Summary
Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.
Abstract
Miktar DNA metilasyon kullanan glikozilasyonu sonunda, bir tek iplikçikli DNA bağlamda bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır bisülfit sıralama elde edilebilir. Bisülfit sıralama olabilir (PCR kullanarak) hedef veya tüm genom üzerinde gerçekleştirilen ve sitozin metilasyonu tek Bankası çözünürlükte mutlak miktar sağlar. Nükleer ve mitokondrial DNA, farklı doğası özellikle ikincil yapısında göz önüne alındığında, adaptasyonlar bisülfit sıralama yöntemleri için mtDNA sitozin metilasyonu soruşturma yapılması gerekir. MtDNA ikincil ve üçüncül yapısı gerçekten yanlış-mutlak bisülfit tek iplikçikli DNA'için tamamlanmamış denatürasyon zavallı erişim nedeniyle önde gelen eserler sıralama bisülfit yol açabilir. Burada, DNA'ın bir enzimatik sindirim BamHI bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile doğru miktar sitozin metilasyonu seviyelerinde mtDNA izin vermek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Buna ek olarak, biz yönergeleri bisülfit sıralama astar için mtDNA belirli tasarlamak için istenmeyen nükleer mitokondrial bölümlerini hedeflemek önlemek için (NUMTs) nükleer genom eklenmiş.
Introduction
Mitokondrial genom yaklaşık 16,5-kilo Bankası (kb) dairesel, Çift iplikçikli yapısını uzun, bir ağır ve hafif bir tel adıyla aynıdır. Mitokondrial genom her hücresi olarak maternally-miras, birden çok kopya mevcut ve solunum zinciri kompleksleri1temel bileşenlerine kodlar. Benzer bakteriyel genom ve nükleer genom aksine, mitokondriyal genom sayısız ikincil ve üçüncül yapılarını gibi sarmal ve supercoiled yapıları2erişim sırasında sıralama zor hale getirebilir, düzenlenmiştir deneyler3.
Çekirdeğinde, DNA metilasyonu Gen ifadesinin düzenlenmesinde başta olmak üzere çok sayıda süreçlerde bir rol oynayan bir kapsamlı okudu epigenetik işaretidir. Memeli genleri içinde DNA metilasyonu öncelikle deoxycytidines, CG dinucleotides (ya da KSY) üzerinde çoğunlukla pirimidin halka 5 konumunu oluşuyor. Sitozin metilasyonu tüm CpG % 70'i somatik hücreler ve hesapları için toplam % ~ 1 genomu DNA4üsleri bulunur. DNA methylations da EBM, CpT ve TBM gibi sigara CpG bağlamlarda tarif edilmiştir ve embriyonik kök hücre5,6,7tüm metillenmiş cytosines % 25'e kadar değerler ile nükleer DNA çeşitli miktarlarda bulunmaktadır.
Sitozin metilasyonu nükleer genom kopyası yaygın olarak kabul ederken, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyonu varlığını hala tartışmalıdır. İlk çalışma araştıran mtDNA metilasyonu nerede mtDNA metilasyonu kolayca tespit edildi, kültürlü hücrelerde nükleer DNA8' e göre daha alt düzeylerde rağmen gerçekleştirildi. İnsan ve fare hücrelerinde mtDNA metilasyonu de düşük düzeyde (% 2-5) tespit edilmiştir. 5 metilsitozin yakalama tarafından kantitatif PCR takip metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) gibi güvenerek deneyleri kullanarak, mtDNA metilasyonu ayrıca çeşitli fare ve insan algılandı ve çizgiler9,10, hücre 11,12. 5-metilsitozin ELISA tahlil veya kütle spektrometresi karşı antikor kullanarak, DNA metilasyonu önemli düzeyde saf mitokondriyal kesirler13,14,15, tespit edildi 16. ancak, yukarıda belirtilen çalışmalar deneyleri tek Bankası çözünürlükte DNA metilasyon mutlak miktar sağlamak için tasarlanmamıştır teknikleri kullanılır.
Nicel ve resolutive DNA metilasyonu Analizi urasil tek iplikçikli DNA bağlam17 bazlar sitozin dönüştürmek için Sodyum bisülfit mülkiyeti yararlanır "bisülfit sıralama", adlı bir teknik elde edilebilir . Bisülfit sıralama kullanarak, bir takımyıldızı yönünde çalışmaların sitozin metilasyonu çeşitli düzeylerde varlığı tespit etti. D-loop bölgesi, 12'leri veya 16S bölge metilasyonu mtDNA kolayca insan18,19,20,21,22,23 ve fare24 ' te algılandı doku ve hücreler, ancak, ilginç bir değişkenliği çalışmalar genelinde toplam cytosines % 1-20'si ile.
Bu çok sayıda çalışmalar ile karşılaştırıldığında sadece birkaç çalışmalar bizim gruptan da dahil olmak üzere, mtDNA metilasyonu3,25,26,27 varlığı tartışmalı veya biyolojik alaka sorguladı mtDNA düzeyleri (% 2) aşağıda28çok az düzeyde. Son zamanlarda, biz bütün mitokondrial bisülfit sıralama3potansiyel bir bisülfit-sıralama artifakı gözlenmesi bildirdi. Biz böylece metilasyonu düzeyleri overestimating mitokondrial DNA'ın ikincil yapısı bisülfit sıralama, yanlış pozitif neden olabilir kanıt sağladı. Biz burada bir obje bisülfit-dönüşüm mtDNA önlemek için bir protokol sağlar. Bu iletişim kuralı bir basit enzimatik sindirim DNA'ın mtDNA ikincil yapılar bozmaya ve bisülfit sıralama protokol sonrası bisülfit tam erişime izin kullanır. Buna ek olarak, biz bisülfit sıralama analizi için bir eşlik eden bioinformatic boru hattı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Restriksiyon enzimi tedavi
- MtDNA insan mitokondriyal DNA'sını 14258 pozisyonda keser BamHI, Restriksiyon enzimi ile toplam insan DNA'sı kabul ederek linearize.
Not: fare DNA için aynı koşullar altında Restriksiyon enzimi BglII aşağıdaki gibi kullanın. - Her biri için mtDNA metilasyonu değerlendirilmesi, bir 0.2 mL tepki tüp hazırlamak ve (fluorometry tarafından sayısal), aşağıdaki mix: 3 μg genomik DNA eklemek için nerede 15 μL örnek tampon 3, 3 μL BamHI ve su ilâ 150 μL
- 37 ° C'de 4 h için termal cycler tüplerde yer
2. bisülfit dönüştürme
- BamHI tedavi edilen DNA başka bir yerde29açıklandığı gibi Sodyum bisülfit kullanarak dönüştürmek.
- 200-500 ng DNA BamHI tedavi edilen toplam hacmi 20 μL her dönüşüm reaksiyonu için kullanın. DNA kurtarma % 50-70 olduğunu.
- 10 μL elüsyon arabelleği bisülfit dönüştürülmüş DNA elute.
- Tek iplikçikli DNA'fluorometry tarafından ölçmek.
- İsteğe bağlı: protokolü ile kalan geçmeden önce bisülfit dönüştürülmüş DNA-20 ° C'de depolayın. Uzun süreli depolama için bisülfit dönüştürülmüş DNA-80 ° C'de depolayın
3. astar sıralama bisülfit tasarımını
- Astarlar çevrimiçi araçlar Methprimer30 ve BiSearch31,32kullanarak bisülfit sıralama için tasarım.
Not: Methprimer ve BiSearch astar bağlama dizileri genom dizileri aramak için nereye cytosines thymines, benzer şekilde sonrası bisülfit tedavi için dönüştürülür izin. - İçin en uygun ve tarafsız güçlendirme, amplicon boyutu 100-300 bp arasında tasarım ve astar KSY dinucleotides kaçının.
- Tasarlanmış astar mitokondrial DNA'yı BiSearch'ın işlevini Astar aramakullanarak belirli olduğundan emin olun. Zaten tasarlanmış bisülfit dönüştürülmüş astar yerleştirin, tıkırtı belgili tanımlık bisülfit kutu ve başvuru genom ve PCR parametreleri de ekleyin.
Not: Olası PCR ürünlerinin bir listesini görüntüler. - 1-5 astar dizileri üst kopyalayın ve oligonükleotid sentezi için bir sipariş formu içine yapıştırın.
Not: İnsan listesini ve laboratuar ortamında doğrulandı fare mtDNA astar dizileri Tablo 1' de görüntülenir. - Bisülfit kullanarak test astar 4. adımda açıklanan özel jel elektroforez izleyip PCR dönüştürülür. Test ve tüm astar çiftleri ayrı ayrı optimize etmek ve doğru amplicon boyutu üzerinde özel jel görünür sağlamak.
Not: çoğullama astar gerekiyorsa, birden çok astar bir PCR reaksiyon tek ve özel jel elektroforez ya da, daha resolutive bir yöntem gibi benzer ürünlerin ayırt etmek için polyacrylamide Jel Elektroforez, PCR ürünlerde görselleştirmek ekleme boyutu.
4. bisülfit PCR ve jel ayıklama dönüştürülür
- Faiz bölgelerinde yükseltmek için PCR sıcak başlangıç Taq polimeraz kullanarak gerçekleştirin. Kısaca, DNA, 500 µM anlam ve anti-anlamda astar, 1 µL dNTP mix (her dNTP 10 µM) ve polimeraz 7.5 U/tepki olarak toplam hacmi 50 µL., mix 100 ng dönüştürülür çalıştırmak PCR ile aşağıdaki koşullar: 95 ° C'de 5 dk (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 döngüleri; 10 dk 72 ° C. Astar ya da ayrı ayrı kullanın veya multiplexed. - İsteğe bağlı: astar çoğullama zaman kullanım 200 ng DNA ve aşağıdaki Bisiklet koşullarını dönüştürülür: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 döngüleri; 10 dk 72 ° C.
Not: Sıcaklık astar erime sıcaklığı bağlı olarak değişebilir. - Konu PCR ürünleri üzerinde % 2 özel 100 volt Elektroforez jel.
- Nazik UV ışık altında PCR ürünleri bir neşter ile ayıklamak ve mikrotüpler için ekleyin. PCR ürünleri DNA hasarı önlemek için aşırı UV ışık için maruz bırakmayın. Pozlama süresi 30 'un üzerinde kaçının s.
- PCR ürünleri3daha önce açıklandığı gibi jel arıtma kullanarak arındırmak.
- 4.5. adımdaki saf DNA ölçmek fluorometry kullanarak. Adım 5 ya da mağaza örnekleri-20 ° C'de geçin
35 döngüleri; 10 dk 72 ° C. Astar ya da ayrı ayrı kullanın veya multiplexed.5. bisülfit Kütüphane hazırlık sıralama
- Kütüphane hazırlık bisülfit dönüştürülmüş PCR ürünlerinin gerçekleştirin.
İsteğe bağlı: Bu aşamada PCR ürünleri multiplex. - Son onarım ilâ 100 kullanarak gerçekleştirmek ng PCR ürünü. 55,5 µL PCR ürünü 0.2 mL tüp içinde 3 µL son hazırlık enzim ve 6.5 µL son onarım tepki arabellek (10 x) ekleyin. Yerleştirin ve 65 ° C'de 30 dk ardından 20 ° C'de 30 dk için termal cycler tüpte kuluçkaya
- Sıralama adaptörleri 15 µL Blunt/TA ligaz ile karıştırın, 2.5 µL sonunda tamir DNA karıştırılarak ligate adaptör ve 1 µL ligasyonu artırıcı. Kullanıyorsanız < 100 ng PCR ürünü olarak giriş, seyreltik adaptör 10 kat.
- Bir termal cycler mix (adım 5.3) yerleştirin ve 20 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Termal cycler duraklatmak ve 3 µl Kullanıcı eklemek tüp enzim. Mix ve tüp içinde geri termal cycler yerleştirin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
- Boyutu adaptör bakmaksızın DNA katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk boncuk DNA PCR ürünü boyutuna bağlı olarak değişen oranlara sahip kullanarak seçin.
- 13.5 µL H2O adaptör bakmaksızın DNA için adım 5.4 ve 55 resuspended µL SPRI boncuk ekleyin. 5 min ve yer tüp manyetik bir stand için oda sıcaklığında kuluçkaya. Çözüm açık olduğunda, süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve boru boncuk içeren atın.
Not: Adaptör bakmaksızın DNA süpernatant içerir ve büyük istenmeyen parçaları için atılan boncuk bağlı. - 25 resuspended µL SPRI boncuk 5.6 adımından süpernatant için ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Tüp manyetik sandalyesine koyun ve çözüm açık olduğunda süpernatant atın.
Not: adaptör bakmaksızın DNA boncuk için bağlı olduğu, ancak atılan süpernatant istenmeyen DNA içerir. - Tüp manyetik kürsüye olmakla birlikte, boncuk yıkamak için 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ekleyin. 30 kuluçkaya s ve Kaldır ve atma süpernatant. Toplam 2 yıkama için bu adımı yineleyin.
- Tüp manyetik stand ile açık bir kapak açıkken kuru boncuk 5 min için hava.
- Tüp mıknatıs kaldırmak, DNA 23 µL elüsyon arabelleği elute ve karıştırın. 2 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve çözüm açık olduğunda, pre-PCR güçlendirme (adım 5.14) için bir 96-şey PCR tabak 2 µL aktarmak.
- Geri kalan yaklaşık 21 µL PCR güçlendirme (adım 5.17) için yeni bir 0.2 mL tüp aktarın.
Not: herhangi bir boncuk boncuk sonraki adımlar Enzimatik reaksiyonları inhibe olabilir gibi aktarmak değil emin olun. - Adım 5,14 ya da mağaza örnekleri-20 ° C'de geçin
- Pre-PCR güçlendirme adaptör bakmaksızın DNA yükseltmek için gerekli devir sayısını tahmin etmek için RT-qPCR tarafından gerçekleştirin. 96-şey PCR sayfalarımızda plaka içeren 2 µL DNA (adım 5.11) tepki ekleyin: 0.4 µL Dizin astar, 0.4 µL evrensel PCR astar, 7.2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR ana karışımı.
- Plaka bir gerçek zamanlı PCR makinesinde yerleştirin ve plaka için aşağıdaki koşullar Konu: 30 s 98 ° c (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 döngüleri; 5 dk 65 ° c
- Her örnek için bir Ct-öncesi amplifikasyon RT-qPCR PCR reaksiyon doğrusal aşamasının sonuna karşılık gelen Ct değerini çıkararak gerekli amplifikasyon döngü sayısı tahmini.
- Adım 5.12 adaptör bakmaksızın DNA'dan karıştırılarak yükseltmek: 21 µL DNA, 25 µL PCR ana karışımı, 1 µL Dizin astar, 1 µL evrensel PCR astar ve 2 µL H2o Termal cycler içinde her örnek için aşağıdaki koşullar Konu: 30 s 98 ° c (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [adım 5,16 hesaplanan Ct] döngüleri; 5 dk 65 ° c
Not: yalnızca bir dizin astar örnek başına çoğullama için izin vermek için kullanmayı unutmayın. Dizin PCR sırasında eklenir. - Güçlendirilmiş DNA SPRI boncuk arındırmak ve 22 µL elüsyon arabellekte elute.
- Kütüphane kalite jel elektroforez veya alternatif yöntemi tarafından kontrol. Doğru kitaplığa en yüksek boyutları (PCR ürün (ler) boyutu artı adaptör) arayın.
- Smear analizi ile Kütüphane ürün (ler) ortalama baz çifti boyutunu tahmin etmek: Gelişmiş genel ayarları'nda, "tablo" karalama analiz altında çift tıklatın. 100-1000 bp bölgesinden tanımlamak ve Tamam' ı tıklatın. Bölge tabloaltında tanımlanmış bölge görünür ve Kütüphane ortalama boyutu (bp) hesaplanır.
- Kütüphaneler tarafından fluorometry ölçmek. Adım 6 veya mağaza kitaplıklara-20 ° C'de devam
6. sonraki üretimi sıralaması
- NM konsantrasyon kütüphanelerin formülü kullanarak hesaplar:
- Aynı nM konsantrasyon örneğin 2 nM için kitaplıklarına seyreltik (4 seçin nM, 2 nM, 1 nM veya 0.5 nM kitaplığına konsantrasyonları bağlı olarak). Bir havuz 2 nM kütüphanelerin elde etmek için tüm kitaplıkları havuz.
- Denatüre ve sıralama araç kılavuz aşağıdaki kütüphaneleri oranında seyreltin. Kısacası: 0.2 N NaOH ekleyerek 2 nM havuz tabiatını ve 5 dk. Dilute denatüre havuzun 10 de son bir seyreltme için oda sıcaklığında kuluçkaya. Denatüre ve 12: 17 son bir seyreltme için piyasada bulunan bir denetim kitaplığı oranında seyreltin. Yeni bir tüp 10 de havuzu % 20 12: 17 denetim kitaplığı ile karıştırın.
Not: Bisülfit dönüşüm çok düşük karmaşıklık getirir. % 20 denetim kitaplığı spike-daha iyi sıralama kalitesinde neden olur. - 150 bp eşleştirilmiş uç sıralama derin sıralama aracı kullanarak çalıştırın.
7. sayısal analiz - tahmin metilasyonu düzeyleri
- .Fastq dosyaları (burada sample1_R1.fastq.gz ve sample1_R2.fastq.gz denir) oluşturmak, bismark dizini ilgi tüm genom kopyası oluştur (burada bismarkIndexadında bir klasör içinde) ve chrM genom dizisini fasta içinde kullanılabilir olduğundan emin olun biçimi (burada chrMadında bir klasör içinde).
- Okuma bağdaştırıcıları ve astar tarafından tanıtılan önyargı kaldırmak için ön işlemden: Trim_galore33aracını kullanın. İki nükleotid 5' sonundan ileriye ve geriye doğru okuma kaldırın.
trim_galore--clip_R1 2 - clip_R2 2 -Ey. /--trim1--eşleştirilmiş sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Bismark34 kullanarak tüm genom önceden işlenmiş okuyan Hizala
Bismark--kırlangıç--bam -ey. /. / bismarkIndex / -1 -2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz
Not: başka bir aligner kullandıysanız, benzersiz olarak hizalanamaz okuma atılır emin olun. - Özü kromozom M, burada Samtools35 kullanarak eşleme okur
samtools -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sıralama
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
samtools Dizin sample1_sorted.bam
samtools göster -u sample1_sorted.bam chrM | samtools - n - O BAM -o sample1_chrM.bam sıralama - Metilasyon bilgileri ayıklamak
bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--kapsamlı--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - .bedgraph, .cov veya CX_report.txt dosyalar daha fazla çözümleme için kullanın. Sample1_chrM.CX_report.txt dosyasını, görselleştirme ve sınamak için kullanın.
- Birden çok bölge sorguya ve astar önyargı eşleme sırasında oluşturulan M-önyargı parsellerde görülebilir daha fazla önişleme adımda, kırpma gerçekleştirin. Daha fazla bilgi için Bismark belgelerine bakın.
8. sayısal analiz - Test farklılıklar
- CX_report.txt dosya için her C kromozom M üzerinde 7 sütunlar, kromozom (burada chrM), konumu, strand, metillenmiş okuma sayısı, bazlar okuma, C bağlam ve çevresindeki sıra, içerdiğinden emin olun.
- CX_report chrM tamamını kapsayan olarak güçlendirilmiş region(s) için alt küme küme kontrol edin.
- Parametrik olmayan testler örnekleri, bir balıkçılar'ın tam test bireysel C için veya bir bütün bölge için bir işareti test gibi arasındaki farklar için kullanın.
Not: Miktar çoğu zaman neden normallik varsayarak uygun olmaması neden olduğu % 0 metilasyonu yakın olacaktır. - Benzer şekilde, görselleştirme için quantil görselleştirmek veya binom oran güven aralıkları hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol iki adımda mtDNA metilasyonu soruşturma zaman önemlidir. 1) 2) mitokondriyal DNA özgü astar tasarım ve ikincil yapı açılmasına.
İnsan genomik DNA Restriksiyon enzimi BamHI (Şekil 1) ile sindirerek, mitokondriyal DNA yapısı nükleotit konumda 14,258 kesilir ve ikincil yapı açılacak.
Bisülfit dönüşüm bir bozulmamış mtDNA ikincil yapı ile olası bozulma mtDNA unconversion oranı abartma muhtemeldir. Bisülfit sıralama tarafından mtDNA unconversion oranı araştırıldı, sindirilmemiş ve toplam DNA Mitokondrial genom 5 farklı bölgelerinde, insan iskelet kas hücrelerinden sindirmek: deplasman döngü (D-Loop), tRNA Fenilalanin ve 12'leri ribozom (tRNA - F + 12'leri), 16S ribozom (16S), NADH dehidrogenaz 5 (ND5) ve sitokrom b (CYTB) mRNA kodlama gen (Şekil 2). Unconversion oranı 0'dan - değişiyordu %15,1 karşıdan karşıya tüm incelenen bölge sindirilmemiş mtDNA için. DNA bisülfit dönüşüm önce sindirilmiş, ancak, unconversion oranı en fazla % 1'için tüm bölgeler (Şekil 3) arasında düştü. Böylece, BamHI sindirim tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi önlemek için bisülfit dönüştürmeden önce önemini gösteren.
Kirlenme nükleer DNA Mitokondrial genom yalıtma zaman kaçınılmazdır ve neredeyse tüm mitokondrial genom nükleer genom çoğaltıldıktan sonra bu nükleer olarak adlandırdığı mitokondrial genom nükleer eklemeleri için rise verdi Mitokondrial kesimleri (NUMTs)36. Analiz DNA metilasyonu düzeyleri mitokondrial DNA ve değil NUMTs karşılık gelen emin olmak için mitokondriyal genom özgü astar tasarlamak için en dıştaki önem taşıyor. Şekil 4 astar özgüllük ve Tablo 1 görüntüler insan ve fare mtDNA astar dizileri kontrol etmek için nasıl gösterir.
| Adı | Sıra | Pozisyon | Amplicon boyutu | Tavlama sıcaklığı | Strand | ||
| İnsan | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| BİLGİ: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisens | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| BİLGİ: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisens | |||
| 12'LERİ + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| BİLGİ: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisens | |||
| 466 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| BİLGİ: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Anlamda | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| BİLGİ: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Anlamda | |||
| Fare | |||||||
| 12'LERİ | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| BİLGİ: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisens | |||
| 466 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| BİLGİ: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisens | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| BİLGİ: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129 14307 | 178 | 55° C | Antisens | |||
| 466 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| BİLGİ: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Anlamda | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| BİLGİ: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Anlamda | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| BİLGİ: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Anlamda | |||
Tablo 1: astar dizileri için insan ve fare mtDNA. PCR sıcaklıklarında tavlama astar astar erime sıcaklık farklılıkları nedeniyle değişiklik unutmayın.
Resim 1 : Jel Elektroforez BamHI sindirilmiş veya sindirilmemiş DNA'ın. İnsan iskelet kas genomik DNA tedavi edilmediği veya 4 h 37 ° C için BamHI ile tedavi ve jel elektroforez % 1.5 özel jel üzerinde çalıştırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : İnsan mitokondriyal genom haritası. Bisülfit sıralama ve BamHI Restriksiyon enzimi site tarafından araştırıldı mitokondri genom kopyası bölgeleri görüntülenir. Mitokondrial DNA 13 mRNA'ların, 2 ribozomal RNA ve 22 transfer RNA'lar içerir. Kısaltmalar: PH1: ağır iplikçikli organizatörü 1; PH2: ağır iplikçikli teşvik 2; PL: ışık-strand organizatörü; OH: Kökeni ağır iplikçikli çoğaltmada; EyL: ışık-strand çoğaltmada kökeni. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : BamHI sindirim bisülfit dönüştürmeden önce insan iskelet kas hücreleri mtDNA unconversion ücretine azaltır. Sindirilmemiş ve sindirilmiş mitokondrial DNA unconversion yüzde bisülfit sıralama tarafından sorguya, beş farklı bölgeleri insan iskelet kas hücrelerindeki mitokondri genom kopyası (N= 3). Tam kare CpG siteleri ve açık Meydanı CpG olmayan siteleri temsil eder. Sonuçlar en az en fazla aralığı ile sunulur ve bir işareti test önemli unconversion farklar için test etmek için kullanılmıştır. D-Loop (6-298) P1.83E =-42; D-Loop (279-458): P4.55E =-13; tRNA - F + 12'leri: P8.38E =-16; 16s: P5.91E =-06; ND5: P1.70E =-05; CYTB: P2.69E =-10. D-Loop (6-298) çoğaltma kaynağı içerir ve ağır strand organizatörü 2 tRNA - F + 12'leri içerir. Bu veriler olmuştur başka bir yerde 3yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Bisearch astar özgüllük mitokondrial genom doğru doğrulamak için kullanımı. A) bisülfit dönüştürülmüş astar dizileri BiSearch işlevine astar arama (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch) eklenir. Bisülfit kutusunu işaretli ve başvuru genom seçilir. B) anlam ve antisens zincirleri üzerinde oluşturulan potansiyel PCR ürünleri örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, biz mtDNA metilasyonu sorguya çekmek için özel olarak tasarlanmış bir bisülfit-sıralama iletişim kuralı sağlar. Genomik DNA örneği almak için kullanılan bisülfit-sıralama iletişim kuralları ile farklılıklar bir önceki Restriksiyon enzimi sindirim adım ve bioinformatic analiz kullanımı dışarı yanlış pozitif NUMT dizileri kaynaklanan iktidar yatıyor.
MtDNA metilasyonu soruşturma bisülfit-sıralama yapıları önlemek için bir protokol sağlar. Yanlış-mutlak için önde gelen bisülfit sıralama eserler daha önce raporlanmış37idi. DNA aksesuar proteinler İndinavir K olmuştur tarafından yetersiz kaldırılması37nitelendirdi. Eksik denatürasyon veya kısmi reannealing eksik dönüşüm, menziller için muhtemelen bisülfit tek iplikçikli DNA37, erişim düşürerek yol açabilir. Daha sonra yapının nerede bir ikincil yapı cytosines erişim zarar mtDNA oyunda olabilir. Bizim bilgi en iyi şekilde, Restriksiyon enzimi sindirim adım mtDNA metilasyonu tahmin etme, içeriğinde bisülfit dönüştürmeden önce eklenmesi ilk 20163,28yılında bildirilmiştir. Elimizde çok, bir tek-kesici Restriksiyon enzimi ile önceki sindirim önemli ölçüde Dönüştürülmeyen cytosines3,28tespiti indirdi.
Burada, bir bioinformatic boru hattı bisülfit sıralama sonuçları analiz etmek ve bütün mitokondrial genom bisülfit sıralama Bağlamında bisülfit sıralama yapıları algılamak için sağlamak. Bu yöntem bizim gözlem bu mtDNA kaynaklı olmayan dönüşüm oranı ters derinliği3,28sıralama ile ilişkili. Bu gözlem mtDNA ikincil ve hatta üçüncül yapısı mtDNA özel bölgeler, parçalanma sıralama kitaplıkları inşaatı sırasında bozar ve ayrıca Sodyum bisülfit mtDNA için tam erişim zarar göstermektedir. Sindirim bir kesici enzim ile ikincil ve üçüncül yapıları bültenleri beri bizim sonuçları mtDNA yapısı bisülfit artifakı kaynağıdır ve sitozin metilasyonu mtDNA içinde miktar için burada açıklanan yöntemleri doğrulamak gösterir.
Nükleer DNA Mitokondrial hazırlık kaçınılmaz kirlenme bir meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir. Bu bile performans hedef bağlandığınızda mtDNA, sitozin metilasyonu tahmini önyargı sıralama okuma içinde NUMT dizileri kirlenme ve bütün mitokondrial genom bisülfit sıralama yol açar. Böyle önyargı önlemek için NUMTs adlı metilasyonu ile kirlenme dışlamak için benzersiz bisülfit sıralama astar tasarımı sağlar. Belirli bölgeler insan ve fare mitokondrial genom % 100 kimlik ile NUMTs yayılan ve bu, bu nedenle, belirli mtDNA bölgelerde, benzersiz astar tasarım mümkün değildir. Bütün mitokondrial genom bisülfit sıralama, uzun sıralama işlemi sırasında okuma mtDNA ve NUMTs arasında ayrımcılık dindirebilirim. Benzersiz olarak mitokondriyal genom eşlenen okuma daha da fazla tüm genom ve tek kullanım kaydırılmasını okuma algılama mtDNA metilasyon olun.
Son olarak, bu protokol mitokondrial genom Örneğin, burada DNA'ın ikincil yapısı yapı potansiyel bir kaynak gösterir bisülfit sıralama diğer durumlarda kullanılabilir. Derneğin metilasyon düzeyleri ile sıralama derinlik bisülfit sıralama öncesinde Restriksiyon enzimi ile sindirim karmaşık DNA dizilerinin ihtiyacını değerlendirmek için soruşturma olması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için rakip hiçbir mali ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Novo Nordisk Vakfı Merkezi temel metabolik araştırma Kopenhag Üniversitesi kısmen sınırsız bir bağış Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen bir bağımsız araştırma merkezidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
