Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Situ Måling og korrelation af celle tæthed og lys Emission af en bioluminescerende bakterier

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/57881
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

Summary

En bioluminescerende bakterier regulere lys produktion gennem en række mekanismer, såsom quorum sensing. Denne nye metode tillader i situ -undersøgelse af bioluminescens og sammenhængen af lys emission til celle tæthed. En kunstig en bioluminescerende Escherichia coli system tillader karakterisering af lux operonmodifikation, Lux proteiner og deres samspil.

Abstract

Der er et betydeligt antal bakteriearter kan udsende lys. Alle af dem deler samme gen klyngen, nemlig lux operon. Trods denne lighed viser disse bakterier ekstreme variationer i karakteristika såsom vækst opførsel, intensiteten af lys emission eller regulering af bioluminescens. Den metode, der præsenteres her er en nyudviklet assay, der kombinerer optagelse af cellevækst og en bioluminescerende lysudsendelse intensitet over tid udnytter en pladelæseren. Den deraf følgende vækst og lysudsendelse egenskaber kan være knyttet til vigtige funktioner i de respektive bakteriel stamme, såsom quorum sensing forordning. Dyrkning af en vifte af en bioluminescerende bakterier kræver et specifikt medium (f.eks, kunstige havet vand medium) og defineret temperaturer. Det let at håndtere, ikke en bioluminescerende standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli), på den anden side kan dyrkes billigt i store mængder i laboratoriet skala. At udnytte E. coli ved at indføre et plasmid som indeholder den hele lux operon kan forenkle forsøgsbetingelser og åbner desuden mange muligheder for fremtidige ansøgninger. Udtryk for alle lux gener udnytter en E. coli udtryk stamme blev opnået ved opførelsen af et udtryk plasmid via Gibson kloning og indsættelse af fire fragmenter der indeholder syv lux gener og tre ribben gener af lux-rib operon i en pET28a vektor. E. coli baseret lux genekspression kan induceret og styres via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Desuden resulterer i en bioluminescerende E. coli celler. Fordele ved dette system er at undgå quorum sensing forordning restriktioner og komplekse medium kompositioner sammen med ikke-standardiserede vækstbetingelser, som er defineret temperaturer. Dette system giver mulighed for analyse af lux gener og deres samspil med udelukkelse af den respektive gen fra lux operonen, eller endda tilføjelse af nye gener, udveksle luxAB generne fra en bakteriel stamme af en anden, eller analysere proteinkomplekser, såsom luxCDE.

Introduction

Emission af lys af levende organismer (bioluminescens) er en fascinerende proces findes i bakterier, svampe, insekter, nematoder, fisk og blæksprutter1. En bioluminescerende lysudsendelse fremgår af kemiluminescerende reaktion, hvor kemisk energi omdannes (delvist) til lys energi ("kolde lys"). I en bioluminescerende bakterier katalyserer heterodimerisk enzymet luciferase monooxygenation af langkædede, alifatiske aldehyder, såsom tetradecanal, til de tilsvarende syrer ledsaget af lys emission med et maksimum på 490 nm2, 3.

Figure 1
Figur 1 : Generelle reaktion ordning af bakteriel luciferase. Den bakterielle luciferase (LuxAB) katalyserer monooxygenation af langkædede aldehyder (CH3(CH2)nCHO) ved at udnytte reduceret flavin mononucleotide (FMNH2) og molekylær ilt (O2), fremstilling af produkter lang kæde syrer (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), vand (H2O), og emissionen af lys centreret på 490 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Den energi, der frigives under denne oxidation medfører en eksiteret tilstand FMN-4a-hydroxid, der tjener som lysemitterende luciferin4. Proteiner involveret i bakteriel bioluminescens, nemlig LuxCDABEG, er kodet af lux operon og er meget bevaret over forskellige bakteriestammer2,5. Gener luxA og luxB indkode for heterodimerisk luciferase; Luxc's, Luxd'sog Luxe's genprodukter er komponenter af en fedtsyre reduktase kompleks; og luxG koder for en flavin reduktase6. En række af en bioluminescerende Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bære yderligere luxF genet. Det blev rapporteret, at LuxF er et homodimeriske protein, der binder den usædvanlige flavin derivat 6-(3'-(R)-myristyl)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Yderligere gener er blevet identificeret som er ansvarlig for riboflavin syntese (fx ribEBH) og desuden regulerings gener er blevet rapporteret, at spille en rolle i quorum sensing regulering af bioluminescens, især for Vibrio fischeri og Vibrio harveyi6,13. Trods den yderst velbevarede gen rækkefølge viser en bioluminescerende bakterier høj variationer i karakteristika såsom vækst opførsel, intensiteten af lys emission eller regulering af bioluminescens2,5,14 .

Flere modificerede stammer eller plasmider, der indeholder dele eller hele lux operonmodifikation er kendt, at udnytte bioluminescens som reporter systemer. Forskellige applikationer såsom fastsættelse af promotor aktivitet, overvågning af bakterielle forureninger i miljøet eller fødevareprøver, bioluminescens resonans energi overføre (BRET), i vivo billeddannelse af infektioner i Eukaryote organismer, pyrosequencing, og så videre blev etableret15,16,17. Interessant, anvendte tre mest hyppigt en bioluminescerende reporter systemer er afledt af den nordamerikanske firefly (Photinus halvmøl), nematoder (Photorhabdus luminescens) enterisk patogenet og havet Stedmoderblomst (Renilla reniformis). Ingen af disse systemer har en bakteriel oprindelse, men brugen af lux gener og operonmodifikation fra bakteriel oprindelse er ved at vinde mere interesse for anvendt forskning16. Mindre rigelige anvendelsen af bioluminescens proteiner fra bakteriel kilder skyldes hovedsageligt lavere stabilitet og holdbarhed af bakterier stammer selvlysende proteiner, som kan være relateret til deres marine habitater. En bioluminescerende bakterier af marine habitater er ikke dyrkbare standard lab betingelser. Disse bakterier kræver specifikke vækst medier og betingelser, såsom kunstige havet vand medium og lavere vækst/inkubation temperaturer (f.eks. 28 ° C).

For at forenkle sammenligning af lux operon karakteristika eller enkelt lux gener af en række forskellige en bioluminescerende bakteriestammer, en metode til at standardisere lux operon udtryk og analyse er en forudsætning. Således opstået idéen om at integrere hele lux-rib operon i standard-forskning bakterien Escherichia coli (E. coli). Til dette formål, Gibson forsamling viste sig for at være et nyttigt redskab til at integrere flere lineær, overlappende fragmenter i ét udtryk vektor uden behov for specifik restriktion websteder. Denne metode er også velegnet, når DNA skær er for stor (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon størrelse) skal forstærkes via PCR. En lux operon kan opdeles i flere overlappende fragmenter, så samles til ét udtryk plasmid og endelig sekvensen verificeres forsamling produkt kan omdannes direkte til en passende E. coli system for højt udbytte protein udtryk18,19,20. Ud over den let at håndtere E. coli baseret lux genekspression, forblev en simpel metode kombinerer optagelse af cellevækst og en bioluminescerende lysudsendelse for at være etableret. Metoden beskrevet her tillader i situ måling og korrelation af celle tæthed og lys emission af en bioluminescerende bakterier.

Analyse af lux gener og lux operon orden og regulering af forskellige en bioluminescerende bakterier med, på den ene side, en kunstig en bioluminescerende E. coli system, der indeholder hele lux-rib operon af s. mandapamensis 27561 og på den anden side, en nyudviklet plade læser assay kombinerer in situ optagelse cell tæthed og lysudsendelse, hjælper med at få flere oplysninger om de forskellige bakterielle lux systemer. Denne grundlæggende karakterisering og sammenligning af luciferases og relaterede enzymer kan føre til alternativer til de allerede etablerede reporter systemer med øget stabilitet og aktivitet.

Protocol

1. design, forberedelse, og udtryk for lux Operon i Escherichia coli

Bemærk: Se Tabel af materialer til information om kommercielle kits, der anvendes i dette afsnit.

  1. For at overføre lux operon i E. coli vælge en standard pET vektor med passende begrænsning websteder og antibiotisk resistens gen af interesse (f.eks. pET28a; NcoI, XhoI, kanamycin).
  2. Designe fragmenter og overlappende primere for Gibson assembly baseret på DNA-sekvens af Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
  3. Oprette en standard PCR reaktion med de designede primere og Photobacterium mandapamensis 27561 isoleret genomisk DNA som skabelon (Se Supplerende materiale primere og betingelser).
    Bemærk: Isolering af genomisk DNA fra den respektive bakterielle stamme øger PCR effektivitet.
  4. Rense PCR produktet via spin-kolonne rensning.
  5. Udføre en restriktion fordøjelsen af isolerede pET28a vektor med NcoI og XhoI ved 37 ° C i 45 min.
  6. Rense den lineariseret vektor og PCR fragmenter via Agarosen gel elektroforese og efterfølgende spin-kolonne rensning.
  7. DNA-koncentrationen af hver fragment og lineariseret vektor og beregne de optimale mængder for forsamlingen ifølge protokollen20,21.
    Bemærk: Effekten af forsamling afhænger fragment størrelse og antal og justeres efter fabrikantens protokol20,21.
  8. Efter kombinerer alle fragmenter og buffer i et PCR rør, Ruger forsamling blandingen i en PCR-maskine ved 50 ° C i 1 time.
  9. Omdanne den samlede vektor vare ifølge standard transformation protokoller for E. coli bakterieplasmid omdannelse til en passende E. coli system for højt udbytte plasmid replikation (fx E. coli TOP10 eller XL-1).
  10. Vælge kolonier fra transformation plade og streg på nye plader til DNA isolation.
  11. Isolere plasmid DNA ifølge standardprotokoller.
  12. Hen til efterprøve den korrekte montering af plasmid herunder alle fragmenter, først udføre en koloni PCR ifølge standardprotokoller ved hjælp af primere specifikke for hver samlet fragment.
  13. Desuden den koloni PCR og efterfølgende Agarosen gelelektroforese, forberede alle isolerede forsamling vektorer for DNA-sekventering at efterprøve den korrekte montering og de korrekte DNA-sekvenser.
  14. Omdanne de verificerede plasmid ifølge standard transformation protokoller for E. coli bakterieplasmid omdannelse til en passende E. coli system for højt udbytte protein produktion (e.g.,E. coli BL21).
    Bemærk: Fortsætte direkte med udtryk protokol nedenfor. For længere opbevaring anbefales forberedelse af en glycerol bestand.

2. angivelse af modificerede E. coli stammer

  1. Forbered en overnight kultur (ONC) udtryk ved podning af en passende mængde af LB medium (f.eks. 100 mL) med den tidligere forberedt glycerol bestand af E. coli BL21 celler omdannet med de forsamlede plasmid eller direkte fra en transformation plade. Tilsæt 100 µL af kanamycin (50 mg/mL, antibiotisk resistens gen af pET28a), og der inkuberes ONC ved 37 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker natten over.
  2. Podes primære udtryk kultur (f.eks. 800 mL af LB medium) med 8 mL af ONC og tilføje 800 µL af kanamycin (50 mg/mL).
  3. Inkuber den vigtigste kultur ved 37 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker indtil cellen tæthed når en OD600 på 0,6 - 0,8 (ca 2,5 h).
  4. Reducere inkubation temperatur på 28 ° C.
  5. Fremkalde protein udtryk ved at føje IPTG til en endelig koncentration på 0,1 mM.
    Bemærk: Empiriske tests viste, at reduktion af temperatur på 28 ° C gav den højeste lysintensitet.
  6. Observere celler, indtil de begynder at skinner (ca. 1 h).
    Bemærk: Afhængigt af formålet med udtrykket, cellerne dyrkes indtil næste dag og høstes derefter, eller cellerne kan blive holdt ryster så længe de er lysende (højst 48 h). Høst celler og rensning af enhver proteiner kan udføres efter standardprocedurer.

3. angivelse af en bioluminescerende bakteriestammer

Bemærk: En bioluminescerende bakteriestammer kræver specifikke tilvækst medium/kunstige havet vand medium for vækst og lettere produktion.

  1. Forberede kunstige havet vand medium, består af to separat rede mellemstore komponenter.
    Bemærk: Forberedelse af kunstige havet vand medium var tilpasset fra den oprindelige protokol22. Følgende beløb er på 1 L flydende medium eller 1 L agarsubstratet.
    1. For kunstige havet vand medium, vejer i følgende salte: 28.13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3og 3,50 g MgSO4 · 7H2O.
    2. Tilføj 1 L destilleret vand og opløse alle komponenter.
    3. For LB medium, vejer i følgende ingredienser: 10 g gær extract, 10 g pepton, og for en ekstra 20 g agar agar plader.
    4. Der tilsættes 250 mL postevand og opløse komponenter.
    5. Autoklave begge udarbejdet media separat ved 121 ° C i 20 min.
    6. Agar plader, kombinere 250 mL af LB medium med 750 mL af kunstige havet vand medium direkte efter autoklavering og forberede plader.
    7. For flydende medium, skal du kombinere 250 mL af LB medium med 750 mL af kunstige havet vand medium, direkte efter autoklavering, eller når køles ned.
      Bemærk: Kunstige havet vand medium kan få grumset gennem salt nedbør.
  2. Streak en bioluminescerende bakteriestammer på kunstige havet vand medium agar plader og inkuberes natten over ved 24-30 ° C.
    Bemærk: Lang tid opbevaring af bakteriestammer opnås normalt gennem indefrysning glycerol bestande af bakteriekulturen. Stammer bør altid være stribet på agar plader først at sikre ensartet start betingelser for alle stammer, før brug for flydende kulturer, på grund af en mellemliggende fase i vækst efter optøning.
  3. Forberede en ONC ved at vaccinere 100 mL kunstig havet vand medium med en enkelt koloni fra pladen. Inkuber ONC på 24-30 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker natten over.
  4. Podes 800 mL af kunstige havet vand medium med 8 mL ONC.
  5. Inkuber bakterieceller på 24-30 ° C og 120 rpm i en inkubator shaker.
    Bemærk: Lysintensitet profil af en bioluminescerende bakterier varierer stærkt med temperaturen. Afhængigt af reguleringsmekanismer af lette produktionen af de respektive bakteriel stamme, kan lysudsendelse starte efter ca 1-6 h.
  6. Observere bakteriel cellekultur, indtil de begynder at skinner (ca. 1-6 h).
    Bemærk: Afhængigt af formålet med udtrykket, cellerne dyrkes indtil næste dag og høstes derefter, eller cellerne kan blive holdt ryster så længe de er lysende. Høst celler og rensning af enhver proteiner kan udføres efter standardprocedurer.

4. in Vivo aktivitet Assay for en bioluminescerende bakteriestammer og modificerede E. coli stammer

Bemærk: Lang tid opbevaring af stammer er normalt acieved gennem indefrysning glycerol bestande af bakteriekulturen. Stammer bør altid være stribet på agar plader først at sikre ensartet start betingelser for alle stammer, før brug for flydende kulturer, på grund af en mellemliggende fase i vækst efter optøning.

  1. Streak den ønskede en bioluminescerende bakteriel stamme eller modificerede E. coli stamme på en agar plade og inkuberes ved 28 ° C natten over.
    Bemærk: Inkubation temperatur kan varierer fra stamme til stamme og skal evalueres empirisk. Hvis du vil være i stand til at sammenligne en bioluminescerende bakteriestammer og modificerede skal E. coli stammer, vækstbetingelser være identiske.
  2. Podes 3 mL medium med de respektive stamme med en enkelt koloni fra en agar plade og inkuberes celler ved 28 ° C og 180 rpm i en inkubator shaker for ca 1-2 h.
  3. Måle celle tætheden af en 1:10 fortynding af flydende kultur på 650 nm. Beregn forholdet og volumen til 1 mL kultur med en OD650 på 0,05.
    Bemærk: Efterfølgende plade læser analysen vil bestemme celle tæthed på 650 nm at undgå indblanding af lys emission af stammer.
  4. Der afpipetteres beregnede mængden af kultur og medium i en 24-godt sort-walled plade med glas bund. For den modificerede E. coli stamme, tilføje 1 µL af kanamycin (antibiotikaresistens af pET28a vektor) og 1 µL af IPTG (induktion af genekspression) til prøverne. Plads et låg på pladen for at undgå fordampning under målingerne.
    Bemærk: For at sikre, at den pET28a vektor indeholdende hele lux operon ikke vild af kultur, E. coli , kanamycin skal tilføjes til hver E. coli prøve plade brønde og til at sikre at lette produktion af E. coli celler kan måles, Gen-ekspression skal være fremkaldt af IPTG. For at undgå krydstale og måling indblanding, sort-walled godt plader med glas bund og gennemsigtigt låg viste bedste resultater. Ikke desto mindre krydstale kan observeres og godt positioner skal vælges omhyggeligt.
  5. Start måling i en pladelæseren.
    Bemærk: Plade læser protokollen er baseret på et manuskript, specielt udviklet til dette assay (Se Supplerende materiale), der kombinerer to målinger, absorbans og bioluminescens. Datapunkter er indsamlet hver 10 min med permanent ryster mellem målingerne og en konstant temperatur på 28 ° C.

Representative Results

Gen rækkefølgen af lux operon - luxCDABFEG - er meget bevaret over forskellige stammer2,5,14. For udformningen af plasmidet, sekvens oplysninger er taget fra en bioluminescerende bakteriel stammen Photobacterium mandapamensis 27561 sin gen ordre blev holdt den samme og, også noncoding sekvenser mellem enkelt gener blev anset. En skematisk oversigt over de anvendte Gibson kloning strategi er afbildet i figur 2. Fire fragmenter i alt, luxCDAB, luxF, luxEG, og ribEBH, med 20-40 basepar overlappende sekvenser blev genereret. Efter at have fulgt alle trin af Gibson forsamling20, bekræftet DNA-sekventering den korrekte montering af plasmid, herunder alle fragmenter. Vector kort over slutmontage produkt pET28a indeholdende lux-rib operon er afbildet i figur 3. En væsentlig fordel af denne ændrede pET28a vektor er udnyttelsen af standardiseret E. coli vækstbetingelser og kontrolleret induktion med IPTG.

For at måle lys emission af en bioluminescerende bakterier og de respektive celle tæthed, blev en plade læser baseret metode udviklet. Metoden for i pladelæseren blev genereret kombinerer enkeltmåling scripts til lys intensitet og celle tæthed. Denne roman script aktiveret måling af OD650 og lysintensitet hver 10 min for en bruger defineret tidsramme, som skal tilpasses generationstid af bakterier anvendes til de respektive analyse (f.eks. 10 h). Måling af ekstinktionen blev udført på 650 nm at undgå interferens med den lysudsendelse. Som en proof of concept og at sikre sundheden og funktionen korrekt vækst af E. coli celler, blev referencemålinger udført. I figur 4 sammenligning af E. coli BL21 celler, E. coli BL21 celler, der indeholder en tom pET28a vektor og E. coli BL21 celler, der indeholder pET28a vektor med lux-rib operon præsenteres Indsæt. For de sidstnævnte stamme, blev ingen IPTG tilføjet til at analysere lysudsendelse på grund af leakiness af T7 promotor. Alle tre referencemålinger Vis en sigmoide vækstkurven med tre vækst faser (lag, eksponentiel og stationære fase). Kun de E. coli BL21 celler indeholdende pET28a vektor med lux-rib operon Indsæt start til at udsende lys, men i modsætning til målingerne der hvor udtryk er foranlediget ved tilsætning af IPTG og lys udsendes efter 30 min, de ikke-induceret celler kun begynder at skinne efter ca 5 h og viser en meget lavere lys emission (ca. 4-fold) i forhold til den inducerede system.

Figur 5 giver en sammenligning af vækstkurver og lys intensiteter af lux operon udtrykt i E. coli og en bioluminescerende bakteriel stammen P. mandapamensis 27561, enten i LB medium eller i kunstige havet vand medium, ved hjælp af romanen etableret i situ metode. For at sammenligne disse bakterier, blev målingerne udført på en inkubation temperatur på 28 ° C. Denne temperatur falder væksten i den modificerede E. coli stamme i LB medium samt kunstige havet vand medium, men for en bioluminescerende bakteriestammer lavere temperaturer er afgørende. Denne temperatur afhængighed ses i figur 5A, som P. mandapamensis 27561 viser en meget højere celle tæthed end E. coli. Derudover for E. coli stammer, LB medium tillader generation af højere celle tætheder, for naturlige en bioluminescerende bakteriestammer, kunstige havet vand medium er foretrukne og afgørende for bioluminescens. De indspillede celle tætheder korrelerer med de respektive lys intensiteter, som vist i figur 5B. Bemærkelsesværdigt, at en bioluminescerende E. coli celler reach lignende lys emission maxima i både LB medium samt kunstige havet vand medium, selv om de højeste intensitet blev indspillet på forskellige tidspunkter. I modsætning til denne observation, P. mandapamensis 27561 er levedygtige med stærkt nedsat vækstrater i LB medium, men de bakterieceller udsender ikke lys på alle (figur 5B). I kunstige havet vand medium viser P. mandapamensis 27561 et maksimum på lysudsendelse på ca 1 x 104 tæller pr. sekund, hvilket er næsten en faktor 200 lavere end E. coli. Figur 5 C repræsenterer relativ lys enheder hvor bioluminescens er normaliseret af OD. Disse resultater bekræfter, at ikke kun var indsættelsen af en plasmid indeholder lux operon i E. coli vellykket og funktionelle, men også at dette modificerede E. coli stamme er et gyldigt alternativ med endnu højere lysudsendelse udbytter og uden begrænsning af bakteriel bioluminescens af marina bakterier, som en kompleks havvand medium og lavere temperaturer.

Derudover blev en langsigtet måling af E. coli baseret lux-rib genekspression over 24 timer udført for at analysere levetiden af lys emission (figur 6). Lysudsendelse varet 19,5 h, meget længere end bakteriestammer (f.eks. P. mandapamensis 27561), hvor et gradvis fald blev observeret resulterer i meget lav lysudsendelse efter 10 h.

For at illustrere begrænsningerne af den udviklede assay, viser figur 7 måleresultaterne tre en bioluminescerende bakteriestammer, nemlig Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 og Vibrio harveyi 14126. For det første stamme (S1), metoden virker meget godt og viser en maksimal bioluminescens intensiteten af næsten 2 x 106. For de andre to stammer (TH1 og 14126), den maksimale lysintensitet kan ikke bestemmes, fordi lysintensiteten genereret af begge overskredet detektionsgrænsen for de anvendte Apparatindstillingen. Den gevinst værdi for den udviklede metode (script) til disse to stammer var sat for højt. Ikke desto mindre kan udbrud af bioluminescens aktivitet sammenlignes med hinanden. P. mandapamensis TH1 og P. mandapamensis S1 starte skinner efter ca 1 time og en OD650 værdi på 0,1 - 0,2, henholdsvis. Derimod begynder V. harveyi 14126 at udsende lys efter ca 5,5 h på en OD650 værdi på 1,0. Observeret udbrud af lys emission er ledsaget af en eksponentiel stigning i OD samt bioluminescens. Det er kendt at bioluminescens af V. harveyi 14126 ligger til grund for quorum sensing forordning og derfor en bestemt celle tæthed giver mulighed for aktivering af lux -operonen, som ses tydeligt i figur 713. Dette resultat viser, at med denne roman i situ plade læser analysen er det muligt at nemt sammenligne en bioluminescerende bakterier og også nogenlunde definere en regulerende mekanisme af disse stammer ved at bestemme om en quorum sensing forordningen kan være observeret eller ej.

Figur 8 viser et eksempel på et udtryk kultur af E. coli BL21 celler husly forsamlede pET28a plasmid som indeholder lux operon efter induktion med IPTG. Efter ca 1 time efter induktion, E. coli celler begynde skinner med en blå-grøn farve. Figur 8 A viser E. coli udtrykket kultur fotograferet i lyset og figur 8B giver samme kultur i mørke. Figur 8 C skildrer en agar plade af kunstige havet vand medium med P. mandapamensis S1 glødende i mørke i den samme blå-grøn farve karakteristisk for bakteriel bioluminescens.

Figure 2
Figur 2 : Skematisk fremstilling af de anvendte Gibson kloning strategi. Skridt (I): overlapning primere (farvede pile, ca. 20-40 basepar overlapper) er designet. Overlappende primere indeholder udgloedning sekvenser består af et fragment respektive 5' og 3' regionen og de tilstødende segment respektive 3' og 5' region. Trin (II): De designede fragmenter for forsamling er genereret via standard PCR reaktioner. Trin (III): Target vektor er linearisering af begrænsning fordøjelsen (f.eks. NcoI, XhoI). Trin (IV): DNA koncentrationer af alle fragmenter og lineariseret vektoren skal være fast besluttet på at justere koncentrationen passende for Gibson Forsamling (efter producentens protokol). Trin (V): Alle fragmenter og lineariseret vektoren med optimeret DNA koncentrationer er kombineret med Gibson forsamling master mix (T5 exonuclease, DNA polymerase og DNA ligase) og inkuberes ved 50 ° C i 1 h. trin (VI): forsamling produkt er omdannet Ifølge standardprotokoller til en passende E. coli stamme for højt udbytte plasmid replikation (fx E. coli TOP10 eller XL-1). Trin (VII): For at kontrollere den korrekte samling af plasmidet, der DNA-sekventering af de forsamlede plasmid skal udføres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Vektor kort af pET28a indeholdende lux-rib operon. Lux-rib operon af P. mandapamensis 27561 indsættes på webstedet for flere kloning af pET28a i den oprindelige gen ordre (luxCDABFEG-ribEBH). Begrænsning steder, der anvendes til kloning er NcoI og XhoI. Fragmenter bruges til Gibson montering af operonen er luxCDAB i orange, luxF i grøn, luxEG i blå og ribEBH i lavendel; gener inden for et fragment er vist som en separat boks. Noncoding sekvenser mellem hvert gen af operonen er medtaget i den anvendte kloning strategi. Den endelige plasmid størrelse af pET28a indeholdende hele lux-rib operon er 14,625 basepar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Sammenligning af vækstkurver og lys intensiteter af reference stammer. OD på 650 nm og bioluminescens intensiteten i optællinger pr. sekund blev målt hvert 10 min over 10 timer ved 28 ° C. Alle målinger er middelværdier af tre biologiske flergangsbestemmelser med fire tekniske replikater hver. Fejllinjer udgør standardafvigelser. E. coli BL21 celler (grå firkanter), E. coli BL21 celler, der indeholder en tom pET28a vektor (grå cirkler), og E. coli BL21 celler, der indeholder pET28a vektor med lux-rib operon Indsæt (Diamanten) blev analyseret til forsikre korrekte vækst opførsel af vores E. coli celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 5
Figur 5 : Sammenligning af vækstkurver og lys intensiteter af lux operon udtrykt i E. coli (firkanter) og P. mandapamensis 27561 (cirkler) i LB medium (åben symboler) eller kunstige havet vand medium (fyldt symboler). Alle målinger er middelværdier af tre biologiske flergangsbestemmelser med fire tekniske replikater hver. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Alle eksperimenter blev udført på en inkubation temperatur på 28 ° C. (A) optisk densitet (OD) målinger på 650 nm blev udført hver 10 min til 10 h. E. coli lux operon udtryk (venstre panel) er i forhold til P. mandapamensis 27561 (højre panel) i LB medium og kunstige havet vand medium. Celle tætheder bestemmes på 650 nm at undgå bioluminescens-interferens. (B) måling af lysintensitet (bioluminescens [tæller/s]) blev udført hver 10 min til 10 h. E. coli lux operon udtryk (venstre panel) er i forhold til P. mandapamensis 27561 (højre panel) i LB medium og kunstige havet vand medium. (C) relativ lys intensiteter (RLU/OD) af lux operon udtrykt i E. coli (venstre panel) og P. mandapamensis 27561 (højre panel) bestemmes af normalisering bioluminescens at celle tæthed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning af vækstkurver og lys intensiteter af E. coli baseret lux genekspression for 24 h. OD på 650 nm og bioluminescens intensiteten i optællinger pr. sekund blev målt hvert 10 min mere end 24 timer ved 28 ° C. Alle målinger er middelværdier af tre biologiske flergangsbestemmelser med fire tekniske replikater hver. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Derudover er de relative lys intensiteter (RLU/OD) hvor bioluminescens er normaliseret af celle tæthed repræsenteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Sammenligning af en bioluminescerende bakterier til at vurdere potentielle quorum sensing forordning. Lysudsendelse og celle tætheden måles hver 10 min til 10 h og repræsenterer middelværdier af tre biologiske flergangsbestemmelser med fire tekniske replikater hver. Fejllinjer udgør standardafvigelser. Målinger af Photobacterium mandapamensis TH1 (sorte firkanter), Vibrio harveyi 14126 (grå cirkler) og Photobacterium mandapamensis S1 (grå diamanter) var i forhold til hinanden; (A) skildrer det optisk densitet (OD) på 650 nm, (B) lys intensitet (bioluminescens [tæller/s]), og (C) relativ lys intensiteter (RLU/OD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Bioluminescens i flydende medier og på agar plader. (A) 5 L kolbe med 2 L LB medium podet med E. coli BL21 celler, der udtrykker pET28a lux operon plasmid fotograferet i lys. (B) den samme kultur som i (A) fotograferet i mørke. Billeder A og B blev taget ca 2 h efter induktion af udtryk. (C) kunstige havet vand medium agar plade med stribet kultur af P. mandapamensis S1 fotograferet i mørke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Opførelsen af et udtryk plasmid som indeholder fire fragmenter komponere hele lux-rib operon af P. mandapamensis 27561 blev opnået via Gibson kloning. Denne E. coli baseret lux genekspression gør det muligt for E. coli celler til at udsende lys. Undgå quorum sensing forordning og ikke-standard betalingsnumre vækstbetingelser er betydelige fordele ved dette system.

Fordelene ved at bruge Gibson kloning strategi er den nem montering af flere lineære DNA fragmenter, høj fleksibilitet og ikke behov for specifik restriktion websteder18,19,20. Denne metode gør det nemt at ændre en lux operonen, undtagen enkelt gener eller gen klynger eller at indføre nye gener eller udveksling af gener fra én stamme med en anden. En forudsætning for anvendelse af denne metode er tilgængeligheden af den respektive lux operon gensekvens. Kun til et lille antal af en bioluminescerende bakterier er den komplette DNA-sekvens af den respektive lux operon kendte og/eller tilgængelige. Mange af disse sekvenser er opsplittet, fordi de var genereret ved hjælp af shotgun sekvensering. For den undersøgte P. mandapamensis 27561 den komplette DNA-sekvens af lux operon er kendt og tilgængelig fra NCBI gen database (GenBank: DQ988878.2).

Et kritisk trin i protokollen for samlingen Gibson er beregningen af DNA koncentrationen af de enkelte fragmenter. I forsamlingen-protokollen af fabrikanten det blev anbefalet at bruge 0,2 - 0,5 pmols og en samlet maengde paa 20 µL for 4-6 fragmenter20,21. I vores tilfælde, hvor luxCDABFEG-ribEBH består af 4 fragmenter, var koncentrationer og samlede diskenheder 0,1 pmol og 45 µL, henholdsvis afhængigt af udbyttet af PCR-produkter. På den ene side fusionen måtte reduceres og på den anden side volumen skulle forhøjes. Ikke desto mindre, forsamlingen arbejdede nuvel og DNA-sekventering bekræftet den korrekte indføring i første forsøg. Denne konstatering bekræftes Gibson forsamling som en robust og hensigtsmæssig metode til vores undersøgelser, der let kan modificerede18,19,20.

Nyetableret plade læser assay er en nem at håndtere metode. Det giver mulighed for en enkelt primær analyse af nye eller (FN) kendt en bioluminescerende bakteriestammer og giver allerede en første vink om den regulerende mekanisme af lys produktion (fx halter i luminescence ved lav celle tætheder). Derudover kan vækstbetingelser i kombination med lys produktion nemt blive evalueret ved blot at ændre vækstmediet eller temperatur.

Målinger med i pladelæseren blev udført ved 28 ° C. Årsagen til denne usædvanlige indstilling er temperatur-følsomheden af en bioluminescerende bakteriestammer, hvor temperaturer over 30 ° C føre til mindre eller slet ingen vækst og/eller lysudsendelse. Bemærk, at i pladelæseren er i stand til at holde en fastlagt temperatur over tid med begrænsning af en manglende aktivt kølesystem. Den omgivende temperatur har derfor at være lavere end temperaturen i målingen.

Som en proof of concept, sammenligning af E. coli -konstruktionen med en bioluminescerende stammen P. mandapamensis (figur 5) på den ene side og referencemålinger (figur 4) på den anden side blev udført og bekræfte pålideligheden af dette nyligt etablerede system. Derudover sikres langsigtet måling levetiden af lys emission (figur 6). Men man skal overveje at OD-værdierne ikke er pålidelige over visse ekstinktionen, afhængigt af de særlige kendetegn ved den anvendte måling enhed (ca. 15 h i den foreliggende sag) hvor en passende fortynding ville være nødvendige for en måling i den lineære område af detektorens. Disse høje afvigelser i OD-værdierne gøre disse længe målinger ikke pålideligt. Derfor anbefales kortere målinger såsom 10 h ved hjælp af opsætningen af eksperimenterende rapporteret her.

Begrænsninger af etablerede plade læser analysen kan ses i figur 7. Vanskeligheden er at finde en passende indstilling af målingen. 'Få værdi' justerer følsomheden af foto multiplikator tube (PMT). Gevinsten er forstærkning af signal i ydelse, hvilket betyder, at en højere gain faktor vil øge signalet. Hvis gevinsten er indstillet for lavt, signal-støj-forholdet bliver større og lys intensiteter af "lav" lysende en bioluminescerende bakterier ikke kan målt nogen mere (signaler tæt på nul, data ikke vist). Udfordring i en en bioluminescerende assay er at indstille forstærkningen så måleresultaterne for alle bakteriestammer bo inden for intervallet af instrumentet. Derudover måleområdet for luminescence afhænger måling tidsinterval (f.eks. maksimalt 2.000.000 for 1 s).

Gevinsten blev sat til 2800, der empirisk blev testet og valgt for den specifikke Pladelæser bruges til oprettelse af denne metode. Indstillingen anvendes gevinst giver mulighed for optagelse af maksimalt udsendte lys af den en bioluminescerende E. coli system, P. mandapamensis 27561 og P. mandapamensis S1 uden overløb, men for stammer P. mandapamensis TH1 og V. harveyi 14126 gevinsten var for høj. Derfor, disse sidstnævnte stammer overstiger detektionsgrænsen og den reelle maksimal lysintensitet kan ikke måles. Denne tekniske begrænsninger kan forhindre sammenligning af en bioluminescerende bakterier, som viser høj variationer i maksimal lysudsendelse, selv om vækstbetingelser og celle tætheder kan være sammenlignelige.

Placering af de analyserede bakteriestammer inden for de anvendte godt plader har vurderes empirisk. Selvom sort godt plader med glas bund blev brugt, blev krydstale mellem prøverne observeret. Lysintensitet af specifikke stammer er så højt, at alle tilstødende brønde vil vise falske positive lys emissioner (fx tom). Derfor er det vigtigt at måle to forskellige stammer enten separat eller sammen med en bestemt rumlig adskillelse til hinanden.

Der er allerede mange modificerede E. coli stammer kendt som indeholder dele af lux operon og er hovedsagelig anvendelsesorienteret15,16,17. De metoder, der beskrives her, sigter mod grundforskning, for eksempel mulighed for at analysere hver lux gen separat. Forskning af bioluminescens har en lang historie, men der er stadig mange åbne spørgsmål. Udelukke eller indføre gener fra lux operon, udveksle luxAB generne med gener fra en anden stamme eller analysere protein komplekser, indlejret i den nem at håndtere E. coli system og yderligere anvendelse af pladen læser assay, kan det være muligt at få flere oplysninger om regulerende processer og funktioner af lux gener.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) for hans støtte i at etablere selv skriftlig scriptet for i pladelæseren. Dette arbejde blev støttet af østrigske "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) til PM (P24189) og ph.d.-program "DK molekylære Enzymology" (W901) til PM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit New England Biolabs Inc. E2621S for 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion Polymerase  Thermo Scientific F530S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs Inc. M0491S
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit Thermo Scientific K0721 for 50 rxn
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) New England Biolabs Inc. R3193S/R0146S
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit  Promega A9282 for 250 rxn
Monarch DNA Gel Extraction Kit  New England Biolabs Inc. #T1020S for 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit  Thermo Scientific K0503 for 250 rxn
GoTaq G2 DNA Polymerase Promega M7841
24-well black sensoplate with glass bottom Greiner Bio One 662892
FLUOStar Omega plate reader  BMG Labtech
OPTIMA/Mars Analysis Software BMG Labtech Version 2.20
Microsoft Excel 2010 Microsoft
Multitron Standard Incubator Shaker Infors AG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Widder, E. A. Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity. Science. 328 (5979), 704-708 (2010).
  2. Dunlap, P. Bioluminescence, Microbial. Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).
  3. Ulitzur, S., Hastings, J. W. Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).
  4. Kurfürst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction. Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).
  5. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).
  6. Meighen, E. A. Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).
  7. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase. J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).
  8. Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase. EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).
  9. Moore, S. A., James, M. N. G. Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (βα)8 fold in luciferase. Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).
  10. Moore, S. A., James, M. N. G. Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 Å resolution. J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).
  11. Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 Å resolution. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).
  12. Bergner, T., et al. Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).
  13. Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work. ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).
  14. Meighen, E. Genetics of bacterial bioluminescence. Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).
  15. Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).
  16. Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology. Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).
  17. Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence living lights, lights for living. , Harvard University Press. (2013).
  18. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  19. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  20. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  21. NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).
  22. Atlas, R. M. Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , CRC Press. (2004).

Tags

Biokemi sag 136 bioluminescens Escherichia coli Gibson kloning vækstkurven luciferase lux operonen marine bakterier quorum sensing plade læser assay
<em>In Situ</em> Måling og korrelation af celle tæthed og lys Emission af en bioluminescerende bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brodl, E., Niederhauser, J.,… More

Brodl, E., Niederhauser, J., Macheroux, P. In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (136), e57881, doi:10.3791/57881 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter