Summary
Эта статья представляет метод, основанный на спаривания, для облегчения гиперэкспрессия скрининга в многообещающий дрожжей с использованием библиотеки выстроились плазмиды.
Abstract
Многообещающий дрожжи широко используется как модель в изучении белков, связанные с заболеваниями человека. Генетический скрининг генома общесистемной является мощным инструментом, широко используется в исследованиях дрожжей. Выражение целого ряда нейродегенеративные заболевания связанных белков в дрожжей вызывает цитотоксичности и совокупных формирования, изложив выводы, видел у больных с этими расстройствами. Здесь мы описываем метод для проверки модель дрожжи связанные боковой амиотрофический склероз Белка FUS для модификаторов его токсичности. Вместо преобразования, эта новая платформа скрининга зависит спаривания дрожжей, чтобы внедрить библиотеку выстроились плазмид в модель дрожжей. Спаривания метод имеет две явные преимущества: во-первых, она очень эффективна; Во-вторых, предварительно преобразованные выстроились библиотека плазмиды могут храниться для долгосрочного как глицерин запас и быстро прикладной для других экранов без трудоемкого шаг преобразования в модель дрожжи каждый раз. Мы демонстрируем, как этот метод может успешно использоваться для экран для генов, которые изменяют токсичность FUS.
Introduction
Многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae широко используется в фундаментальных научных исследований1 понять клеточных процессов, непосредственно связанных с заболеваниями человека. Кроме того он был использован в качестве модельного организма для изучения человеческих болезней связанных белков, таких как те связаны с наиболее распространенными нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и амиотрофический Склероз (ALS)2. Преимуществом дрожжевых модели является легкость, с которой геном широкий экран может выполняться для выявления клеточных пути, относящиеся к токсичности белков, связанных с заболеванием, таким образом давая понять механизм их токсичности. Один такой экран называется гиперэкспрессия библиотека экрана, в котором каждый из 5500 дрожжи генов в библиотеку выстроились превращается в модель дрожжи для определения, какие гены могут изменять токсичности при оверэкспрессировали. Этот метод отбора успешно применяется в моделях дрожжи несколько нейродегенеративные заболевания связанных белков, включая гентингтина для болезни Гентингтона3, α-synuclein для болезни Паркинсона4,5 , Значения для болезни Альцгеймера6и Фу и TDP-43 ALS7,8,9. Хотя обычно это делается в манере высок объём10, наиболее трудоемкий этап экрана индивидуально преобразования 5500 дрожжей гены от выстроились библиотеки. Этот шаг должен выполняться каждый раз, когда показ повторяется, и всякий раз, когда модель недавно созданной дрожжи необходимо изучить. Важно найти более эффективный способ для решения этой задачи.
Стабильно дрожжевых клеток может существовать в haploid и диплоидных форм. Существует два противоположных спаривания типы клеток haploid, спаривания типа и α. Haploid клетки каждого спаривания типа производят и выделяют их собственных конкретных спаривания феромонов, которому только напротив спаривания типа клетки реагируют. Это позволяет спаривания между и α клетки для производства стабильных диплоидных клетках, a/α. Этот процесс является спонтанным и высокоэффективных11. Мы можем воспользоваться этой уникальной жизненного цикла S. cerevisiae представить библиотеку плазмиды. Говоря более конкретно каждый ген в библиотеке выстроились плазмиды будет преобразован в haploid клетки одного брачного типа, т.е., α клеток. Эти клетки, содержащие гены библиотека затем будут храниться на складе глицерина в формате выстроились 96-луночных. Для каждой модели дрожжей, который должен быть показан, дрожжевые клетки, содержащие гены библиотеки можно разморозить из глицерина запасов, и скрининга может быть сделано путем спаривания с моделью дрожжи интереса к противоположной спаривания, то есть, спаривания типа type. Эта идея использования спаривания объединить два генов в дрожжи не является новым. Она успешно применялась в высок объём дрожжей, которые скрининг 2 гибрида, в котором приманку (т.е., Gal4-ДНК связывающих домена сплавливания) построить в одном типе спаривания приняли участие путем спаривания с добычей конструкции из выстроились библиотеки 12. Тем не менее, эта стратегия никогда не применялась в гиперэкспрессия библиотека фильмов, которые всегда использовали методы традиционной трансформации.
Наша лаборатория ранее установленные дрожжи модель ALS-связанные Белка FUS7. Через гиперэкспрессия библиотека скрининга с помощью метода преобразования мы обнаружили пять дрожжи генов(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1и VHR1), которые спасти токсичность FUS, когда оверэкспрессировали. Эти выводы были независимо подтверждены с аналогичного исследования другой группы8. hUPF1, человека гомолога ECM32, позднее было показано для подавления токсичности в первичной нейрональные клетки13 и в животной модели ALS14 также. Используя эти пять гены как подтверждение принципа, мы демонстрируем, что все пять гены аналогичным образом спасти FUS токсичности, когда они будут введены в модель дрожжи FUS путем спаривания. Поскольку дрожжи клетки, содержащие гены библиотека может хранятся постоянно на складе глицерина и возродил всякий раз, когда необходимо, этот метод, основанный на спаривание будет удалить времени шаг преобразования каждый раз, когда библиотека должна проверяться против. После спаривания высокоэффективных с без преобразования плазмида участвующих, эта стратегия также существенно снижает затраты, связанные с очищения и преобразования библиотеки большой плазмиды. Мы будем успешно применять этот метод в библиотеке, скрининг против дрожжи модели FUS.
Процедура отбора на основе спаривания кратко описана на рисунке 1. Первоначально выстроились плазмида библиотека превращается в haploid дрожжей спаривания типа α, с помощью протокола преобразования высокой пропускной способностью дрожжи в котором каждой скважины 96-луночных плиты содержит дрожжи преобразована с определенной библиотеки плазмиды. Эта коллекция преобразованные дрожжей сохраняется как глицерин запас, который может быть оттаяла и возродил для использования позже. Дрожжи модель интереса, в данном случае FUS токсичности, должен быть создан в haploid дрожжей с противоположным типом спаривания (спаривания типа). В духе высокой пропускной способности, с помощью стерильных 96-контактный репликаторы штамм FUS и штаммов дрожжей, содержащий библиотеку плазмида переданы 96-луночных пластины, содержащие богатые средства массовой информации и разрешено мат. После спаривания, небольшой объем от каждой скважины спаривания культуры передается 96-луночных пластины, содержащие синтетические отсева СМИ в котором только диплоидных дрожжи, содержащие оба FUS и библиотека гены могут расти. Роботизированная машина пятнистость затем используется для передачи культуры дрожжей от каждой скважины на плиты агара, где индуцируется выражение FUS и библиотека генов. Кроме того дрожжевая культура выставляется для управления где FUS и библиотека гены не выразили плиты агара. После роста на плитах агара будут определены гены, которые спасти или усугубить FUS токсичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол, описанные здесь предназначен для отбора библиотека плазмид, содержащихся в десяти 96-луночных пластины, но можно вычислить по маштабу вверх или вниз соответственно. Протокол должен быть повторен для завершения проверки всей библиотеки. Обычно скрининг против 10 пластины библиотека генов каждый раз можно комфортно обрабатываться 1 человек.
1. Подготовка к 96-луночных дрожжи преобразования
Примечание: Этот шаг делается как ранее описанных7,10.
- Аликвота 5 мкл (около 50 – 100 нг) плазмидной ДНК из библиотеки выстроились плазмида в каждой скважине 96-луночных-днище раунд.
Примечание: Пример такой библиотеки бы дрожжи гена гиперэкспрессия библиотека10. - Прививать 150 мл дрожжей Пептон Декстроза (YPD) СМИ в 500 мл флакон с колонии (2-3 мм в диаметре) гаплоидным дрожжей W303α. Инкубируйте их на ночь на 30 ° C с встряхивания (200 об/мин).
- Следующим утром, измерить ОД600 ночь культуры и развести дрожжи культуры ОД600 = 0,1 в (до) 2 Л YPD. Проинкубируйте его при 30 ° C с встряхивания (200 об/мин) ~ 5 ч до тех пор, пока культура достигает600 OD = 0,4 – 0,6.
2. дрожжи преобразования
- Урожай, дрожжевая культура, заполнив 8 стерильные 250 мл бутылки центрифуги и центрифугирование их при комнатной температуре на 3000 x g для 10 минут слить супернатант без нарушения гранулы.
Примечание: Выполните все шаги центрифугированием при комнатной температуре. - Вымойте дрожжи с стерильной дистиллированной H2O. Для этого, добавить 100 мл стерильного H2O каждого бутылка центрифуги и вихревой его Ресуспензируйте Пелле ячейки. Объединяйте 2 бутылки и центрифуги, их на 3000 x g для 5 минут слить супернатант вымыть клетки.
- Мыть ячейки в каждой бутылке в 100 мл 0.1 М LiOAc/1XTE (100 мм LiOAc; 10 мм трис, рН 8,0; 1 мм ЭДТА) и центрифуги их на 3000 x g для 5 минут залить покинуть супернатант.
- Время центрифугирования, кипятить 5 мл спермы лосося ДНК (10 мг/мл) при 100 ° C, с помощью блок отопителя 3 мин и затем охладить его на льду.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 25 мл 0.1 М LiOAc/1XTE в каждой бутылке, объединить ресуспензированы клеток и передавать их на 150 мл флакон. Добавьте 5 мл, предварительно охлажденный лосось спермы ДНК и Инкубируйте на 30 ° C с встряхивания (225/мин) за 30 мин.
- Вылейте смесь клеток в стерильные одноразовые реагент водохранилище и, используя многоканальные пипетки, передачи 35 мкл в ячейку смесь для каждой скважины раунд-96-луночных днище содержащие библиотека плазмидной ДНК. Вихревой 96-луночных пластины с помощью Вортекс пластину за 1 мин при 1000 об/мин. Инкубируйте пластины для 30 мин при температуре 30 ° C без встряхивания.
Примечание: Не ставьте плит, поэтому можно эффективнее теплопроводности. Мы обнаружили, что vortexing 96-луночных пластины при 1000 об/мин не вызывает жидкости для разлива из скважин, но безопасного вихревой скорость должны быть протестированы перед выполнением шага. - В колбу Подготовьте 200 мл преобразования буфера, содержащий окончательное концентрации 40% PEG3350, 10% ДМСО и 0,1 М LiOAc. Подготовить преобразования буфера непосредственно перед использованием и перемешать путем встряхивания.
- Удаление 96-луночных пластины из инкубатора 30 ° C и смешать их на 30 s при 1000 об/мин, с использованием Вортекс пластины. Мкл 125 преобразования буфера для каждой скважины, а затем вихревой пластины для 1 мин при 1000 об/мин.
- Инкубировать пластины на 30 ° C в течение 30 мин и затем тепло шок дрожжи, поместив пластины в инкубаторе 42 ° C 15 мин.
Примечание: Не ставьте пластины. - Центрифуга для пластин для 5 мин на 3000 x g. Удалите буфер преобразования из скважин, инвертирование пластины над мусорное ведро и насильственно Сброс буфера от пластины. Быстро промокните Перевернутый пластины на чистое бумажное полотенце, чтобы удалить любые жидкости на вершине пластины.
- Промойте клетки путем добавления пластины 200 мкл минимальной отсева средних соответствующего выбора маркера на Библиотека плазмиды.
Примечание: Мы использовали синтетический Ура средний. - Центрифуга для пластин для 5 мин на 3000 x g и удалить супернатант над бен отходов как шаг 2.10.
- Мкл 160 минимальной Ура средний содержащий 2% раствор глюкозы. Вихревой пластины 1 мин при 1000 об/мин и инкубировать их в 30 ° C в течение 48 часов без встряхивания. После 48 ч Обратите внимание, что гранулы преобразованные дрожжей видна в нижней части каждой скважины.
- Использование жидкого мыла, мкл 100 Ура медиа содержащие глюкозу в каждой скважине нового набора 96-луночных плит.
- Вихревой пластины, содержащий преобразованные дрожжи (из шага 2.13) при 1000 об/мин за 30 s. с помощью репликатора стерильных пластиковых 96-контактный, место контакты в скважины, содержащий преобразованные дрожжей и прививать им в соответствующих скважины новых плит заполненные с средствами массовой информации. Инкубируйте новые пластины при 30 ° C в течение 24 ч.
Примечание: При работе с 10 тарелок, средство может также отказаться от вручную с помощью многоканальных пипеток. - После 24 часов Пелле дрожжи должны быть видны в нижней части каждой скважины, содержащие успешно преобразованных дрожжей. Чтобы сохранить эти штаммы дрожжей как глицерин запасов, 50 мкл 50% глицерина для каждой скважины, вихревой пластины для 30 s при 1000 об/мин, печать пластины с лентой и заморозить их на-80 ° C.
Примечание: Вышеуказанные шаги только нужно выполнить один раз. Будущие показы моделей различных дрожжей против же водохранилище одноразовые реагент библиотеки можно запустить из запасов глицерина и немедленно перейти от шагов ниже.
3. спаривания между ячейками, содержащих библиотеки генов и запросов дрожжей
- Возродить библиотека штаммов из запасов глицерина, принять 96-луночных пластины из морозильной камеры-80 ° C, удалить, уплотнительная лента и пусть дрожжи разморозить при комнатной температуре в течение примерно 30 мин.
- После размораживания дрожжи, используйте репликатора стерильных пластиковых 96-контактный для прививок глицерина запасов до 160 мкл свежих Ура медиа содержащий 2% глюкозы в 96-луночных пластины и инкубировать их в 30 ° C в течение 24 ч., сразу же после того, как используются библиотека штаммов , печать пластины с лентой и вернуть их в морозильник-80 ° С.
- В тот же день оттаяла библиотека штаммов (W303α), прививать штамм дрожжей запроса (здесь, Фу в W303a) до 50 мл YPD и вырастить его на ночь в 30 ° C с встряхивания на 250 об/мин.
- Наутро, наливайте штамм дрожжей запроса Стерильные одноразовые реагент водохранилище и аликвота 160 мкл штамма запроса для каждой скважины 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов.
- Использование жидкого мыла, лунки 160 мкл YPD СМИ в каждой скважине десяти 96-луночных плит. Впоследствии используйте эти пластины для спаривания штамм дрожжей запроса с дрожжами, Библиотека.
- Кратко вихревой 96-луночных пластины, содержащий запрос напряжение и затем использовать стерильные репликатор 96-контактный для передачи запроса напрягаться, чтобы YPD пластины.
- Кратко вихревой библиотека деформации пластин и для каждой библиотеки штамм пластины, использовать новую стерильную 96-контактный репликатор для передачи библиотека штаммов YPD пластины, которые были привиты с нагрузкой запроса.
Примечание: Клетки в глицерин теряют свою жизнеспособность после нескольких циклов замораживания оттаивания. Возвращение библиотека штаммов долгосрочного хранения (морозильник-80 ° C) как можно скорее будет держать библиотеки в хорошего качества и готовы для использования в будущем. Надлежащим образом, фондовой глицерина могут быть заморожены и талой по крайней мере 10 раз. Мы также настоятельно рекомендуем сохранять рабочей копии и резервные копии биржевых глицерин. Когда рабочий запас не работает, сразу же сделать новый рабочей копии из резервной копии. - Инкубируйте YPD пластин при 30 ° C в течение 24 ч. Обратите внимание, что гранулы дрожжей будет видна в нижней части каждой скважины после 24 ч.
- Заливка 96-луночных пластины с минимальным отсева носитель, содержащий 2% Рафиноза, соответствующий выбор маркеров плазмида в нагрузку запросов, а также библиотека плазмида (например, здесь ура - его-).
- Используете стерильные репликатор 96-контактный для передачи дрожжей с YPD спаривания культур для селективного средств массовой информации. Инкубировать 96-луночных пластины при 30 ° C в течение 48 часов; только клеток дрожжей, которые вязка и сформированных диплоидные клетки и, таким образом, содержат оба запроса плазмида и плазмиды библиотека будет иметь возможность расти в этом СМИ. После 2 дней наблюдать, что гранулы видна в нижней части скважины.
4. Анализируя Assay
-
После 48 ч роста в Рафиноза содержащих селективного СМИ пятно дрожжей на плитах агара.
- Готовить 2 набора пластин ура-его отсева, содержащих агар 2%, с использованием четких пенополистирольные плиты, один содержащий 2% галактозы и других содержащих 2% глюкозы.
- Вихревой 96-луночных пластины для 1 мин при 1000 об/мин, затем Найди дрожжей на ура-его отсева тарелки, содержащие галактозы 2% и 2% агар (индуцированных FUS и библиотека генов) и на ура-его отсева тарелки, содержащий 2% глюкозы и 2% агар (FUS библиотека генов и репрессирован) с использованием роботизированной пятнистость машина, в которой культура в каждом хорошо выставляется на плиты агара в составленном (т.е., на культуру 1 хорошо выставляется 4 пятна на пластину агар).
- После кровянистые выделения, пусть плиты агара сухой, а затем разместить их вниз головой в 30 ° C инкубатора. Фотография плиты агара каждые 24 ч для записи быстрее/больше дрожжей роста, в которой спасли токсичности для запроса штамм или для записи медленнее/меньше роста, в котором усугубляется токсичности для запроса штамм. Инкубируйте пластины на 4 дня.
Примечание: В культуре в каждом хорошо может быть выставлен на плитах агара 1-в-1, как показано в предыдущем метод на основе преобразования10. Однако, 1-в-4 кровянистые выделения здесь (который можно удобно настроить с использованием роботизированной машины пятнистость) значительно увеличивает надежность assay уменьшая количество ложных срабатываний. Положительные ответы рассматриваются только, когда все 4 колоний из того же хорошо показывают подобный фенотип.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ALS-связанные Белка FUS, белок, связывающий РНК/ДНК, был ранее учился в haploid дрожжи7,,8. Генетический скрининг с использованием метода на основе преобразования обнаружил несколько дрожжи генов, которые подавляют FUS токсичности. Человека гомолога одного из дрожжей генов позднее была продемонстрирована эффективность подавления токсичности в первичной нейрональных клеток и крысы модель ALS13. Здесь, мы используем той же модели дрожжей чтобы показать, что гиперэкспрессия библиотека скрининга может быть выполнена путем спаривания так же эффективно, как преобразование.
FUS является токсичным для обоих гаплоидным и диплоидных клеток дрожжей
Предыдущая модель дрожжи FUS и последующих гиперэкспрессия библиотека скрининга была выполнена в фоновом режиме haploid клетки. Для спаривания-на основе метода работы токсичность FUS необходимо продемонстрировать в диплоидных дрожжей. Для этого мы повязана FUS дрожжи модель в w303a (спаривания типа) с w303α преобразовано с пустой вектор (спаривания типа α). Как указано на рисунке 2, хотя и не столь сильным как в haploid дрожжей, FUS токсичность проявляется в диплоидных дрожжей.
Подавление генов определены ранее работу в диплоидных дрожжей
Как доказательство принципа для спаривания-на основе метода мы протестировали пяти генов, ранее выявленные из метода на основе преобразования. Вязка была использована для представления каждой из пяти генов в haploid дрожжи модель FUS (в W303a), и их способность спасти токсичность FUS в последующих диплоидных дрожжи был протестирован (W303a/α). Как показано на рисунке 3, все пять гены спасти токсичность FUS в диплоидных дрожжей, указывающее, что метод спаривания был эффективным.
Экспериментальной проверки 940 генов (выстроились на десять 96-луночных пластины)
После протоколы, описанные выше мы применили метод на основе спаривания библиотека скрининг гиперэкспрессия генов, 940. Рисунок 4 показывает изображение одного представителя пластины. Как указано в правой части рисунка (FUS и библиотека генов выражено), FUS был токсичным для диплоидных дрожжей. Ген Библиотека, обозначается зеленый квадрат спасли FUS токсичности пока что обозначается красной площади повышение токсичности.
Рисунок 1 : Схема для проверки модели дрожжи токсичности белка, используя спаривания. Плазмиды библиотека (под контролем промотора GAL1, который высоко индуцируется в присутствии галактозы) превращается в haploid дрожжей штамма (MATα), с использованием протокола преобразования высокой пропускной способности. Эта коллекция дрожжей, преобразована с библиотека плазмид, хранится как глицерин запас на-80 ° C и возрождается при необходимости к спариванию с моделью гаплоидным дрожжи токсичности белка (в нашем случае, одна копия FUS, интегрированный в локусе HIS3, промоутер GAL1 Мата). Диплоидных дрожжи, содержащие библиотека плазмиды и токсичных белков (FUS) выбраны и пятнистый глюкозы (FUS и библиотека ген «off») и плиты агара галактозу (FUS и библиотека ген «на»). Для идентификации генов, которые спасти или усугубить токсичность FUS затем рост дрожжей. Зеленый квадрат указывает пример ген-супрессор, который спасает FUS токсичности, а на Красной площади пример гена усилитель, который усугубляет FUS токсичности при оверэкспрессировали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Фу является токсичным для обоих гаплоидным и диплоидных клеток дрожжей. Гаплоидным дрожжей (w303 Мата) преобразована с pRS303Gal1-Фу были преобразованы с пустой плазмида или повязана с дрожжами противоположного типа спаривания (w303 MATα) преобразована с же пустой плазмиду для создания диплоидных дрожжей. Эти штаммы дрожжей наряду с штамм управления были затем 5 x серийно разреженных (слева направо) и пятнистые ура-его-глюкозы среднего (левый, FUS выражение репрессированных) и ура-его-галактозы среднего (справа, индуцированной FUS выражение). Фотография сделана после 2 дней роста на 30 ° C. Почти идентичные рост штамма гаплоидным и диплоидных управления было отмечено, поэтому только гаплоидным управления штамм был показан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Пять дрожжи генов(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1и VHR1) спасти FUS токсичности через метод на основе спаривания. Плазмиды, содержащий ранее выявленных дрожжи генов, которые подавляют FUS токсичности были преобразованы в haploid дрожжей (w303 MATα). Эти дрожжи затем были вязка с гаплоидным дрожжи противоположного типа спаривания (w303 Мата) преобразована с плазмида выражение фу. Диплоидных дрожжи, содержащие FUS и пустой вектор или один из пяти подавления генов был выбранного и пятнистые в реплицирует на плиты агара, содержащие глюкозу (гены «off») и галактозу (гены «на»). (1) показывает штамм дрожжей управления преобразован с двумя пустыми векторов. (2) показывает диплоидных FUS дрожжей с пустой вектор где выражение фу очень токсичен. (3 – 7) показывают диплоидных дрожжей, выражая FUS, а также подавление гена, который может спасти FUS токсичности. Каждый номер (1-7) показывает две строки двенадцати одинаковых реплицирует. Фотография, представляющая три независимых экспериментов, было принято после 3 дней роста на 30 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Библиотека скрининга для генов, которые спасти или усугубить FUS токсичности. Гаплоидным дрожжи, содержащие FUS была повязана с гаплоидным дрожжи, содержащие гены библиотеки. После спаривания, диплоидных клетках, содержащих FUS и библиотека гена были отобраны и затем замечен глюкозы (FUS и библиотека генов «off») и галактозы плиты агара (FUS и библиотека генов «на») в составленном. На табличке галактозы, в котором были выражены FUS и генные библиотеки, большая часть дрожжей смогли хорошо расти. Это означает, что фу является токсичным и большинство генов библиотека не смогли спасти токсичности. Зеленый квадрат демонстрирует пример библиотеки гена, который подавляет FUS токсичности и позволяет дрожжей формы колоний. Красный квадрат означает пример библиотеки гена, который усугубляет FUS токсичности. Пластины, показанный здесь являются представитель 10 пластин библиотека генов, которые были проверены против. Фотография сделана после 3 дней роста на 30 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол для выполнения экран гиперэкспрессия плазмида с помощью спаривания представить библиотеку плазмида в модель дрожжей дрожжи. Используя этот подход, несколько моделей дрожжи токсичности белка нейродегенеративные заболевания может проверяться с помощью той же коллекции дрожжей преобразуется с библиотекой плазмиды. Трудоемкий процесс преобразования только необходимо выполнить один раз, после которого высокоэффективных дрожжи спаривания используется ввести плазмида библиотека в нагрузку запросов. Этот протокол полагаются на использование роботов оборудования отказаться от средств массовой информации и пятно дрожжевых культур на плиты агара. Хотя протокол может выполняться без использования оборудования, роботов, он будет больше времени. Этот метод был успешно используется экран для генов, которые могут изменить токсичность FUS.
Мы наблюдали, что FUS чуть менее токсичен в фоновом режиме диплоидных дрожжей. Это скорее всего объясняется номер копии гена и различия в темпы роста диплоидных дрожжей. Если фенотип, которая в настоящее время изучается спаривания типа или плоидности зависимых, рост фенотип токсичности согласуется в haploid и диплоидных дрожжей. Ожидается, что из-за этого, метод на основе спаривания широко работать во многих моделях дрожжи различных роста фенотипов. Тем не менее фенотип дрожжи модели должны быть проверены, чтобы убедиться, что он все еще присутствует в диплоидных фона, прежде чем этот метод скрининга выполняется. Этот метод может использоваться для изучения многих разных фенотипов в дрожжей и не ограничивается изучение токсичности белка нейродегенеративных. Кроме того можно использовать любой векторы выражения плазмида библиотеки содержащие дрожжи.
После выполнения на экране, существует ряд анализов верификации, которые помогут обеспечить что выявленных хиты являются специфическими для дрожжей модели проходят проверку. Улушители токсичности должны быть проверены в дрожжей без совместного выражая болезни протеина интереса. Усилители, вызывая токсичности независимы от болезнь протеина интереса должны быть устранены от дальнейшего изучения. Важно рассмотреть ли Подавители токсичности затрагивают экспрессии белка болезнь, затрагивая Gal1 промоутер. Любое Подавители затрагивающих выражение от промоутера Gal1 следует исключить из дальнейшего изучения.
Штаммов дрожжей, содержащий плазмида библиотеки хранятся постоянно на складе глицерина и может быстро возродилась, когда это необходимо, чтобы метод, основанный на спаривание может легко применяться другие дрожжи модели, в которых же библиотека гены должны быть проверены против. Эффективность метода на основе спаривания становится очевидной, когда тот же тип проверки используется для удаления ложных срабатываний или несколько различных дрожжей модели должны быть изучены. Мы успешно использовали этот метод для экрана дрожжи модель TDP-43, другой белок связан с ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны за вдумчивого обсуждения с членами Ju лаборатория и Лаборатория Чжун и финансовой поддержке Райт государственный университет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| salmon Sperm DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD broth | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Granulated Agar | Fisher Sci | BP97445 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinose Pentahydrate | Research Products International (RPI) | R20500 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Sci | A702-500 | |
| Synthetic Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Yeast amino acid drop out supplement -Histidine/-Uracil | Clontech | 630422 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Lithium acetate, anhydrous | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (PEG-3350) | Spectrum Chemical | PO125-12KG | |
| 96 Pin Replicator | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar 96 well assay plate, round bottom with lid | Fisher Sci | 07-200-760 | non-treated, sterile |
| Eppendorf Research plus Multichannel Pipette | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Digital Dry Baths/Block Heaters | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuge | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Avanti J-26 XPI Centrifuge | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Multi-Mode Dispenser | BioTek | ||
| Rotor HDA | Singer Instruments |
References
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Willingham, S., Outeiro, T. F., DeVit, M. J., Lindquist, S. L., Muchowski, P. J. Yeast genes that enhance the toxicity of a mutant huntingtin fragment or alpha-synuclein. Science. 302 (5651), 1769-1772 (2003).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Treusch, S., et al. Functional links between Abeta toxicity, endocytic trafficking, and Alzheimer's disease risk factors in yeast. Science. 334 (6060), 1241-1245 (2011).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biology. 9 (4), 1001052 (2011).
- Sun, Z., et al. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS. PLoS Biology. 9 (4), 1000614 (2011).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpression screen. Journal of Visualized Experiments. (53), e2836 (2011).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Suter, B., Auerbach, D., Stagljar, I. Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. Biotechniques. 40 (5), 625-644 (2006).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (25), 7821-7826 (2015).
- Jackson, K. L., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced motor paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
