I denne artikel viser vi oprettelsen af klonede kulturer af encellede de tråddannende alge arter indsamlet fra en naturlig felt site.
Det er afgørende at etablere klonede kulturer af mikroalger til brug i undersøgelser af forskellige emner, såsom fysiologi, genetik, taksonomi og Mikrobiologi. Det er således meget vigtigt at udvikle teknikker til at skabe klonede kulturer. I denne artikel viser vi oprettelsen af klonede kulturer af en conjugating alge. Vandprøver er indsamlet fra feltet. Efterfølgende er celler isoleret ved hjælp af et glas kapillær pipette, placeret i medierne, og dyrkes under betingelser, der er egnet til at generere en klonal kultur.
De tråddannende alger (i rækkefølgen Zygnematales), har også kendt som conjugatophytes, en Fylogenetisk nøgleposition som den nærmeste levende slægtninge af de umiddelbare forfædre af jord planter1,2. Etablerede klonede kulturer af alger har ført til en bred vifte af taksonomiske, fysiologiske og genetiske undersøgelser i de seneste år. Isolation teknikker af mikroorganismer fra en naturlig felt har en lang tradition3,4. I de seneste år etableret automatiseret isolation teknikker, der anvender flowcytometri har også været5. Den mest almindelige metode til opnåelse af en enkelt celle til etablering af en klonal kultur er encellede isolation ved hjælp af et glas kapillær pipette6. Denne traditionelle metode kræver dygtighed og en præcis forsøgsplan.
I denne artikel vise vi prøveudtagning af alger fra feltprøver og etablering af klonede kulturer af encellede de tråddannende alger, som Closterium arterne, ved hjælp af et glas kapillær pipette. En vandprøve, der indeholder vegetative celler er indsamlet fra et felt (f.eks., en sø, Dam eller rismark). Cellerne er isoleret fra vandprøven, ved hjælp af et glas kapillær pipette og derefter vasket. Cellerne er kulturperler i et reagensglas, som indeholder kvælstof-suppleret medium (CA medium) på 24 ° C under en 16-h lys: 8-h mørke regime. Denne metode er også velegnet til isolering af andre mikroalger til at generere klonede kulturer.
Med den nuværende metode, blev 9 klonede kultur stammer af Closterium sp. etableret fra 15 celler isoleret fra vandprøve (Inba1), der repræsenterer en 60% succesrate. Identifikation af arter vil blive gennemført i fremtiden af morfologiske observation samt DNA analyser, som Molekylær Fylogenetisk analyse8.
I den aktuelle metode er friskhed i eksemplet vand vigtigt at succesraten. Det er bedre at isolere celler fra vandprøver hurtigst muligt efter feltsamlingen. Selv om cellerne i Closterium arterne (f.eks., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale komplekse) kan opretholdes i vandprøve for omkring 7 d ved at gemme det på 4-8 ° C, er isolering af cellerne ønskeligt dag i samlingen eller næste dag. Det er også vigtigt at fjerne alle forurenende stoffer end target-cellerne, så stiger antallet af vask gentagelser (dvs., > 3 x) kan forhindre en forurening af kulturer af mikroorganismer i jorden og celler.
En begrænsning af denne teknik er, at den medier anvendt i denne protokol (CA eller konditioneret CA medium) ikke er altid hensigtsmæssigt for alle conjugating alger. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at overveje at bruge et andet medium, samt forskellige lys og temperaturforhold. Også, som det er vanskeligt at bevise, om en kultur er vokset fra en enkelt celle, det er nødvendigt at præcist at afhente kun 1 celle, når du overfører celler til et reagensglas. Derfor, det indskydende bør gøres med en ny glas kapillær pipette hver gang.
Oprettelse af en klonal kultur med denne pipette vask metode er en klassisk/standard metode og er den mest pålidelige metode til at bruge til at isolere de ønskede celler for en undersøgelse. Klonede kulturer de tråddannende alger bruges i mange studier8,9,10,11 blev etableret ved hjælp af den nuværende metode. Det er vanskeligt at analysere de tråddannende alger uden en klonal kultur. Desuden, i de seneste år, de novo samlede genom sekvenser blev let at få (f.eks.ved hjælp af MinION nanopore sequencer), og om oprettelse af klonede kulturer vil yderligere lette de novo sekventering. Med andre ord, er denne metode det første skridt i fremtiden studium af disse alger til bedre at forstå deres biodiversitet.
For at etablere en stabil kultur stamme, er det nødvendigt at foretage visse kritiske trin præcist i protokollen. Det vigtigste skridt er udarbejdelse af et glas kapillær pipette med en optimal blænde til at tillade passage af en enkelt celle kun. Blænde af glas kapillær pipette skal være lidt mere end mindre akse længden af cellen af interesse. Optimal glas kapillær pipette kan Aspirér en enkelt celle ved kapillaritet. Men hvis diameteren af blænden er for stor, kapillar vil også trække i ikke-levende forurenende materialer eller endda (en) andre eller mikroorganismerne, ud over målcellen.
For at få et glas kapillær pipette med en optimal blænde, er følgende punkter vigtige at bemærke. Første skal søjle af ild være smalle når varme glas kapillær pipette. Næste, når du trækker Pasteur pipette, det har at blive fjernet fra flammen; ellers, blænde af Pasteur pipette vil kollapse.
Udstyr og beholdere, der er vist i denne protokol er grundlæggende og kan ændres. For eksempel ved hjælp af multi godt plader i stedet for watch briller med et brønd, kan celle vask gøres mere effektiv. Derudover kan andre lignende dem erstattes containerne. Ved at overføre en enkelt celle til næringssubstratet på det sidste trin, kan en klonal kultur etableres.
Forberede en steriliseret container og arbejder i en hætte vil etablere axenic (urørt) stammer. For at forhindre forurening, er det nødvendigt at gentage trinnet vask med friske delprøver mere end 3 x. Sommetider er bakterier også steriliseres ved at tilføje antibiotika15.
Denne metode fokuseret på desmid (Zygnematales) isolation, men ved at ændre størrelsen af glas kapillær pipette blænde, kan det anvendes til isolering af forskellige størrelser plankton.
Vi takker Hisayoshi Nozaki (University of Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Womens Universitet) og Hiroyuki Sekimoto (Japan Womens Universitet). Vi vil gerne takke korrekturlæsere for deres kommentarer. Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for videnskabelig forskning (No. 26440223 og 15H 04413) fra Japan-samfund til fremme af videnskab, Japan, og af et tilskud fra den nye teknologi Development Foundation til Yuki Tsuchikane.
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |