Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך ביופילמים אוראלי על חומרי טיטניום, אסתטיים תותבת שיניים abutments, כולל הניתוח של תאים חיידקיים הכדאיות ומאפיינים מורפולוגי. בחיי עיר מודל המשויך טכניקות במיקרוסקופ עוצמה משמשת לניתוח biofilm אוראלי.
Abstract
שתלים דנטליים ורכיבים תותבת שלהם נוטים מושבת חיידקים, ביופילמים. ושימוש בחומרים המספק הידבקות חיידקים נמוך עשוי להפחית את השכיחות של ההתקדמות של מחלות פרי-השתל. על רקע הסביבה אוראלי המורכבות ואת אורלי biofilm הטרוגניות, מיקרוסקופיה טכניקות הדרושים המאפשרים ניתוח biofilm של המשטחים של שיניים, חומרים דנטליים. מאמר זה מתאר סדרה של פרוטוקולים ליישם לצורך השוואת ביופילמים אוראלי על טיטניום, חומרים קרמיים של התותבת abutments, כמו גם השיטות מעורב biofilms אוראלי ניתוחים ברמות הסלולר מורפולוגיים. המודל בחיי עיר להעריך ביופילמים אוראלי על חומרי טיטניום, אסתטיים תותבת שיניים abutments כפי שמתואר במחקר זה מספק של שימור biofilm 48 שעות, ובכך להפגין הלימות מתודולוגי משביע רצון. מיקרוסקופ multiphoton מאפשרת הניתוח של נציג שטח של biofilm נוצרו על החומרים הבדיקה. בנוסף, השימוש fluorophores, העיבוד של תמונות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton מאפשרת הניתוח של הכדאיות חיידקי אוכלוסיה הטרוגנית מאוד של מיקרואורגניזמים. ההכנה של דגימות ביולוגיות מיקרוסקופ אלקטרונים מקדמת שימור מבני biofilm תמונות ברזולוציה טובה, אין ממצאים.
Introduction
Biofilms חיידקי מורכבים, יופי של מבנית מאורגן קהילות מיקרוביאלי, המאופיינת על ידי מגוון של מינים חיידקים לסנתז1,של מטריצה חוץ-תאית, פעילים ביולוגית פולימר2. הדבקה חיידקית על משטחים ביוטיים או והאביוטיים קודם היווצרות של קרומית הנרכש, המורכב בעיקר glycoproteins הרוק-1,-3,-4. חלש physicochemical אינטראקציות בין המיקרואורגניזמים את קרומית בתחילה הוקמה, ואחריו חזק יותר אינטראקציות בין חיידקי adhesins גליקופרוטאין רצפטורים של קרומית רכשה. גיוון מיקרוביאלי עולה בהדרגה דרך coaggregation של colonizers משנית אל הקולטנים של חיידקים שכבר צורף, ויוצרים קהילה התקדמות1,3,4, 5.
הומאוסטזיס של microbiota את הפה ואת שלה יחסים סימביוטיים עם המארח חשוב לשמירה על בריאות הפה. Dysbiosis בתוך biofilms אוראלי עלול להגביר את הסיכון להתפתחות עששת, מחלות חניכיים2,5. מחקרים קליניים להדגים קשר סיבה-תוצאה בין ההצטברות של biofilm שיניים או שתלים דנטליים לבין התפתחות דלקת חניכיים או פרי-שתל mucositis6,7. ההתקדמות של תהליך דלקתי שמוביל פרי-implantitis ואובדן הסוגר של השתל8.
שתלים דנטליים ורכיבים תותבת שלהם נוטים מושבת חיידקים ו- היווצרות biofilm9. ושימוש בחומרים עם ההרכב הכימי, הטופוגרפיה משטח המספק הידבקות חיידקים נמוך עשוי להפחית את שכיחות והתקדמות של השתל פרי מחלות9,10. טיטניום הוא החומר שהשתמשו בהם לייצור abutments תותבות על שתלים; עם זאת, חומרים קרמיים הוצגו לאחרונה, צוברים פופולריות כחלופה טיטניום בגלל תכונותיהם אסתטי ואת הביו11,12. גם חשוב, חומרים קרמיים קושרו עם פוטנציאל כביכול מופחתת לדבוק מיקרואורגניזמים, בעיקר בזכות שלהם חספוס פני השטח, wettability, אנרגיה חופשית משטח10,13.
מחקרים במבחנה תרמו להתקדמות משמעותית בהבנה של הידבקות חיידקים ירכה תותבת משטחים9,14,15,16,17. עם זאת, הסביבה דינאמית של חלל הפה, מאופיינות על ידי טמפרטורה משתנים, pH וזמינות התזונתי שלה, כמו גם על ידי הנוכחות של כוחות גזירה, אינה לשחזור במבחנה בפרוטוקולים ניסיוניים18, 19. כדי להתגבר על בעיה זו, דרך חלופית היא השימוש בחיי עיר מודלים של ביופילמים, ביתרון השומרת את המבנה התלת-ממדי שמחוץ ניתוח10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
הניתוח של מבנה מורכב biofilm נוצרו על מצעים אוראלי מחייב שימוש טכניקות במיקרוסקופ מסוגל להציג את העניין צפופה שטיחות25. סריקת מיקרוסקופ לייזר multiphoton הוא אפשרות מודרני עבור ניתוח מבנה biofilm26. הוא מאופיין על ידי שימוש אופטיקה לא לינארית עם מקור תאורה קרוב הגל האינפרא-אדום, פעמו עד femtoseconds27. שיטה זו מצוינת עבור התמונה רכישת חומרים autofluorescence או חומרים מסומן על ידי fluorophores, בנוסף תמונות שנוצרו בעזרת אותות אופטי שאינו ליניארי נגזר תופעה הידועה דור הרמונית. בין היתרונות של מיקרוסקופ multiphoton הוא עומק תמונה מצוינת שהושג עם התאים המיזערי הנזק שנגרם על ידי עוצמת האור עירור27.
עבור בדיקת הכדאיות של biofilm על משטחים והאביוטיים על ידי מיקרוסקופ multiphoton, השימוש של חומצות גרעין פלורסנט צבענים עם מאפיינים שונים ספקטרלי, יכולת חדירה של תאים חיידקיים נדרש28. Fluorophores SYTO9 (ירוק-פלורסנט) ו- propidium יודיד (אדום-פלורסנט) יכול לשמש עבור הבחנה חזותית בין חיידקים מתים וחיים28,29,30. Propidium יודיד חודר רק חיידקים עם ממברנות פגום, בעוד SYTO9 מזין תאים חיידקיים עם קרום שלמים ולא פרוץ. כאשר שני צבעי נמצאים בתוך תא, propidium יודיד יש זיקה גדולה יותר עבור חומצות גרעין ומביא SYTO9, סימונו אדום28,30.
על רקע הסביבה אוראלי המורכבות ואת אורלי biofilm הטרוגניות, מיקרוסקופיה טכניקות הדרושים המאפשרים ניתוח biofilm של המשטחים של שיניים, חומרים דנטליים. מאמר זה מתאר סדרה של פרוטוקולים ליישם לצורך השוואת ביופילמים אוראלי על טיטניום, חומרים קרמיים של התותבת abutments, כמו גם השיטות מעורב biofilms אוראלי ניתוחים ברמות הסלולר מורפולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של בית הספר לרפואת שיניים של ריבייראו פרטו, המשתתף מתנדב חתמה על הסכמה בכתב (תהליך 2011.1.371.583).
1. ביופילמים בחיי עיר
-
מבחר של המשתתפים
- בחירת מטופלים לפי קריטריוני ההכללה הבאה: אדם בריא ועם שיניים מלאה אין סימנים קליניים של למניעת מחלות.
- אל תכלול חולים בהתבסס על הקריטריונים הבאים החרגה: הריון, הנקה, עששת, מחלות חניכיים או טיפול אנטיביוטי ב-3 החודשים האחרונים, מעשן או כל מחלה מערכתית יכולה להשפיע על המצב חניכיים.
-
הכנת התקן אוראלית
- שיא הקשת בלסת העליונה באמצעות רושם alginate.
- להכין סוג IV אבן על-ידי הוספת 19 מ ל מים 100 גרם של אבקת אבן. יוצקים את האבן לתבנית alginate ליצור מודל של קשת בלסת העליונה.
- עיצוב, הרכיבו מכשיר אוראלית אקריליק לתמוך דגימות מבחן (טיטניום, דיסקים קרמיקה).
- לפברק אבזמי לפרטים של NiCr חוט (0.7 ממ מ) באמצעות צבת אורתודונטי #139 ומקם אותם על המודל. כדי למקם את המלחציים בין וטוחנות העליון, כיפוף קצה אחד של חוט כל כך הם יוצרים לולאה.
- להתאים את הלולאה באזור papilla interdental. ב. סגרי, הכנס של עקמומיות עדין כדי לא להפריע הנקודות של מגע, עם סגר. הפוך של 90° מקפלים בסוף המלחציים עבור שימור באקריליק.
- כדי להתאים את המלחציים השן הטוחנת השנייה העליון, להתאים את העקמומיות של החוט השלישי צוואר הרחם (שיווי המשקל) כדי ליצור מתאר את השן (דיסטלי) של 90 מעלות מקפלים בסוף המלחציים עבור שימור באקריליק.
הערה: כדי לספק שמירה נאותה/יציבות למכשיר אוראלית, האבזם לפרטים היו מוצבים בין וטוחנות העליון דיסטלי היבט השן הטוחנת השנייה משני צידי לקשת שיניים.
- לתפעל את שרף אקרילי ריפוי עצמי על פי הוראות היצרן והקש שרף אקרילי בין שתי צלחות זכוכית (עם מרווח בעובי 3 מ מ התערב) במהלך שלב פלסטיק, כדי להפוך את גיליון בעובי של 3 מ מ.
- להניח את גיליון אקרילי על האזור עיצור של המודל, לפי התכנון של המכשיר, לקצץ את שרף אקרילי עודפים עם קארבר, לפני הפילמור.
- לפברק דיסקים שעווה שימוש במטריצה מתכתי [10 מ מ בקוטר 2 מ מ עובי (שטח של 78.5 מ מ2)] על-ידי הצבת מותכת שעווה במטריצה ומחכה השעווה לגבש. באופן ידני להטביע 4 דיסקים שעווה לתוך שרף אקרילי, 2 מהם בין וטוחנות את השתיים האחרות לצד השני הטוחנות.
- תן את שרף אקרילי פולימריזציה בסיר לחץ מתחת לגיל 20 psi של אוויר דחוס עבור 20 דקות.
- לסיים את המכשיר אוראלית עם מכשיר חשמלי מעבדת שיניים ו חותך ולהבריק אותו עם גומי מחוספס.
- להתאים את המכשיר להתאמה נכונה בפה שימוש בציוד שתוארו לעיל.
- לפברק אבזמי לפרטים של NiCr חוט (0.7 ממ מ) באמצעות צבת אורתודונטי #139 ומקם אותם על המודל. כדי למקם את המלחציים בין וטוחנות העליון, כיפוף קצה אחד של חוט כל כך הם יוצרים לולאה.
-
הכנה מהדוגמאות טיטניום, זירקונים
הערה: דגימות (n = 14) 10 מ מ קוטר ו- 2 מ מ עובי, יש שטח פנים של 78.5 מ מ2.- פולנית של דגימות משטחים עם sandpapers water-cooled של להקטין דורסנות (600, 1200 ו- 2000 חצץ), למשך כ 20 דקות.
הערה: ליטוש מהדוגמאות בוצעה כדי לתקנן את חספוס פני השטח ב 0.2 µm. - נקי, לחטא את דגימות התקן אוראלית עם סבון נוזלי, מי ברז, ולאחר מכן להשתמש באמבט אולטרא אלכוהול איזופרופיל במשך 15 דקות לייבש אותם עם מגבוני נייר.
- לתקן את דגימות במכשיר אוראלי אוראלית עם 0.1 מ"ל של דבק רעיל דבק חם (איור 1).
- להתקין את ההתקן המכיל את דגימות בחלל הפה.
הערה: המכשיר אוראלית המכיל את דגימות לענידה על 48 שעות. המכשיר היה מוסר ומאוחסנים buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) בעוד המטופל היה לאכול וביצוע ניקוי הפה.
- פולנית של דגימות משטחים עם sandpapers water-cooled של להקטין דורסנות (600, 1200 ו- 2000 חצץ), למשך כ 20 דקות.
2. הערכת הכדאיות חיידקי
הערה: מדגם בגודל n = 10.
- להכין פתרון צובעת על-ידי הוספת 3 µL של SYTO9 (חומצת גרעין פלורסנט צבע ירוק) ו- 3 µL של propidium יודיד (צבען אדום חומצות גרעין פלורסנט) עד 1 מ"ל של סטרילי מים מזוקקים.
הערה: להכין פתרונות מוגן מפני אור. - העברת דגימות צלחת 24-ובכן ולשטוף אותם ביסודיות עם PBS כדי להסיר תאים שאינם מחסידי.
- הוסף את אמצעי האחסון המתאים (1 מ"ל) של הפלורסנט פתרון כדי לכסות את הדגימה המכילות biofilm. הוסף לצבוע בזהירות רבה כדי לא disorganize את biofilm.
- דגירה הדגימה למשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
- לשטוף בעדינות את הדגימה biofilm עם מים מזוקקים סטריליים כדי להסיר כל צבע עודף.
- מקם את הדגימה בקערת זכוכית התחתונה ולבצע סריקת מיקרוסקופ לניתוח biofilm לייזר multiphoton.
הערה: הניתוח של הכדאיות תאים חיידקיים התבצע באמצעות מערכת מיקרוסקופ multiphoton. ידי קרינה פלואורסצנטית של יודיד propidium זוהה באמצעות מסנן עם אורך גל עירור/פליטה של 546/680 nm ו 477/600 nm עבור SYTO9. הגודל של תמונות שהושג היה 5.16188 x 5.16188 מ מ, המתאים 26.64 מ מ2 של שטח כל הדגימה (78.5 מ מ2) או 33.94% מכלל השטח. התמונות שנוצרו מן החלק המרכזי ביותר של המדגם, עם רזולוציה של 1,024 x 1,024 פיקסלים. הערוץ האדום ואת התמונות ערוץ ירוק נותחו בנפרד באמצעות תוכנה פיג'י31. כל תא נבחר בעזרת אחד מכלי הבחירה, האינטנסיביות של זריחה נמדדה באמצעות צפיפות הפיקסלים, הפחתה על רקע תמונה משולבת.
3. ניתוח של הרכב כימי של דגימות על ידי אנרגיה ואנליזת ספקטרוסקופיה (EDS)
הערה: מדגם בגודל n = 3.
- בחר 3 דגימות של כל חומר נטול biofilm בחינה, ולהעריך את ההרכב הכימי 2 תחומים שונים של כל דגימה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצמידים ספקטרומטר ואנליזת אנרגיה, עם מתח קרן אלקטרונים של 10 kV32.
4. ניתוח מורפולוגי של Biofilm חיידקי על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים
הערה: מדגם בגודל n = 1.
- לתקן את biofilm במועט דגימות ב- 2.5% גלוטראלדהיד מדולל במאגר 0.1 M נתרן cacodylate, pH 7.0-7.3, במשך 24 שעות ביממה.
- לשטוף את הדגימה במאגר PBS (ה-pH = 7.6).
- Postfix את biofilm עם 1% אוסמיום ארבע-חמצני לשעה.
- לשטוף את הדגימה במאגר PBS (ה-pH = 7.6).
- מייבשים את הדגימות biofilm בקפידה, לשמור אותם שקוע הגדלת ריכוזי אתנול פתרונות (50%, 70%, 90%, 95% ו- 100%).
הערה: לבצע חילופי אתנול-ריכוז 100% 3. הצעד התייבשות הכולל לוקח בערך 2 h. - העברת דגימות לנקודה קריטית מייבש ולבצע מספר החלפות עם פחמן דו-חמצני (CO2) עד הדגימות יבש.
- להסיר דגימות מיובשים המנגנון והר אותם אל בעלי לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון.
- מעיל לרעוד. להוציא 20 ננומטר שכבת זהב על גבי המשטח של הדגימה תמורת 120 s.
- הכנס את הדיסקים מצופה זהב בבית הבליעה לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון. להשיג תמונות של 5 אזורים שונים של כל הדגימה, ב- 20-30 kV בלחץ משתנה וב -X 650 ההגדלה12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צפיפות קולוניזציה biofilm לאחר 48 שעות של צמיחה בחיי עיר במחקר זה ייצגו את הפרופורציה של האזור להפקר על הדיסקים טיטניום, אסתטיים ביחס לשטח סרוקים הכולל של הדגימה באמצעות מיקרוסקופ multiphoton ( 26.64 מ מ2). איור 2 מייצג את צפיפות מושבת חיידקים על פני השטח של החומרים שנבדקו 3. צפיפות גבוהה יותר של biofilm נצפתה על המשטחים של השחקנים ועל הדיסקים טיטניום במכונה (0.0292 מיקרומטר2 ו מיקרומטר 0.02132, בהתאמה) מאשר בהדיסקים זרקוניה (0.0099 מיקרומטר2; p < 0.05; מבחן Kruskal-Wallis, ואחריו המבחן של דאן).
איור 3 מראה את הכדאיות תאים חיידקיים של משטחי זרקוניה (איור 3A, 3A', ו 3A "), במכונה טיטניום (איור 3B, 3B', ו 3B"), ולהטיל טיטניום (איור 3C, 3 C' , ו ג 3 ") דיסקים. פרוטוקול זה, יודיד propidium לצבוע חומצת גרעין חודר רק חיידקים עם קרום פגום ו, לכן, פולטת אות אדום-פלורסנט הקשורה תאים מתים. SYTO9 חודר לתאי חיידקים עם ממברנה שלם או פרוץ, פולטת אות ניאון ירוק של אורגניזמים חיים. הכדאיות חיידקי הסלולר היה דומה בין החומרים המבחן, עם דומיננטיות של אורגניזמים חיים בכל קבוצות (איור 4). חיים/מתים התאים הפרופורציות היו 2.10 עבור זרקוניה 1.95 עבור טיטניום במכונה, 1.63 עבור טיטניום יצוק.
סדקים, חריצים או פגמים שחיקה המיוצר על פני השטח של כל החומרים במהלך התהליך של ליטוש ו/או עיבוד שבבי נצפו יותר בבירור ב במכונה, יציקה טיטניום דיסקים. ב הדיסקים זרקוניה, אזורים גדולים יותר נצפו עם היעדרות של מיקרואורגניזמים; קטן אגרגטים מיקרוביאלי רב-צורתיות המורכב בעיקר cocci החיידקים, חיידקים filamentous נצפו גם (איור 5A , 5A'). הנוכחות של cocci ואת החיידקים היה מפוזרים על פני השטח של דיסקים במכונה טיטניום (איור 5B , 5B'). דגימות טיטניום יצוק הציג מושבות של מיקרואורגניזמים מעורב במטריצה עם מראה דמוי biofilm על פני השטח (איור 5C ו 5 סי '). פחות חומר מטריקס נצפתה על פני השטח של הדיסקים זרקוניה בהשוואה טיטניום במכונה ודיסקים טיטניום יצוק.
ניתוח הנתונים EDS גילה 70.83% של זרקוניה, 22.84% של חמצן, 4.52% של איטריום ו- 1.57% הפניום ב הדיסקים זרקוניה; 95.16% טיטניום, 3.99% חמצן ו- 0.85% של הפחמן של הדיסקים טיטניום יצוק; ו 89.86% טיטניום, 7.53% חמצן ו- 2.61% של הפחמן של הדיסקים טיטניום במכונה (איור 6).
איור 1 : המכשיר אוראלית עבור בחיי עיר ללמוד. אבזמים לפרטים זוייפו. בחוט מחושל, דיסקים מבחן טיטניום, אסתטיים (10 מ מ בקוטר 2 מ מ עובי) היו מוצבים באופן אקראי באזורים וטוחנות, מוטבעים חלקית בריפוי עצמי שרף אקרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : קרינה פלואורסצנטית תמונות של צפיפות תא החיידק. אלו הן תמונות זריחה של טיטניום צפיפות-אסתטיים (א), (B) במכונה תא החיידק, (ג) יציקה טיטניום דיסקים לאחר 48 שעות בחיי עיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הכדאיות התא של חיידקים דבקה המשטחים. לוחות אלה להראות שהכדאיות התא של חיידקים דבקה המשטחים של המלח (A) ו לחיות תאים חיידקיים על זרקוניה, המלח (B), לחיות תאים חיידקיים טיטניום במכונה, ואת המלח (C) ולחיות תאים חיידקיים על טיטניום יצוק דיסקים מתואר על ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה. תאים חיידקיים מת מוכתמים propidium יודיד (A', ב', ו ג ': אדום-פלורסנט האות). חיידקים לחיות מוכתמים SYTO9 (A ", B", ו ג ": האות פלורסצנטיות ירוק). לוחות A, Bו- C להראות תמונות מיזוג צבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Boxplots המייצג של biofilm תא הכדאיות על החומרים בדיקה שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. מראות אלה של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה של (A, A') מצופה פלטינה, (ב', ב') במכונה טיטניום, ו (C, ג ') יציקה טיטניום דיסקים עם biofilm, פנורמי, קלוז אפ תצוגות, לאחר 48 שעות סיטו . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ניתוח היסודות על ידי אנרגיה ואנליזת ספקטרוסקופיה (EDS). מראות אלו דיסקים זרקוניה (A) (Zr = זרקוניה, Y = איטריום, C = פחמן, O = חמצן, Hf = הפניום); (B) במכונה טיטניום, ו- (ג) יציקה טיטניום דיסקים (Ti = טיטניום, O = חמצן ו- C = פחמן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המתוארים במחקר זה פותחה כדי להעריך את ביופילמים על חומרי טיטניום, אסתטיים abutments תותבות, כולל הניתוח של תא החיידק הכדאיות ומאפיינים מורפולוגי. כדי לבצע זאת, מודל ב באתרו של ביופילמים תוכנן, המורכב התקן אוראלית מסוגל להכיל דוגמיות של החומרים מבחן ולשמור אותם חשופים לסביבה אוראלי דינמי במשך 48 שעות. המכשיר נחשב נוח וקל להוסיף, להסיר, ולנקות על ידי המתנדב. ובכל זאת, זה הראה השפעה מועטה על פונטיקה, אסתטיקה, בעלות נמוכה כדי לבדות ולא היתה, ואפשר שחזור קל של מהדוגמאות ללא הפרעה של המבנה biofilm. יתר על כן, שיטת מותר שימור תאי חיידקים ותקינות של מטריצה חוץ-תאית. המגע של הלשון עם דגימות מאובדן מקרי של הדיסק במהלך הניסוי מגבלות של המודל המוצע בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. על מנת למזער את המגבלות של השיטה, המיקום של הדיסקים במכשיר אוראלית באקראי הופץ; בנוסף, הדיסקים התיישרו עם דבק רעיל דבק חם, אין אובדן מדגם דווח.
בשל הטרוגניות גבוהה חיידקי המינים המאכלסים את סביבת הפה, טכניקות במיקרוסקופ עוצמה נדרשים לניתוח של biofilms colonizing שלה משטחים קשים. מיקרוסקופ multiphoton מספקת מספר יתרונות על פני ניתוחים במיקרוסקופ רגיל או וידאו, כגון רזולוציה תלת מימדי, הטבועה עירור-סגול לחדירה אופטי מעולה, ירידה של photobleaching, נזקי כאשר הדמיה תאים חיים, יכולת לספק מידע כמותי33,34. יתרונות אלה מקורם של עירור גבוהה המותאמות לשפות אחרות של תהליך הקליטה שני הפוטונים, השפעת מוזלים פיזור אור ב דגימות. לכן, מיקרוסקופ multiphoton מאפשר הדמיה רקמות עמוק נזק מינימלי, חניכה של פוטוכימיה היטב מקומי34. דגימה אקראית, נציג מספר שדות הם להיבחר ל מדויקת35,36. סריקת מיקרוסקופ לייזר multiphoton מותר הניתוח של תחומי 5161.88 x 5161.88 מיקרומטר, המקביל ל- 33.94% שטח של הדגימה הכולל. מיקרוסקופיה קונפוקלית לא שימש בשל הצורך עבור מספר גדול של שדות עבור הניתוח נציג ולאחר תקופה ארוכה של הערכה של דגימות. יתר על כן, האות out-of-להתמקד ברקע מוגבל השימוש של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. למרות היתרונות של מיקרוסקופ multiphoton, רק כמה יישומים בתחום מיקרוביולוגית הם דיווחו37,38,39. ביניהם היא היכולת להשתמש בו ככלי מניפולציה; לדוגמה, כדי להשיג אבלציה המותאמות לשפות אחרות, אפופטוזיס/נמק, הלבנה או photoactivation של נפח מוגדר היטב של biofilm תאים26. יישום נוסף של שיטה זו הוא להעריך את היעילות של סוכנים אנטיבקטריאלי נגד מרובים biofilm רכיבים40,25,41.
במחקר זה, הוערך הכדאיות של תאים חיידקיים מודבקת עם צבעי פלורסנט חומצת גרעין, אשר חודרים תאים כפונקציה של שלהם שלמות קרום28. SYTO9 fluorophores, propidium יודיד שימשו הבידול ויזואלי בין חיידקים חיים וגם מתים. כמה מגבלות השימוש של יודיד SYTO9 ו- propidium מדווחים בספרות, כגון הקושי SYTO9 כתם חיידקים גראם שליליים עם ממברנה ללא פגע כי יש לו לחצות את קרום התא שני נוכח מבנה30, 42. לפיכך, תאים חיים יכול לזלזל על ידי צביעת משולב. בנוסף, כאשר SYTO9 לא מוחלף לחלוטין על-ידי propidium יודיד, עלולים להיות שנצפו פלורסצנטיות צהוב במקום אדום תאים חיידקיים30,42. מגבלה נוספת היא הירידה של האות SYTO9 לאורך זמן. מומלץ מיקרוסקופ הבדיקות מבוצעות בתוך 30 דקות לאחר חשיפת צבעי29,30. יש צורך לשקול את רקע זריחה כדי לחשב את עוצמת האות, מאז autofluorescence של המצע ואת הנוכחות של צבע לא מאוגד עלולים להפריע תוצאות30. למרות זאת, מאז מגבלות אלה ידווחו. ובכן, זה אפשרי לקבל את הדגימות מעובד בתוך שצוין קצר, כמו גם באשר בקפידה בחר ולחסר רקע התמונות בעזרת התוכנה פיג'י.
הקרנה ואקום, אלקטרון גבוהה במהלך סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים מייצגים התנאים לוואי עבור דגימות המכילים חומר ביולוגי. בנוסף למאפייני הלא מוליך, biofilm במצבו הטבעי הוא hydrated, אשר משבשת אלקטרון דור וזיהוי במערכת, ויוצרים חפצים43. לכן, דגימות המכילים חומר ביולוגי צריך להיות מוכן כדי להבטיח את שימור המבנה, הולכה של האלקטרונים שלהם,43,44. שלבי פרוטוקול מעורבים קיבעון, התייבשות, ייבוש, וציפוי של דגימות עם חומר מוליך פותחו עם תשומת לב מיוחדת דילולים ולשעה. הקיבעון של החומר הביולוגי בוצעה עם אלדהיד מאגר cacodylate, את קיבוע שאחרי עם אוסמיום ארבע-חמצני, על מנת לשמר את המבנה של biofilm מודבקת45,43,, או46. התייבשות הושגה עם סדרות בסדר עולה של ריכוזי אתנול, עם המים להיות מוחלף בהדרגה על ידי בממיסים אורגניים44. ייבוש עם עיוות מינימלי של האדריכלות biofilm בוצעה דרך נקודת קריטית עם החלפות רצופים של נוזלי CO2 עבור הסרת אתנול, ואחריו המרה של CO2 לשלב גז, הסרה של הנוזל / ממשק גז, חיסול של מתח על45,4644,43,הדגימה. כדי להבטיח את מוליכות האלקטרונים, למנוע או להפחית את הנזק, ותמונה שהממצאים, דגימות היו מצופים בשכבה nm 10-20 של זהב או זהב/פלדיום. בנוסף, ציפוי דגימות עם שכבה דקה של מתכת יכול להפחית את המטען החשמלי שנוצר בתוך הדגימה, לשפר את הניגודיות ולהגדיל תמונות ברזולוציה46.
למרות מספר מגבלות, המודל בחיי עיר המתוארים במחקר זה היה הולם על ההערכה של ביופילמים אוראלי על חומרים טיטניום, אסתטיים, לשמר את biofilm 48 שעות. השימוש fluorophores הקשורים הדמיה על ידי מיקרוסקופ multiphoton מותר הניתוח של הכדאיות תא החיידק בקרב אוכלוסיה הטרוגנית מאוד של מיקרואורגניזמים colonizing החומרים הבדיקה. הטכניקות המועסקים בהכנת הביולוגי קידום שימור מבנית של biofilm ודוגמאות אפשרה רכישת תמונות באיכות גבוהה עבור הפריט החזותי, אפיון מורפולוגי של מיקרואורגניזמים להמדינות .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה חוסה אוגוסטו Maulin מן המעבדה באודות מיקרוסקופ (בית הספר לרפואה של ריבייראו פרטו) על עזרתו הנדיבה עם EDS, SEM ניתוחים ואת אחי מצ'אדו טיישיירה לסיוע טכני נדיב שלו במהדורה וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J.
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M.
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S.
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
