 (Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A (प्रकार 4) ३३८८६ ३१९३ ९०
१२५ 6-बीएन-Galβ1-4GlcNAcβ-एसपी ३२६७४ ५३८९ ९५
१५४ 3-ओ-र-Galβ1-3GlcNAcβ-sp ३२६५१ ३९५४ १००
१७७ 3-ओ-र-Galβ1-4 (6-o-र) GlcNAcβ-sp ३२४९६ ७२१५ १००
२८७ 3-ओ-र-Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ-sp सुलेएक २००६३ ४९६२ ९५
२३४ Galβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ-sp लx १३५७३ २६३५ ८०

तालिका 1: बालब/सी चूहों के प्राकृतिक एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त शीर्ष रैंक glycan संरचनाओं। Glycans में ४,००० RFU ऊपर बाध्यकारी संकेतों के साथ जांच चूहों (n = 20) के कम से ८०% । bsp मतलब aminoethyl, aminopropyl या glycyl स्पेसर. गfuranose; अन्य सभी monosaccharides एक pyranose रूप में हैं; बकवास अवशेष एल विंयास, अंय सभी monosaccharides-डी विंयास है । इस तालिका Bello-गिल, डी. एट अलसे संशोधित किया गया है । २८.

अनुपूरक तालिका 1: glycans की सूची, उनके बालब/सी चूहों (n = 20) के प्राकृतिक परिसंचारी एंटीबॉडी (आईजीएम + आईजीजी) के लिए बाध्यकारी, सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों में व्यक्त (RFU) माध्य ± पागल के रूप में, और अधिक से अधिक पशुओं की संख्या कट ऑफ (≥४००० RFU) । इस तालिका Bello-गिल, डी. एट अलसे reproduced किया गया है । 28. कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए

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Discussion

Glycan microarrays प्रोटीन-Glycan इंटरैक्शन४०का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य उपकरण बन गए हैं. वर्तमान काम पीजीए प्रौद्योगिकी पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए बालब/सी चूहों में विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी के परिसंचारी की प्रदर्शनों की की गई है । चूंकि पीजीए संभावना को जैविक रूप से अज्ञात glycans की बड़ी संख्या में स्क्रीन प्रदान करता है, यह एक असाधारण सुविधाजनक खोज उपकरण13,15,28है । प्रस्तावित विधि को मापने की संभावना प्रदान करता है, एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग में, glycan संरचनाओं के सैकड़ों सीरम वैज्ञानिक नमूना (५० µ एल) की एक कम राशि का उपयोग कर. यह विशेष रूप से छोटे जानवरों के मामले में महत्वपूर्ण है (थोड़ा परिसंचारी रक्त मात्रा), या जब यह रक्त निकालने के लिए आवश्यक है कई बार एक ही प्रयोगात्मक पशु से.

हम प्रदर्शन, प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, कि आनुवंशिक रूप से समान चूहों प्रतिरक्षा समकक्ष के रूप में नहीं माना जाना चाहिए; क्योंकि वे प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी के विभिंन पैटर्न विकसित (केवल 12 glycan विशिष्टताओं का संरक्षण किया गया) । प्राकृतिक विरोधी-कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी की प्रदर्शनियों के बाकी के लिए सीरम वैज्ञानिक स्तरों जांच पशुओं के बीच काफी विविध । नस्ल जानवरों के आंत microbiota का विश्लेषण41 इस विविधता४२,४३,४४,४५,४६समझा सकता है । यदि प्राकृतिक विरोधी glycan एंटीबॉडी के उत्पादन microbiota के प्रतिजनी उत्तेजना द्वारा मध्यस्थता है, और इस के बीच अलग है, तो4चूहों, इन एंटीबॉडी के ठीक विशिष्टताएकसमान नहीं होगा ।

पीजीए विकास के लिए मुख्य दोष अच्छी तरह से परिभाषित glycan संरचनाओं४०,४७का उपयोग है । Glycans जैविक प्रणालियों में उत्पादित विषम४०,४७,४८हैं, और उनके जैव संश्लेषण कार्बोहाइड्रेट एंजाइमों के अंतर अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, glycoforms के विषम मिश्रण में जिसके परिणामस्वरूप, एक अलग शारीरिक गतिविधि४७के साथ प्रत्येक । जटिल संरचना और जैविक प्रणालियों में मौजूद glycans के विंयास उनकी प्रस्तुतियों४०,४७,४८चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । chemo के साथ-एंजाइमी संश्लेषण, glycans प्राकृतिक स्रोतों से अलग arrays विकास४०के लिए glycans के प्रमुख स्रोत होना जारी रहेगा । कम सिंथेटिक पैदावार और नच और glycosphingolipids से जटिल शुद्धिकरण की प्रक्रिया बड़े पैमाने पर मुश्किल४०,४७,४८पर glycans का कुशल उत्पादन करते हैं । इसलिए, उपलब्धता और glycans की कीमतों में एक बहुत ही सीमित हालत के लिए एक खोज उपकरण के रूप में पीजीए के उपयोग का विस्तार किया जा रहा जारी है ।

इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल के भीतर, ज्यादातर glycochip सतह पर समाधान (सीरम, माध्यमिक एंटीबॉडी) के सही वितरण से संबंधित महत्वपूर्ण कदम सावधानी के साथ क्रियांवित किया जाना चाहिए । इस पद्धति की आवश्यकता है, कम से कम, इन समाधानों की 1 मिलीलीटर, homogenously glycochip सतह के सभी शुष्क क्षेत्रों सोख करने के लिए । यह glycan प्रतिकृति के बीच ंयूनतम अंतर प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और भी ठहराव के दौरान अत्यधिक पृष्ठभूमि से बचने के लिए ।

उल्लेख सीमाओं के बावजूद, पीजीए प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संबंधित दृष्टिकोण के लिए एक बहुत ही संवेदनशील उपकरण है glycan बातचीत४०, या एक विशेष प्रयोगात्मक सेटिंग या13हालत में विरोधी glycan एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की स्थिति का अध्ययन करने के लिए, 15,28. यह अध्ययन विभिन्न प्रजातियों (मानव नमूने सहित) 13,15,23,28, परिसंचारी की प्रदर्शनियों की पहचान के लिए एक बहुमुखी पद्धति प्रदान करने के लिए extrapolated जा सकता है विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी ।

हम यह भी संभावना है कि इस दृष्टिकोण जल्दी निदान और रोग की स्थिति जहां एंटीबॉडी glycan संरचनाओं के लिए निर्देशित में से कुछ में प्राप्त उपचार में लाने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए लग सकता है की आशंका है ।

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Disclosures

Nailya Khasbiullinaऔर Alexey Nokel Semiotik LLC के कर्मचारी हैं, जो इस अध्ययन में प्रयुक्त glycochips का आपूर्तिकर्ता है.

Acknowledgments

यह काम "Fondo डी Investigaciones Sanitarias" (वित्तीय संस्थाओं) द्वारा कार्लोस III स्वास्थ्य संस्थान, स्पेनी स्वास्थ्य मंत्रालय से अनुदान PI13/01098 द्वारा समर्थित किया गया था । डीबी-जी को अनुदान समझौता ६०३०४९ (ò) के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) द्वारा वित्तपोषित एक पद डॉक्टरेट अनुसंधान स्थिति से लाभान्वित किया गया । NK, एनएस, और एनबी का काम अनुदान #14 द्वारा समर्थित किया गया था-रूसी विज्ञान फाउंडेशन के 50-00131 । DB-जी को उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मार्ता Broto, जे पाब्लो साल्वाडोर और एना Sanchis के लिए उनके आभार व्यक्त करना चाहता है, और अलेक्जेंडर Rakitko सांख्यिकीय विश्लेषण में सहायता के लिए । "पीएलए डे Doctorats उद्योगपति de la Secretaria d'Universitats मैं Recerca डेल Departament d'Empresa मैं Coneixement de la Generalitat de Catalunya (अनुदान संख्या २०१८ DI 021) के समर्थन के साथ । हम संस्थागत सहायता के लिए CERCA कार्यक्रम/Generalitat de Catalunya का धन्यवाद करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

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