Summary
Ovariële weefselcultures kan worden gebruikt als modellen van follikel ontwikkeling, ovulatie en follikel atresie en regulerende mechanismen van dynamische ovariële processen aan te geven.
Abstract
Zoogdieren vrouwtjes eisprong periodiek een bijna constante aantal eicellen tijdens elke cyclus van estrus. Om dergelijke regelmaat en periodiciteit, verordening treedt op op het niveau van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as en op de ontwikkeling van de follikels in de eierstokken. Ondanks actieve studies zijn follikel ontwikkelingsmechanismen niet duidelijk, vanwege de verschillende stappen van de activering van de slapende primordiale follikel tot ovulatie, en de complexiteit van de verordening dat verschilt in elk folliculaire fase. Voor het onderzoek naar de mechanismen van ontwikkeling van de follikel en de dynamiek van de follikels gedurende de gehele estrus cyclus, we een muis ovariële weefselkweek model ontwikkeld dat kan worden gebruikt voor het observeren van de follikel ontwikkelen met behulp van een microscoop. Systematische follikel ontwikkeling, periodieke ovulatie en follikel atresie kunnen alles worden gereproduceerd in de gekweekte ovarium-model en de kweekomstandigheden experimenteel kunnen worden gedifferentieerd. We laten hier zien het nut van deze methode in de studie van de regelgevende mechanismen van ontwikkeling van de follikel en andere ovariële verschijnselen.
Introduction
Vrouwelijke muis eierstokken verscheidene duizend follikels1bevatten, en periodieke ovulatie rijpt ongeveer tien eicellen op elke cyclus van estrus. Follikels zijn ingedeeld in verschillende ontwikkelingsstadia: primordial, primaire, secundaire, follikelgroei, en Graafian de follikels, afhankelijk van de vorm van de granulosa cellulaire laag rond elke oöcyt. Meeste primordiale follikels zijn slapende, en sommige van hen zijn geactiveerd en uitgroeien tot primaire follikels bij elke estrus cyclus2. Na de secundaire folliculaire fase, wordt ontwikkeling van de follikel voornamelijk geregeld door gonadotrofinen, folliculaire stimulerende hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). Echter, primordial en primaire follikel ontwikkeling is onafhankelijk van choriongonadotrofine, en de regulerende mechanismen die deze fasen regelen blijven slecht inderstood3,4,5. Naast de groeifactoren en hormonen, wordt de primordiale en primaire follikel geregeld door de interacties tussen follikels6,7. Dus we analyses van de follikel dynamics uitgevoerd in muis eierstok weefsels en onderzocht de bijbehorende regulerende mechanismen met behulp van ovariële weefselcultures8,9,10.
Hierin, introduceren we twee methoden in webobjectmodel ovariële weefselkweek. De eerste wordt gebruikt voor het analyseren van de follikel ontwikkeling door meting van de folliculaire gebieden, en de tweede wordt gebruikt voor het bestuderen van het reguleringsmechanisme tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fase met transgene muizen. Voor de analyse van de ontwikkeling van de follikel, we voornamelijk gebruikt eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke muizen omdat zij toestaan voor eenvoudige visualisatie van follikels. Om periodieke ovulatie en model in vivo de ontwikkeling van de follikel, wij gereproduceerd LH-piek en waargenomen ovulatie, follikel atresie en secretie van oestradiol weefselkweek omstandigheden. Beelden van de gekweekte eierstokken werden gevangen genomen en de ontwikkelingsprocessen follikel werden geanalyseerd door tracering veranderingen in de folliculaire gebied. In heldere veld microscopie analyses was het onderscheid tussen primordiale en vroege primaire follikels echter onduidelijk. Zo ontwikkelden we een methode voor het detecteren van kleine follikels en onderscheid maken tussen de primordiale, primair, en secundair follikel in gekweekte ovariële weefsels met behulp van Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 en de R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken op dag 0 en 4 na geboorte11. Oog1 uitdrukking is aantoonbaar in eicellen na inwerkingtreding meiose, en geleidelijk aan toeneemt met de ontwikkeling van de follikel, waardoor observatie van de overgang van primordial naar primaire follikels met behulp time-lapse beelden van gekweekte eierstok weefsel11 ,12. Hoewel de morfologische methodes zijn gebruikt om de studie van de factoren die activeren van sluimerende primordiale follikels13,14,15,16, is ontwikkeling van de fysiologische follikel in de eierstokken moeilijk te observeren, en de gevolgen van verschillende factoren blijven genfunctieonderzoek. De huidige cultuur-methoden werden ontworpen om aan te pakken van deze schaarste in real-time analyses van doel factoren.
In de huidige studie, we bijgehouden folliculaire ontwikkelen met behulp van een time-lapse beeldvorming methode en het proces van ontwikkeling van de follikel gekenmerkt. Onze nieuwe methoden bieden een ongekende hulpmiddel voor het onderzoeken van de Fysiologie van de eierstokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muizen werden gehuisvest in een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer op 23 ± 1 ° C met een 12 h licht/12 h donker cyclus. Dierenverzorgers protocollen en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor dier experimenten Aichi medische universiteit en door de zittende Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. voorbereiding van de voedingsbodem en gerechten
- Toevoegen om te bereiden fundamentele kweekmedium, foetale runderserum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), en penicilline-streptomycine (100 U/mL penicilline; streptomycine, 100 mg/mL) minimale essentiële middellange Alfa (MEM-α) en mix in 50 mL tubes.
Opmerking: Totale hoeveelheid vereiste voedingsbodems variëren tussen experimenten, maar 1 mL gestolde voedingsbodem is over het algemeen voldoende voor 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten. - Giet 1 mL aliquots van gemengde kweekmedium in 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten en stel plaats 30 mm cel cultuur inzetstukken in gerechten. Vooraf warm media en gerechten in een incubator (5% CO2 en 37 ° C).
2. voorbereiding van eierstokweefsel
- Vooraf warm met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (−) en MEM-alpha met 5% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine in een incubator (5% CO2 en 37 ° C).
Opmerking: Ongeveer 3 mL aliquots van PBS (−) per eierstok volstaan voor gebruik tijdens de eierstok ontledingen en 1 mL aliquots van MEM-alpha volstaan voor tijdelijke opslag van één van de eierstokken in 3,5 cm schotels. -
Accijnzen eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke ICR (de naam na de Instituut van kankeronderzoek) muizen en versiering van de weefsels rond de eierstok met schaar en pincet onder een stereoscopische Microscoop. De verwijderde eierstokken in een kweekvloeistof reserveren (zie stap 2.1) tot gebruik.
- Plaats één van de eierstokken op filterpapier bevochtigd met vooraf opgewarmd PBS (−) (zie stap 2.1) en snijd in 4 stukken met behulp van een microtoom mes onder een stereoscopische Microscoop.
Opmerking: Eierstokken van 4 - weken oude ICR muizen zijn ongeveer 2 mm in diameter. Het aantal stuks is afhankelijk van de grootte van de eierstok; evenwel toestaan dat ongeveer 500 µm dikke stukken voor juiste follikel waarnemingen (in stukken dikker dan 500 mm, weefsel transparantie wordt verlaagd; in stukken dunner dan 500 mm, vele follikelgroei follikels zijn gebroken en verloren). - Na dissectie, plaatst u de gesneden eierstok specimens in voorverwarmde kweekmedium in 3,5 cm schotels (zie stap 2.1).
- Plaats één van de eierstokken op filterpapier bevochtigd met vooraf opgewarmd PBS (−) (zie stap 2.1) en snijd in 4 stukken met behulp van een microtoom mes onder een stereoscopische Microscoop.
3. ovariële weefselkweek
- Drop ongeveer 0,5 µL cultuurmedium per gesneden ovariaal weefsel op de cel cultuur invoegen waar de ovariaal weefsel zal worden ingesteld met behulp van een micropipet.
- Plaats elk gesneden specimen in een druppel kweekmedium op de cel cultuur inzetstukken met pincet.
- Cultuur van de eierstok weefsels in 5% CO2 bij 37 ° C.
- Vervang het kweekmedium met verse voorverwarmde medium om de 2 dagen.
Opmerking: Het schema voor middellange wijzigingen voor de cultuur van de eierstok secties van 4 - weken oude ICR muizen wordt gepresenteerd in Figuur 1.- Voor het reproduceren van de LH-piek, gekweekte 4 - weken oude ICR muizen eierstokken te behandelen met het medium waarin 100 mU/mL FSH en LH voor 12u elke 4 dagen (Figuur 1).
4. Microscoop beelden van gekweekte eierstokken
- Start de gekweekte eierstokken imaging na dag 1, wanneer de weefsels hebben gehouden op de cel cultuur inserts en confocal of omgekeerde Microscoop-analyses uitvoeren om voldoende groei van de follikel tussen tijdstippen tussenpozen 24 h.
Opmerking: Confocale microscopie is superieur aan omgekeerde microscopie om follikels in hele gekweekte eierstokken te observeren.
5. time-lapse beeldvorming van gekweekte eierstokken
-
Optimaliseer de time-lapse imaging voorwaarden, waaronder laser intensiteiten en blootstelling tijden voor het imaging systeem (tabel 1).
- Selecteer gekoppelde eierstok exemplaren van één muizen voor gebruik als behandeling en controlegroepen. Variëren laser intensiteiten en belichtingstijd te bereiken de beste beelden (tabel 1).
- Vergelijk follikel groei onder de voorwaarde van elke cultuur door het meten van de follikel gebieden in beelden van controlemonsters 24u tussenpozen en time-lapse imaging monsters (zie stap 6). Gelijktijdig, het aantal algemeen eicellen in elke eierstok-set en kies de optimale time-lapse imaging voorwaarden.
- Opnamen tussenpozen 30 min met behulp van de time-lapse imaging systeem onder bepaalde voorwaarden (tabel 1).
6. follikel groei analyse
-
Meten om te analyseren de ontwikkeling van de follikel, de gebieden van de follikel in de opnames ImageJ softwarematig (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Aanvankelijk, stel de schaal van de afbeelding door te klikken op "Schaal ingesteld" onder "Analyseren" in de werkbalk. Voer de lengte van de zijde van de opname en het overeenkomstige aantal pixels in de lege velden van "De afstand van de bekende" en "Afstand in pixels", respectievelijk.
- Klik op "Vrije hand" in de werkbalk en een overzicht van de follikels in de beelden gevangen helder veld.
- Klik op "Maatregel" onder "Analyseren" in de werkbalk.
Opmerking: Als andere meetgegevens gewenst zijn, klikt u op "meting" onder "Analyseren" in de werkbalk en schakel de juiste selectievakjes in de lijst.
7. analyse van de ontwikkeling van de follikel met behulp van transgene muizen
- Eierstokken van postnatale dagen 0 en 4 (P0 en P4) vrouwelijke transgene muizen met de transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherr, en cultuur op inserts zoals beschreven in stappen 1.1 – 3.2, behalve niet plak de P0 en P4 eierstokken verzamelen.
- Vervang het kweekmedium met verse, voorverwarmde medium in 3,5 cm schotels in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C om de 2 dagen.
Opmerking: De concentratie van LH in het kweekmedium van P0 en P4 eierstokken kan ongewijzigd omdat LH spanningspieken niet in P0 en P4 muizen komen. - Stel de Microscoop te visualiseren alleen AcGFP1-positieve primaire follikels in de eierstokken van gekweekte P4 (tabel 1).
Opmerking: Alleen primordiaal en primaire follikels zijn aanwezig in P4 vrouwelijke muis eierstokken. - Foto's vastleggen van gekweekte P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken tussenpozen 30 min met behulp van de instellingen die worden gebruikt voor P4 eierstokken (zie stap 5.2).
- Traceren en analyseren van de follikel ontwikkelen met behulp van AcGFP1 en H2B-mCHerry signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het protocol voor wijzigingen in de media tijdens ovariële weefselkweek. Na dit programma 4-week-oude ICR muizen eierstokken werden gekweekt en beeld intervallen van 24 uur met behulp van de confocal microscopie (Figuur 2). Tijdens de cultuur van de eierstok weefsels voor 3 weken, meest follikelgroei en secundaire follikels zijn gedegenereerd door follikel atresie en sommige waren algemeen (Figuur 2D en tabel 2). In de analyse van de follikel gebieden met behulp van ImageJ (Figuur 3), enkele follikels in groepen ontwikkeld tijdens elke cyclus van LH piek (Figuur 3B en aanvullende film 1). Bovendien, ovulatie heeft plaatsgevonden bijna gelijktijdig in afzonderlijke gekweekte eierstokken van rechts en links eierstokken van enkele muizen. Overwegende dat het tijdstip van de ovulatie en het aantal algemeen eicellen (tabel 2) verschilden tussen muis eierstokken (gegevens niet worden weergegeven), plaatsgevonden ovulatie van gekweekte eierstokken voornamelijk binnen 48u van LH spanningspieken (Figuur 3, en aanvullende Film 1). Echter niet alle ovulated eicellen vrijgegeven eerste poollichaampjes na de eisprong (Figuur 2 en tabel 2), en hoewel kon algemeen eicellen worden bevrucht, ontwikkeling opgehouden bij de 4-cel fase (gegevens niet worden weergegeven). Om te verhelderen mechanismen waarmee slapende primordiale follikels in de eierstokken van de muis worden geactiveerd, ontdekt we primordiale follikel activering in gekweekte weefsels van transgene muizen uitvoering van Oog1pro3.9 en de R26-H2B-mCherry () transgenen Figuur 4 Figuur 5en aanvullende film 2). Eicellen express zeer lage niveaus van het Oog1 gen van de primordiale follikel fase en time-lapse imaging onderscheiden lage AcGFP1-uiten primordiale follikels van de hoge AcGFP1-uiten primaire follikels. Primordiale en primaire follikels zijn huidige gelijktijdig in P4 muis eierstokken, terwijl alleen primordiale follikels in de eierstokken P0 (Figuur 4A, B) aanwezig zijn. Dus, we geoptimaliseerd time-lapse imaging voorwaarden naar het detecteren van alleen primaire follikels in de eierstokken van gekweekte P4 (Figuur 4C). Vervolgens, gevangen we beelden van gekweekte P0 eierstokken gedurende 10 dagen onder dezelfde omstandigheden (Figuur 4D – G). AcGFP1 kan worden gebruikt als een index voor de primaire follikels in deze transgene muizen en AcGFP1-positieve primaire follikels waren in gekweekte P0 eierstokken aantoonbaar na 30 – 40 h cultuur (Figuur 4 Figuur 5A-Fen aanvullende Film 2). Primordiaal en primaire follikels in de eierstokken van de gekweekte werden ook onderscheiden door mCherry-positieve kernen van granulosa cellen (Figuur 5B, E). Specifiek, mCherry signalen geven vormen van follikels en observatie van de follikel stadia in gekweekte eierstokken (Figuur 5B, E, en H) toestaan. Daarom deze cultuur systeem met behulp van de eierstokken van Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry muizen bleek het proces van de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fases. Deze methoden zullen de studies van de regelgevende mechanismen van choriongonadotrofine-onafhankelijke follikel ontwikkeling vergemakkelijken.
Figuur 1 : Tijdsverloop van middellange wijzigingen. Medium A bevat 5% FBS, 100-mU FSH, 10-mU LH, 100-U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine in MEM-alpha. Medium B bevat 5% FBS, 100-mU FSH, 100-mU LH, 100-U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine in MEM-alpha. Medium B werd gebruikt voor de productie van LH spanningspieken elke 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Beelden van gekweekte ovariële weefsels. Beelden werden gevangen tussenpozen 24 h met behulp van de confocal microscopie. (A) cultuur dag 1; (B) cultuur dag 5; (C) cultuur dag 10; (D) cultuur dag 13; (E) Magnified beeld van de regio aangegeven door het plein in (D); eicellen in D waren algemeen uit de follikels aangegeven door de pijlen in de B, C en D. (F) oöcyt het vrijgeven van een polar lichaam na de eisprong; Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Metingen van de follikel gebieden in gekweekte eierstokken. (A) afbeelding van gekweekte ovarium; gestippelde lijnen vertegenwoordigen het gebied afgemeten aan ImageJ. (B) folliculaire gebieden in gekweekte eierstok na 3 weken; grijze lijnen vertegenwoordigen de periode van de cultuur van de toevoeging van 100 mM LH (LH-piek). Lijnen tonen de ontwikkelingsstadia in elke follikel in de gekweekte ovarium; Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Haematoxyline en eosine (H & E) kleuring beelden van P0 en P4 eierstokken en time-lapse beeldvorming. (A) H & E kleuring van P0 ovarium; (B) H & E kleuring van P4 ovarium; (C) afbeelding van een P4 ovarium van een muis Oog1pro3.6 transgene na 10 h cultuur. De pijl geeft een AcGFP1-positieve primaire follikel. (D – G) Beelden van P0 eierstokken van transgene muizen Oog1pro3.9 en R26-H2B-mCherry; groene en rode signalen in D en F vertegenwoordigen AcGFP1 en mCherry, respectievelijk. Wit signalen in E en G vertegenwoordigen AcGFP1 in D en F, respectievelijk. D en E zijn beelden van gekweekte eierstokken na 0.5 h cultuur. F en G Toon eierstokken na 180 h cultuur; Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: beelden van primordiaal, primair en secundaire follikels in gekweekte eierstokken uit oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry muizen. (A-C) Beelden van primordiale follikels in gekweekte P0 eierstokken; (D--F) Beelden van primaire follikels in P0 gekweekte ovarium; (G-H) Beelden van secundaire follikels in de eierstokken van gekweekte 4-week-oude muis. A, D en G zijn samengevoegde afbeeldingen van B en C, E en F, en H en I, respectievelijk. Green, AcGFP1; rood, mCherry; Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Microscoop | objectief | Laser | blootstelling (ms) | Winst | tijd-interval | z-stack | anderen | Cijfers en films |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561nm: 20 | 30 min | 5 mm | Figuur 4C-G, film 1 en 2 | |
| BZ-X700 | X20 (met collectie kraag) | 40% | Auto | X4 | 30 min | 10 mm | weggooien van 3 x 3 | Film 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | camera snelheid: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | digitale krijgen, 488 nm: 2, 564 nm:1 | Figuur 2, 3 en 5 |
Tabel 1: Time-lapse imaging voorwaarden. Time-lapse imaging voorwaarde voor confocale en helder veld microscopen.
| Eierstok geen. | Aantal totale algemeen eicellen | Aantal MII eicellen |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
Tabel 2: aantal algemeen eicellen in de eierstokken van de gekweekte. Aantal algemeen eicellen van twaalf gekweekte eierstokken; MII geeft het aantal algemeen eicellen die eerste poollichaampjes na de eisprong uitgebracht.
Aanvullende film 1: Time-lapse film van een gekweekte ovarium. Eierstokken werden werden verzameld uit 4 - weken oude muizen gesneden en gekweekte voor 3 weken. De film beslaat de periode van een cultuur van 0-200 h op 10 frames/s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende Movie 2: Time-lapse film van een gekweekte P0 ovarium van een muis transgene. Green, AcGFP1; rood, mCherry. De film beslaat de periode van een cultuur van 0-180 h op 10 frames/s. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende film 3: Time-lapse film van een gekweekte ovarium van een 4-weken oude muis. Green, AcGFP1; rood; mCherry; de film beslaat een periode van de cultuur van 9 – 13 cultuur dagen 10 frames/s. De pijlen in de eerste afbeelding geven follikels in welke atresie cultuur voorgedaan. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie ontwikkelden we twee nieuwe methoden voor het bestuderen van de ontwikkeling van de follikel in de eierstokken van de muis. De eerste methode houdt cultuur van gesneden ovariële volwassen muizen weefsels gevolgd door analyse van de ontwikkeling van de follikel en de tweede impliceert het gebruik van time-lapse imaging om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van de follikel tijdens de gonadotrofinen-onafhankelijke-fase. Eerder, wij de huidige eierstok weefselkweek methode gebruikt ter beoordeling van de gevolgen van leukemie remmende factor en progesteron voor8,9van de ontwikkeling van de follikel, en toonde dat hun effecten met concentratie en follikel fase variëren. In de huidige studie, gesneden ovariële weefsels tentoongesteld follikel dynamiek, verdere analyses van ovariële follikel ontwikkelingsmechanisme met behulp van dit model die rechtvaardigen.
Eierstokken van muizen van meer dan 5 weken leeftijd bevatten corpus lutea dat microscopische opmerkingen belemmert. Vandaar, 4 weken oude muis eierstokken zijn voorkeur voor opmerkingen van de ontwikkeling van de follikel en ovulatie, en latere laat primaire, secundaire en follikelgroei follikels gemakkelijker onderscheiden zich met heldere veld microscopie. Onze methoden bieden vergelijkingen van de effecten van groeifactoren en drugs in cultuurmedia, met waarneembare veranderingen in de ontwikkeling van de follikel tussen differentieel behandelde eierstokken (Figuur 3).
Transgene muizen uiting van Cre of fluoresceïne eiwitten in eicellen zijn beschreven in de vorige studies18,-19,20. Classificatie van de folliculaire fase hangt echter in histologische kenmerken waaronder granulosa cel vormen, aantallen granulosa cel lagen, en of de theca cellen worden gevormd. Dus kunnen onderscheid tussen primordiale en primaire follikels worden beperkt van waarnemingen van oöcyten alleen. Hierin, wij gebruikt van transgene muizen met de Oog1pro3.9 en de R26-H2B-mCherry transgenen11,17 en visualiseren van de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fases in gekweekte eierstokken. Oog1 expressie wordt in eicellen worden opgespoord in de primordiale follikel fase en wordt aanzienlijk verhoogd in primaire follikels. Vandaar, de AcGFP1 signaal intensiteit in eicellen worden geassocieerd met het stadium van de follikel (Figuur 5) en werden gebruikt voor het observeren van primordial-primaire follikel overgangen (Figuur 4, aanvullende Movie 2). Celkernen zijn R26-H2B-mCherry transgene muizen (Figuur 4, aanvullende Movie 2en aanvullende film 3), waardoor waarnemingen van follikel stadia volgens cijfers van granulosa cellen (rood gekleurd Figuur 5). Dus, gezamenlijk met de huidige methoden kunt analyses van de ontwikkeling van de follikel van primordiale door naar eisprong met behulp van Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene muizen. Bovendien, omdat apoptotic cel chromatine wordt gecondenseerd, mCherry signalen van atretic follikels zijn sterker dan die van normale follikels (aanvullende film 3).
Onder methodologische subtiliteiten zijn juiste diktes van gesneden weefsels vereist voor het succesvolle kweken, met toegenomen celdood in eierstok segmenten die te dik zijn, en verliezen van grote follikelgroei follikels in de eierstok segmenten die te dun zijn. De groeisnelheid van de follikel is zacht; Daarom is het gemakkelijk om te traceren en analyseren van het proces van elke follikel via 24u interval waarneming. De huidige confocal microscoop instellen, inclusief laser intensiteit, intervaltijd, en digitale gewin, zijn afhankelijk van de Microscoop-modus, maar zijn kritisch te overwegen bij het verkrijgen van time-lapse images. In het bijzonder sterke laser intensiteiten en lange belichtingstijden nodig zijn om duidelijke beelden te vangen, maar gekweekte cellen kunnen beïnvloeden. Vandaar, matiging van deze instellingen om te voorkomen dat fototoxiciteit is essentieel. Gesneden ovariële weefsels van 4 weken oude muizen kunnen worden gekweekt voor ongeveer 4 weken, overwegende dat primordiaal en primaire follikels vervolgens aanwezig blijven ze langer groeien. Daarentegen kunnen P0 en P4 eierstokken worden gekweekt voor ongeveer 10 dagen, gedurende welke primordiale en primaire follikels tot primaire of secundaire follikels, respectievelijk uitgroeien. Follikels in gekweekte P0 en P4 eierstokken doen echter niet uitgroeien tot follikelgroei follikels. Daarom is de besnijdenis van eierstokken in verschillende stadia voor studies van de regulerende mechanismen in verband met hele eierstok follikel ontwikkeling vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Naojiro Minami (Universiteit van Kioto) voor het verstrekken van de Oog1pro3.9 muizen. Dit onderzoek werd gesteund door de JSPS (KAKENHI # JP15H06275) en de Stichting van de Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
