Summary
Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.
Abstract
As fêmeas de mamíferos ovulam periodicamente um número quase constante de oócitos durante cada ciclo de cio. Para sustentar tal regularidade e periodicidade, regulamento ocorre no nível do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e no desenvolvimento de folículos nos ovários. Apesar dos estudos ativos, mecanismos de desenvolvimento do folículo não são claros, devido as diversas etapas envolvidas desde a ativação do folículo primordial dormente a ovulação e devido a complexidade de regulamento que difere em cada fase folicular. Para investigar os mecanismos do desenvolvimento folicular e a dinâmica dos folículos durante todo o ciclo do estro, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido ovariano de mouse que pode ser usado para observar o desenvolvimento folicular usando um microscópio. Desenvolvimento sistemático folicular, ovulação periódica e atresia do folículo podem ser reproduzidos no modelo do culto do ovário, e as condições de cultura podem ser moduladas experimentalmente. Aqui, vamos demonstrar a utilidade desse método no estudo dos mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular e outros fenômenos no ovário.
Introduction
Ovários de rato fêmea contenham vários milhares de folículos1e ovulação periódica amadurece aproximadamente dez ovócitos em cada ciclo de cio. Os folículos são classificados em vários estádios de desenvolvimento: primordial, primária, secundária, antral e folículos de Graaf, dependendo da forma da camada granulosa celular ao redor de cada oócito. A maioria dos folículos primordiais são dormentes, e alguns deles são ativados e crescem em folículos primários em cada ciclo de cio2. Após a fase folicular secundária, desenvolvimento folicular é principalmente regulado por gonadotrofinas, foliculares estimulante hormônio (FSH) e hormônio luteinizante (LH). No entanto, desenvolvimento do folículo primário e primordial é independente de gonadotrofinas, e os mecanismos de regulação que regem esses estágios permanecem mal inderstood3,4,5. Além de hormônios e fatores de crescimento, o folículo primário e primordial é regulado pelas interações entre folículos6,7. Portanto, realizamos análises de dinâmica de folículo nos tecidos do ovário de rato e investigou os mecanismos de regulação associados usando culturas de tecido ovariano8,9,10.
Neste documento, apresentamos dois métodos de modelo de cultura de tecido ovariano. O primeiro é usado para analisar o desenvolvimento do folículo por medição de superfícies foliculares, e a segunda é usada para estudar o mecanismo regulatório durante o início do desenvolvimento folicular de primordial para a fase de folículo secundário com ratos transgénicos. Para análise do desenvolvimento do folículo, utilizado principalmente ovários de camundongos fêmeas 4 semana de idade porque permitem fácil visualização dos folículos. Para induzir a ovulação periódica e o desenvolvimento de modelos em vivo do folículo, nós reproduzido o aumento de LH e ovulação observada, atresia do folículo e secreção de estradiol em condições de cultura de tecidos. Imagens dos ovários cultivadas foram capturadas, e os processos de desenvolvimento do folículo foram analisados por mudanças de rastreamento na área folicular. No entanto, nas análises de microscopia de campo claro, a distinção entre folículos primários primordiais e no início era clara. Assim, desenvolvemos um método para detectar pequenos folículos e distinguir entre o primordial, primário, e culta de folículo secundário em tecidos ovarianos usando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovários de camundongos transgênicos R26-H2B-mCherry nos dias 0 e 4 após nascimento11. Oog1 expressão é detectável em oócitos após a entrada em meiose e aumenta gradualmente com o desenvolvimento do folículo, permitindo a observação da transição do primordial de folículos primários usando imagens de lapso de tempo do tecido do ovário culta11 ,12. Embora métodos morfológicos foram usados para estudar os fatores que ativam dormente folículos primordiais13,14,15,16, desenvolvimento do folículo fisiológicas nos ovários é difícil de observar, e os efeitos dos vários fatores permanecem descaracterizados. Os métodos de cultura presente foram projetados para resolver esta escassez nas análises em tempo real dos fatores de alvo.
No presente estudo, nós controladas desenvolvimento folicular usando um método de imagem de lapso de tempo e caracteriza-se o processo de desenvolvimento do folículo. Nossos novos métodos para oferecer uma ferramenta sem precedentes para investigar a fisiologia dos ovários.
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Protocol
Ratos foram alojados em um quarto do ambiente controlado a 23 ± 1 ° C, com um ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Protocolos de cuidados com animais e experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para a experimentação Animal da universidade médica de Aichi e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal incumbente.
1. preparação do meio de cultura e pratos
- Para preparar o meio de cultura básico, adicionar soro fetal bovino (FBS, 5% v/v), FSH (100 MUI/mL), LH (10 mU/mL) e a penicilina-estreptomicina (penicilina, 100 U/mL; estreptomicina, 100 mg/mL) para alfa média essencial mínima (MEM-alfa) e mistura em tubos de 50 mL.
Nota: Volumes totais dos necessários meios de cultura variam entre experiências, mas 1 mL de meio de cultura é geralmente suficiente para pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm. - Despeje a alíquotas de 1 mL de meio de cultura mista em pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm e definir lugar 30 mm celular cultura inserções em pratos. Pré-aquecer pratos em uma incubadora (5% de CO2 e 37 ° C) e mídia.
2. preparação do tecido ovariano
- Tampão de pre-quente fosfato salino (PBS) (−) e alfa-MEM contendo 5% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL em uma incubadora (5% de CO2 e 37 ° C).
Nota: Cerca de 3 mL de PBS (−) de alíquotas por ovário são suficientes para uso durante as dissecções de ovário, e alíquotas de 1 mL de MEM-Alfa são suficientes para armazenamento temporário de um único ovário em pratos de 3,5 cm. -
Impostos especiais de consumo ovários dos 4 semana de idade ratos fêmeas do ICR (nomeado após o Instituto de pesquisa do câncer) e aparar os tecidos ao redor do ovário usando uma tesoura e pinça sob um microscópio estereoscópico. Reservar os ovários removidos em meio de cultura (ver passo 2.1) até o uso.
- Lugar único ovários em papel de filtro umedecidos com pré aquecido PBS (−) (consulte a etapa 2.1) e fatia em 4 pedaços, usando uma lâmina de micrótomo sob um microscópio estereoscópico.
Nota: Os ovários de camundongos 4 semana de idade do ICR são cerca de 2 mm de diâmetro. O número de peças depende do tamanho do ovário; no entanto, cerca de 500 µm e espessura peças permitem observações de folículo adequada (em pedaços mais grossos do que 500 mm, a transparência do tecido é diminuída; em pedaços mais finos do que 500 mm, muitos folículos antrais são quebrados e perdidos). - Após a dissecação, coloque os espécimes de ovário fatiado no meio de cultura previamente aquecido em pratos de 3,5 cm (consulte a etapa 2.1).
- Lugar único ovários em papel de filtro umedecidos com pré aquecido PBS (−) (consulte a etapa 2.1) e fatia em 4 pedaços, usando uma lâmina de micrótomo sob um microscópio estereoscópico.
3. ovário cultura de tecidos
- Deixar aproximadamente 0,5 µ l de meio de cultura por fatias finas de tecido ovariano na inserção da cultura de pilha onde o tecido será definida usando uma micropipeta.
- Coloque cada espécime fatiado em uma gota de meio de cultura sobre as inserções de cultura de células usando uma pinça.
- Cultura de tecidos de ovário em 5% CO2 a 37 ° C.
- Substitua o meio de cultura fresco médio pré-aquecido em 2 dias.
Nota: A agenda de mudanças médias para a cultura de seções de ovário de ratos 4 semana de idade do ICR é apresentada na Figura 1.- Para reproduzir o aumento de LH, trate culturas ovários de camundongos ICR 4 semana de idade, com o meio contendo 100 mU/mL FSH e LH por 12 h a cada 4 dias (Figura 1).
4. microscópio imagens de ovários culturas
- Iniciar os ovários culturas de imagem após o dia 1, quando os tecidos tenham aderido sobre as inserções de cultura de células e realizar análises de microscópio confocal ou invertido em intervalos de 24 h para permitir o crescimento de folículos suficientes entre os pontos de tempo.
Nota: A microscopia Confocal é superior à microscopia invertida para a observação de folículos nos ovários toda cultos.
5. imagem Time-Lapse de ovários culturas
-
Otimize as condições de imagem lapso de tempo, incluindo a intensidade do laser e tempos de exposição, para o sistema da imagem latente (tabela 1).
- Selecione amostras emparelhadas ovário de ratos único para uso como grupos tratamento e controle. Varie a intensidade do laser e tempo de exposição para conseguir as melhores imagens (tabela 1).
- Compare o crescimento do folículo sob cada condição de cultura medindo áreas folículo em imagens de amostras de controle em intervalos de 24 h e em Time-Lapse amostras de imagem (consulte a etapa 6). Simultaneamente, contar o número de oócitos ovulados em cada conjunto de ovário e escolher as condições óptimas de lapso de tempo da imagem latente.
- Capture imagens em intervalos de 30 min, usando o sistema de imagens lapso de tempo, sob determinadas condições (tabela 1).
6. análise de crescimento do folículo
-
Para analisar o desenvolvimento do folículo, medir as áreas do folículo em imagens capturadas utilizando software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inicialmente, defina a escala da imagem clicando em "Como definir a escala" sob "Analisar" na barra de ferramentas. Insira os comprimentos do lado da imagem capturada e os números correspondentes de pixels nos campos em branco de "Distância conhecida" e "Distância em pixels", respectivamente.
- Clique em "Mão livre" na barra de ferramenta e delinear os folículos nas imagens capturadas de campo brilhante.
- Clique em "Medida" em "Analisar" na barra de ferramentas.
Nota: Se outros dados de medição são desejados, clique em "Definir medição" sob "Analisar" na barra de ferramenta e marque as caixas apropriadas na lista.
7. análise do desenvolvimento folicular usando ratos transgénicos
- Colete os ovários de fatia pós-natal dias 0 e 4 (P0 e P4) feminino de ratos transgênicos contendo os transgenes Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherre cultura em inserções conforme descrito em etapas 1.1 – 3.2, exceto não o P0 e ovários P4.
- Substitua o meio de cultura com meio fresco, previamente aquecido em pratos de 3,5 cm na incubadora, contendo 5% CO2 a 37 ° C a cada 2 dias.
Nota: A concentração de LH no meio de cultura de ovários P0 e P4 pode permanecer constante porque não ocorrem picos de LH em camundongos P0 e P4. - Defina o microscópio para visualizar apenas folículos primários AcGFP1 positivo em culta P4 ovários (tabela 1).
Nota: Apenas primordiais e primários folículos estão presentes em ovários de fêmeas de rato de P4. - Capturar imagens de culto P0 Oog1pro3.9/ ovários de camundongos transgênicosR26-H2B-mCherry em intervalos de 30 min usando as configurações usadas para ovários P4 (ver passo 5.2).
- Rastrear e analisar o desenvolvimento folicular usando sinais AcGFP1 e H2B-mCHerry.
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Representative Results
A Figura 1 mostra o protocolo para mudanças nos meios de comunicação durante a cultura de tecido ovariana. Seguir este programa, os ovários de camundongos ICR 4 semanas de idade foram cultivadas e fotografada em intervalos de 24 horas usando microscopia confocal (Figura 2). Durante a cultura de tecidos de ovário durante 3 semanas, mais folículos antrais e secundários foram degenerou por atresia do folículo e alguns eram ovularam (Figura 2D e tabela 2). Na análise das áreas de folículo usando o ImageJ (Figura 3), alguns folículos desenvolveram em grupos durante cada ciclo de pico de LH (Figura 3B e complementar 1 filme). Além disso, ovulação ocorreu quase simultaneamente em separado ovários culturas de ovários direito e esquerdos de ratos único. Considerando que, o momento da ovulação e o número de oócitos ovularam (tabela 2) diferia entre ovários rato (dados não mostrados), ovulação de ovários culturas predominantemente ocorreu dentro de 48 h de picos de LH (Figura 3e complementares Filme 1). No entanto, nem todos os oócitos ovulated lançado primeiros polar corpos após a ovulação (Figura 2 e tabela 2), e embora ovularam oócitos poderiam ser fertilizados, desenvolvimento cessou na fase de 4 células (dados não mostrados). Para elucidar os mecanismos pelos quais dormentes folículos primordiais são ativados em ovários de rato, detectamos a ativação do folículo primordial em tecidos cultivados de ratos transgénicos carregando Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherry (de transgenes Figura 4 Figura 5e complementar filme 2). Oócitos expressam níveis muito baixos do gene Oog1 desde a fase de folículo primordial, e imagem latente de lapso de tempo distingue baixos folículos primordiais AcGFP1-expressando os alta AcGFP1-expressando folículos primários. Folículos primordiais e primários estão presentes simultaneamente em ovários de rato de P4, Considerando que apenas os folículos primordiais estão presentes nos ovários de P0 (Figura 4A, B). Assim, nós aperfeiçoamos o lapso de tempo condições de imagem para detectar apenas folículos primários em culta P4 ovários (Figura 4C). Posteriormente, nós capturamos imagens de ovários de P0 cultivadas por 10 dias nas mesmas condições (Figura 4D – G). AcGFP1 pode ser usado como um índice de folículos primários nestes ratos transgénicos e folículos primários AcGFP1-positivos foram detectáveis no culto P0 ovários após cultura de 30 – 40 h (Figura 4, Figura 5A-Fe complementares Filme 2). Folículos primordiais e primários nos ovários culturas também foram distinguidos por mCherry-positivo núcleos de células da granulosa (Figura 5B, E). Especificamente, mCherry sinais indicam formas de folículos e permitam a observação dos estágios de folículo no culturas ovários (Figura 5B, E e H). Portanto, este sistema de cultura usando ovários de Oog1pro3.9/ ratosR26-H2B-mCherry revelaram o processo do desenvolvimento inicial do folículo de primordial para estágios de folículo secundário. Esses métodos facilitará estudos sobre os mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular independente de gonadotrofinas.
Figura 1 : Curso de tempo médio alterações. A média contém 5% FBS, 100-mU FSH, LH de 10-mU, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL em MEM-alfa. B o meio contém 5% FBS, 100-mU FSH, LH de mU-100, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL em MEM-alfa. Médio B foi usado para produzir picos de LH cada 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens de tecidos ovarianos culturas. Imagens foram capturadas em intervalos de 24 h, utilizando microscopia confocal. (A) cultura dia 1; (B) cultura dia 5; (C) cultura dia 10; (D) cultura dia 13; (E) Magnified imagem da região indicada pelo quadrado em (D); ovócitos em D foram ovularam de folículos indicados pelas setas em B, C e d. (F) oócito, liberando um corpo polar após a ovulação; Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Medições de áreas folículos nos ovários culturas. Imagem do (A) de ovário culta; linhas pontilhadas representam a área medida pelo ImageJ. (B) áreas foliculares no ovário cultivada após 3 semanas; linhas cinzas representam o período da cultura da adição de 100mm LH (aumento de LH). Linhas mostram as etapas de desenvolvimento em cada folículo no ovário cultivo; Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Hematoxilina e eosina (H & E) coloração imagens de ovários P0 e P4 e imagem latente de lapso de tempo. (A) H & E mancha de P0 ovário; (B) H & E mancha de P4 ovário; (C) a imagem de um ovário P4 de um rato transgênico Oog1pro3.6 após a cultura de 10 h. A seta mostra um folículo primário AcGFP1-positivo. (D-G) Imagens de P0 ovários de camundongos transgênicos expressando Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherry; os sinais verdes e vermelhos em D e F representam AcGFP1 e mCherry, respectivamente. Branco de sinais em E e G representam AcGFP1 em D e F, respectivamente. D e E são imagens de ovários cultivadas após cultura 0,5 h. F e G mostram ovários após a cultura de 180 h; Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagens de primordiais, primárias e secundários folículos nos ovários culturas de oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry ratos. (–C) Imagens de folículos primordiais nos ovários de P0 culturas; (D–F) Imagens de folículos primários no ovário cultivo P0; (G–H) Imagens de folículos secundários no ovários cultivadas do mouse 4 semanas de idade. A, D e G são imagens mescladas de B e C, E e F e H e I, respectivamente. Green, AcGFP1; vermelho, mCherry; Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| microscópio | lente objetiva | laser | exposição (ms) | Ganho de | intervalo de tempo | z-pilha | outros | Figuras e filmes |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figura 4-C-G, filme 1 e 2 | |
| BZ-X700 | X20 (com colar da coleção) | 40% | Automático | X4 | 30 min | 10 mm | binning 3x3 | Filme 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | velocidade da câmera: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | ganho de digital, 488 nm: 2, nm:1 564 | Figura 2, 3 e 5 |
Tabela 1: Time-Lapse de imagem condições. Lapso de tempo condição de imagem para microscópios de campo brilhante e confocal.
| Ovário não. | Número de oócitos ovularam totais | Número de oócitos MII |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabela 2: número de oócitos ovularam nos ovários culturas. Números de ovócitos ovularam de doze ovários culturas; MII indica o número de oócitos ovularam que lançou o primeiro corpo polar após a ovulação.
Complementares 1 filme: filme lapso de tempo de um ovário cultivo. Ovários foram coletados de ratos 4 semana de idade e foram cortados e cultivados por 3 semanas. O filme abrange um período de cultura de 0 – 200 h em 10 quadros/s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Complementar Movie 2: filme lapso de tempo de um ovário P0 cultivo de um rato transgénico. Green, AcGFP1; vermelho, mCherry. O filme abrange um período de cultura de 0 – 180 h em 10 quadros/s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Filme complementar 3: Filme lapso de tempo de um ovário cultivo de um mouse 4 semanas de idade. Green, AcGFP1; vermelho; mCherry; o filme abrange um período de cultura de 9 – 13 dias de cultura a 10 quadros/s. As setas na primeira imagem indicam folículos no qual atresia ocorreu durante a cultura. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Neste estudo, desenvolvemos dois novos métodos para o estudo do desenvolvimento folicular em ovários de rato. O primeiro método envolve a cultura de tecidos de ratos adultos ovário fatiado seguido por análises do desenvolvimento folicular, e o segundo envolve o uso de time-lapse de imagem para visualizar o início do desenvolvimento folicular durante a fase independente de gonadotrofinas. Anteriormente, usamos o presente método de cultura de tecido do ovário para avaliar o efeito de fator inibitório de leucemia e progesterona no folículo desenvolvimento8,9e mostrou que seus efeitos variam de acordo com a fase de concentração e folículo. No presente estudo, fatiado tecidos ovarianos exibidas folículo dinâmica, justificando ainda mais as análises do mecanismo de desenvolvimento do folículo ovariano usando este modelo.
Ovários de camundongos mais de 5 semanas de idade contêm lutea de corpus que dificulta as observações microscópicas. Daí, ovários rato 4 semanas são preferidos para observações do desenvolvimento folicular e ovulação, e os folículos primários, secundários e antrais tarde subsequentes são mais facilmente distinguidos usando microscopia de campo claro. Nossos métodos oferecem comparações dos efeitos das drogas em meios de cultura, com alterações perceptíveis no desenvolvimento folicular entre tratados diferencialmente ovários (Figura 3) e fatores de crescimento.
Os ratos transgênicos expressando proteínas Cre ou fluoresceína em oócitos foram descritos em estudos anteriores18,19,20. No entanto, a classificação da fase folicular depende características histológicas, incluindo formas de células da granulosa, números de camadas de células da granulosa, e formam-se células theca. Assim, distinções entre folículos primordiais e primários podem ser limitadas a partir de observações de ovócitos sozinhos. Aqui, usamos ratos transgênicos contendo o Oog1pro3.9 e mCherry-R26-H2B transgenes11,17 e visualizar o desenvolvimento precoce do folículo de primordial para estágios de folículo secundário em ovários culturas. Oog1 expressão torna-se detectável em oócitos durante a fase de folículo primordial e é marcadamente aumentada em folículos primários. Portanto, as intensidades de sinal AcGFP1 em oócitos são associadas com o estágio de folículo (Figura 5) e foram usadas para observar as transições de folículo primordial-primária (Figura 4, complementar Movie 2). Núcleo de células está manchado de vermelho em R26-H2B-mCherry ratos transgénicos (Figura 4, complementar Movie 2e 3 de filme complementar), permitindo que as observações dos estágios de folículo de acordo com números de (de células da granulosa A Figura 5). Assim, coletivamente os presentes métodos permitem análises do desenvolvimento do folículo de primordial através a ovulação usando Oog1pro3.9/ ratos transgénicosR26-H2B-mCherry . Além disso, porque a cromatina de célula apoptótica é condensada, mCherry sinais de folículos atretic são mais fortes do que aqueles de folículos normais (complementar Movie 3).
Entre sutilezas metodológicas, espessuras corretas dos tecidos cortados são necessárias para cultivo bem-sucedido, com morte celular aumentada em fatias de ovário que são muito espessas e perdas de grandes folículos antrais em fatias de ovário que são muito finos. A velocidade de crescimento do folículo é lenta; daí, é fácil de rastrear e analisar o processo de cada folículo através da observação intervalo de 24 horas. O microscópio confocal presente configuração, incluindo a intensidade do laser, intervalo de tempo e ganho digital, dependem do modo de microscópio, mas são essencial para considerar quando a obtenção de imagens de lapso de tempo. Em particular, as intensidades do laser forte e longos tempos de exposição são necessárias para capturar imagens claras, mas podem afetar células cultivadas. Portanto, moderação dessas configurações para evitar fototoxicidade é crítica. Tecidos ovarianos fatiados de ratos 4-week-old podem ser cultivados por aproximadamente 4 semanas, Considerando que os folículos primordiais e primários permanecem presentes posteriormente, já não crescem. Em contraste, P0 e P4 ovários podem ser cultivados por aproximadamente 10 dias, durante o qual os folículos primordiais e primários desenvolvem em folículos primários ou secundários, respectivamente. No entanto, folículos nos ovários P0 e P4 cultivados não desenvolvem em folículos antrais. Portanto, é necessária a excisão dos ovários em vários estágios de estudos dos mecanismos regulatórios associados com o desenvolvimento do folículo ovário inteiro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) para fornecer os ratos Oog1pro3.9 . Esta pesquisa foi apoiada pelos JSPS (KAKENHI # JP15H06275) e a Fundação Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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