Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin
Summary
Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.
Abstract
La microscopie en fluorescence lumière-feuille a été utilisée pour l’acquisition rapide des images à haute résolution axiale de micromètre à échelle millimétrique. Les techniques traditionnelles de lumière-feuille impliquent l’utilisation d’un faisceau d’éclairage unique réalisé perpendiculairement au tissu de l’échantillon. Images de grands échantillons qui sont produites à l’aide d’un faisceau d’éclairage unique contiennent des rayures ou des artefacts et souffrent d’une résolution réduite en raison de la diffusion et d’absorption de la lumière par le tissu. Cette étude utilise un faisceau d’éclairage recto-verso et une clarté simplifiée optique technique pour coeur murin de compensation. Ces techniques permettent d’imagerie profonde en enlevant des lipides du coeur et produisent un grand domaine de l’imagerie, supérieur à 10 x 10 x 10 mm3. Par conséquent, cette stratégie permet de quantifier les dimensions ventriculaires, suivre la lignée cardiaque et localiser la distribution spatiale des protéines cardiaques spécifiques et des canaux ioniques de la post natal aux coeurs de souris adulte avec un contraste suffisant et résolution.
Introduction
La microscopie en fluorescence lumière-feuille est une technique développée tout d’abord en 1903 et est aujourd’hui utilisée comme une méthode pour étudier l’expression des gènes et aussi de produire des modèles 3D ou 4D, des échantillons de tissus pour1,2,3. Cette méthode d’imagerie utilise une mince feuille de lumière pour illuminer un seul plan d’un échantillon afin que seulement ce plan est capté par le détecteur. L’échantillon peut alors être déplacé dans la direction axiale pour capturer chaque couche, une section à la fois et le rendu d’un modèle 3D après le post-traitement des images acquises4. Toutefois, en raison de l’absorption et la dispersion des photons, LSFM a été limitée à des échantillons qui sont soit une épaisseur de quelques microns ou optiquement transparent1.
Les limitations de LSFM ont conduit à des études approfondies des organismes disposant de tissus qui sont optiquement transparents, tels que le poisson-zèbre. Études portant sur la différenciation et le développement cardiaque sont souvent menées sur le poisson-zèbre, puisqu’il y a des gènes conservés entre l’homme et le poisson-zèbre5,6. Bien que ces études ont conduit à des avancées dans la recherche cardiaque liée aux cardiomyopathies6,7, il y a toujours une nécessité d’effectuer des recherches similaires sur les organismes de niveau supérieures tels que les mammifères.
Chez les mammifères tissu cardiaque présente un défi en raison de l’épaisseur et l’opacité des tissus, l’absorption due à l’hémoglobine dans les globules rouges et les rayures qui se produit en raison de l’éclairage unilatéral de l’échantillon dans le cadre de méthodes traditionnelles LSFM1 , 8. pour compenser ces limitations, nous avons proposé d’utiliser illumination recto-verso et une version simplifiée de la technique de clarté9 combiné avec un indice de réfraction correspondant solution (jantes). Par conséquent, ce système permet l’imagerie d’un échantillon qui est supérieur à 10 x 10 x 10 mm3 , tout en conservant une bonne qualité de résolution axiale et latérale des avions8.
Ce système a été tout d’abord calibré à l’aide de perles fluorescentes disposés dans différentes configurations dans le tube de verre. Puis, le système a été utilisé afin d’imager les cœurs murines postnatals et adultes. Tout d’abord, le coeur de souris après l’accouchement a été imagé à 7 jours (P7) pour révéler la cavité ventriculaire, l’épaisseur de la paroi ventriculaire, les structures de la vanne et la présence de trabeculation. Deuxièmement, une étude a été menée pour identifier les cellules qui seraient différencient en cardiomyocytes en utilisant un coeur postnatal de souris au jour 1 (P1) avec marqué Cre cardiomyocytes et protéine fluorescente jaune (YFP). Enfin, des souris adultes à 7,5 mois ont été projetés pour observer la présence de potassium médullaire externe rénale canaux (ROMK) après la thérapie de gène8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système LSFM et la technique décrite ici utilise un faisceau d’éclairage double face combiné avec une compensation optique d’image au coeur de souris post-natale à adulte stades de son développement. Un faisceau d’éclairage unique traditionnel souffre de diffusion du photon et l’absorption par les tissus plus épais et plus grands échantillons1,3. Les poutres recto-verso fournissent un éclairage plus homogène de l’échantillon, réduisant a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Thao Nguyen et Atsushi Nakano d’UCLA de fournir l’échantillon de souris à l’image. Cette étude a été financée par les STARS de subventions HL118650 NIH (à Tzung K. Hsiai), HL083015 (à Tzung K. Hsiai), HD069305 (pour N. C. Chi et Tzung K. Hsiai.), HL111437 (à Tzung K. Hsiai et N. C. Chi), HL129727 (à Tzung K. Hsiai) et système de l’Université du Texas (à Nancy Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
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