Summary
כאן, אנו מציגים את השינויים הנחוצים למודל מאופיין היטב ונמצאים בשימוש נפוץ קטנים בעלי חיים הברזל ותחמוצת כלוריד-induced (FeCl3) העורק פציעה לשימוש במודל גדול פגיעה בכלי הדם בבעלי חיים. המודל המתקבל יכול להיות מנוצל עבור ניסויים פרה-קליניים משפט הערכה של התערבויות תרופתי ועל מכניים מניעתי והן thrombolytic.
Abstract
ריטלין קריש דם שמוביל שבץ איסכמי מוחי, אוטם שריר הלב תורמת ~ 13 מיליון מקרי מוות בכל שנה ברחבי העולם. כאן, יש לנו לתרגם מודל פגיעה בכלי הדם של חיה קטנה לתוך חיה גדולה (כלב), עם שינויים קלים יכול לשמש להקרנה קליניים של סוכנים thrombolytic מניעתי. בנוסף לשיטות כירורגי, פרוטוקול ששונה מתאר את השיטות צעד אחר צעד כדי להעריך את העורק הראשי המוניות על-ידי אוגרי נתונים, הוראות מפורטות כדי לעבד המוח והן לצורך בדיקה היסטולוגית לוודא בעורק התרדמני המוניות דימום מוחי ו פרמטרים ספציפיים להשלמת הערכה של אירועים תרומבואמבוליים במורד הזרם על ידי ניצול תהודה מגנטית הדמיה (MRI). בנוסף, נדונים שינויים ספציפיים פרוצדורלי מהמודל בעבר ומבוססת קטנים בעלי צורך לתרגם פגיעה בכלי הדם חיה גדולה (כלב).
Introduction
שבץ תרפיה מבוססת במידה רבה לאחר טיפול למחלת עורקים, בעיקר בגלל התערבויות בתחום מחלות לב וכלי דם הגיבו טוב סמים טיפול ו endovascular התערבויות1. טיפולים אלו, עם זאת, יש לא בהצלחה לתרגם את מוחי. הקשיים בטיפול הקו הנוכחי הינם activator plasminogen רקמות רקומביננטי (rTPA) בלתי הפיכה, ניהול נושא סיכון משמעותי ב- 6.4% של המרה hemorrhagic2,3, 4. התפתחותה וכתוצאה מכך מגבילה את השימוש בה חלון קטן, לעתים קרובות בלתי ניתנת להשגה5. בנוסף, restenosis סגר מתרחשים לעיתים קרובות לאחר thrombolysis הראשונית, היפוך שיפור נוירולוגי הראשונית. לסיכום, יש חלון טמפורלית צר לניהול rTPA שתואמות הרוב הגדול (~ 90%) של חולים הסובלים עלבונות כשאבדן איסכמי.
התפקיד של עירוי antiplatelet הראו הבטחה בטיפול שבץ איסכמי עם כלי משופרת recanalization, הישרדות, תסריט2. למרבה הצער, תרופות אלו יש תופעת לוואי צפוי של דימום תוך-גולגולתי, במיוחד הגולגולת, בעיקר משום שאין אין דרך לקשר שלמאחה הפוך או לשלוט שלהם פעילות2. בזמן יעיל במניעת הצטברות של טסיות דם, הסיכון של דימום וחוסר היכולת להפוך את הפעילות שלהם יש מנעה את השימוש בהם בשגרת טיפול לחולי שבץ. צורך, לכן, קיימת עבור תרופות בשבץ antithrombotic חזק לפעול לבד או בשילובים כדי למנוע ואת lyse קרישי דם עדיין יש פרופיל בטיחות שיאפשר השימוש בשטח אחסון סגור, נמוך כמו המוח, איפה דימום הוא נסבל היטב.
הבנת המכניזם של קריש דם, re-היצרות, והערכת thrombolytics ותרופות המונעים re-היצרות, דורש קטנות כגדולות חייתיים כחלק של פיתוח תרופות קליניים. הברזל ותחמוצת כלוריד-induced פגיעה בכלי הדם היא טכניקה שימוש נרחב לזירוז במהירות ובאופן מדויק את היווצרות thrombi בכלי הדם חשופים של עכברים, חולדות, שרקנים, ארנבים6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. לזנים קטנים אלה מציעים מספר יתרונות כולל נוחות של הנדסה גנטית, רכישה זולה בעלי חיים נמוכה בממוצע ליום דיור עלויות. למרבה הצער, ניסויים בבעלי חיים קטנים לשלול מרובים לקחת דם במהלך הניתוח גישה טסיות תגובתיות, בדיקות גזים בדם של תגובה דלקתית. חשוב מכך, חיות גדולות הרבה יותר קרוב לחקות טסית דם אנושי פיזיולוגיה6,13. המודל פגיעה העורק3 FeCl מילא תפקיד השלטת במחקר של הפתופיזיולוגיה של פקקת, האימות של טסית אנטי-דם הרומן ותרופות אנטי מקריש, על גילוי thrombolytics פוטנציאליים6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. הקודם מודלים עכברים, עכברושים, שרקנים, ארנבים סיפקו נוחות וגמישות על מניפולציה גנטית, אבל לתרגום מודלים קליניים הם קריטיים ללימודים מינון ורעילות החולה של פוטנציאל הרפוי6 ,13. למרות מספר מודלים של הפרעות קדחת פותחו בעכברים, גדול מודלים חייתיים של פקקת הרלוונטיים מחלת כלי דם היקפיים, שבץ מוחי, אוטם שריר הלב הן כמה רחוק. הדגמים הראשונים פקקת קופים, כלבים, חזירים התמקד היצרות, החלה ועוצרי דימום וגלילים מאוחר יותר על כלי, בדרך כלל וכתוצאה מכך זרימת מחזורי הפחתות14,15,16. במקום כגון ריטלין באתר של הנזק אנדותל כמו הדגם הברזל ותחמוצת כלוריד, כגון במודלים אלה גרמו פקקת מחזורית, חסימת כלי דם דיסטלי וחוזרים זרימת דם רגילה. לשם השוואה, המודל הברזל ותחמוצת כלוריד השתנתה פה חיה גדולה, תוצאות כגון ריטלין הפציעה התייצב ויש אומתו מסתמים לפני הטיפול thrombolytic. ובלבד החוקר יש קרנות בשפע לכל דיאם ורכישה של ניבים ומומחיות כירורגי נאותה, אנחנו. פירוט כאן דגם כלב גדול של פגיעה בכלי הדם כדי לאפשר מעבדות ללמוד פקקת ניצול כירורגי, הדמיה, היסטולוגית טכניקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החקירות תיאר מתאימים להנחיות על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ואושרו על-ידי אוהיו המדינה אוניברסיטת מוסדיים חיה אכפת והוועדה שימוש (#2015A00000029). כל המניפולציות כירורגי בוצעו בהרדמה עמוקה, החיות לא חווה כאב בכל שלב במהלך ההליך. כל הניסויים שתוארו היו ללא שחזור.
1. הכנה
- להכין טרי 50 מ של הברזל ותחמוצת כלוריד (FeCl3) ב-50% (w/v) מדולל במים יונים.
- לחתוך את הקלטת הטבור לחתיכות 5.5 ס"מ ומשרים בפתרון הטרי 50% FeCl3 1 שבוע לפני ההליך.
הערה: הקלטת הטבור משמש עבה, לוקח קצת זמן כדי לספוג את הפתרון3 FeCl 50%. - מהר כל כלב בן לילה לפני הניתוח.
- תווית cryovials לאוסף פלזמה ושתן, 50 מ ל צינורות סטרילי צנטריפוגה עבור כל איבר אחסון, 10% פורמלין מכולות עבור קיבעון המוח ואת עורק הצוואר עבור H & E מכתים עם זיהוי בעלי חיים, תאריך לידה, תאריך של ניתוח, וטיפול.
- להכין 100 מ של כל פתרון עבור כל פרוצדורה הכלביים: paraformaldehyde 4% בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (pH 7.4), 10% נייטרלי buffered פורמלין, 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד [TTC ב- PBS (pH 7.4), לאחסן בחושך].
- רוכשים חנקן נוזלי בשפע עבור כל cryovials וצינורות רקמות 50 מ עבור פלאש קפוא ליום של ההליך.
- לרכוש שתי מחסניות ADP/קולגן תגובתיות טסיות מחברים-100 (מנתח תפקוד טסיות) עבור כל הכלבים עבור כל נקודת הזמן של עניין.
- רוכשים 4.5 מ"ל סודיום ציטרט דם אוסף שפופרת אחת, עבור כל לקיחת הדם לפני ההקרבה, פלזמה ההפרדה ואחסון. -הקרבה, צייר 16 צינורות איסוף דם עבור האחסון פלזמה. לאחר כל שפופרת אוסף דם מלא, ספין ב g x 4,000 ל 30 s כדי לבודד פלזמה עשיר טסיות והעברת נקה שכבה לתוך cryovials. הקפאת פלאש בחנקן נוזלי לפני האחסון ב- 80 ° c
- רוכשים 4.5 מ"ל ליתיום הפארין דם אוסף שפופרת אחת, עבור כל נקודת זמן מחברים-100 לעניין טסיות הרשומה תגובתיות. ב כל לקיחת הדם, להציג µL 800 של דם מלא משפופרות אוסף ליתיום הפארין דם לתוך בכל מחסנית ADP/קולגן ללא בועות אוויר לעקוב את תגובתיות טסיות.
- רוכשים שני EDTA K3 דם אוסף צינורות (mg 1.8 של EDTA נטול מים לכל 1 מ"ל של דם), עבור ספירת דם (CBC) בנקודת ההתחלה, זמן ההקרבה.
הערה: אמצעי אחסון זה מספיקה עבור רוב מתקני הליבה להפעיל אחד פעמיים במקרה של שגיאה מכני. למרות ספירת דם היה להפעיל הן הבסיס לפני הפציעה, בזמנו של הקרבה, החוקרים ניתן להוסיף שעוד דם שואבת כפי שאושרו שלהם בפרוטוקולים בבעלי חיים עבור ניתוחים נוספים. בדוק עם המתקן כדי כרכים ודרישות משלוח עבור הציוד שלהם. - להכין מזרק 2 mL heparinized על-ידי מילוי וציפוי המזרק היום נוהל בדיקות גזים בדם בזמן של הקרבה.
הערה: בדוק עם המתקן כדי כרכים ודרישות משלוח עבור הציוד שלהם.
2. כלבים העורק הראשי סגר
- שוקל מבוגר (> 18 חודשים) כלב ביגל, טיפול תרופתי מראש עם איזופרומאזין שרירית (0.025-.2 מ"ג/ק"ג) ואחריו זריקה בקרום הבטן הראשונית של קטאמין (5-20 מ"ג/ק"ג), midazolam (0.01-ב-25 מ"ג/ק"ג). לגרום הרדמה עמוקה יותר עם 1-5% איזופלוריין המבוסס על קצב הלב, הנשימות, הטון הלסת.
הערה: הרדמה המדויק מוכתב על ידי המשקל והפרוטוקול בעלי חיים מאושרים. למרות זריקות עלולה לגרום מכאבים למען החיות, משך הזמן של זה חוסר נוחות תהיה מינימלית (פחות מ 3 s). - לפני נטילת החיה אל שולחן הניתוחים, להסיר את השיער על ידי מסיכה. החל שימון אופטלמולוגיות משחה לעיניים של החיה anesthetized למניעת יובש.
- למקם את החיה במצב פרקדן באמצעות מערכת מיקום ולצרף אלקטרוקרדיוגרם (א) מוביל רגל רפידות. לצנרר דרך קנה הנשימה עם צינור אנדוטרכאליות 6.5 מ מ עם אזיקים, מכנית לאוורר ב 14 נשימות לדקה, ולקיים כל כלב עם נשימה רציף של איזופלוריין 1-5% (תלוי בפרוטוקול בעלי חיים מאושרים).
- כדי לקבוע את מידת המוניות של בעורק ואורך כגון ריטלין, לבצע מסתמים לפני הפציעה, לפני MRI ולאחר זמן ההקרבה (ראה להלן הנחיות הוראות נוספות).
- הכנס נדן עורקי הירך צנתר פלסטיק ולאבטח בתפר 0-משי רופף. סגור זמנית מעטפת של קטטר במהלך התעבורה והדמיה מחקרים. ראה מסתמים הכלבים להלן לקבלת הוראות נוספות).
- בשביל לקחת דם, נחדיר קטטר תוך ורידי 16G x 45 מ מ דרך העור ללא פגע דיסטלי כדי נדן עורקי הירך לצמצם את האתר. לקדם הקטטר לתוך החשיפה כירורגי, לדמיין. את זה המתאוששת לווריד הירך חשוף ומיד בסמוך לו נדן עורקי. ברגע מוכנס לווריד, לשלוף את המחט, קאפ הקטטר עם צימוד 3-way, לשטוף את זה עם 2 מ ל תמיסת סטרילית 0.9%. מאובטחים הצנתר על העור בתפר 0-משי.
- אעשה חתך 8-10 ס מ של העור ישירות על האזור העורק הראשי ממש נפוצים ומנתחים fascia כדי לבודד את כלי הקיבול של הרקמה שמסביב.
- בזהירות מציגים מלקחיים בין העורק הראשי של העצב התועה כדי להפריד. להימנע מלגעת העורק תרדמני הכרחי יותר שכן היא עלולה לגרום ההתכווצות של כלי השיט.
- יבש באזור החשוף של העורק עם גזה סטרילית כדי להימנע FeCl3 פתרון דילול.
- מקום הדופלר לזרום בדיקה סביב בעורק ומאפשר מקום פנוי להמשיך בדרכו כדי לעטוף את הקלטת הטבור סביב בעורק בלי לגעת המכשיר זרימה להתחיל להקליט את מהירות הדם ולהמשיך לאורך כל ההליך (איור 1 למעלה). להקליט את הזרימה בסיסית עבור ~ 5 דקות לפני החלת את הקלטת הטבור.
הערה: זרימה בסיסית לפני FeCl3 משתובב השמה בדרך כלל הממוצע בסביבות 250 מ לדקה. - לעטוף את הקלטת הטבור של3 FeCl מוכן סביב בעורק באמצעות עוצר דימום מיד מתחת החללית זרימה בלי לגעת בה 15 דקות, הסרה של ביטול.
הערה: סגר מיועדת כמו זרימת אפס mL/min. - לייצב את כגון ריטלין במשך 45 דקות הוסף תמיסת נוספים על המכשיר לפי הצורך כדי לשמור על אות.
הערה: בהתאם לגיל, מין וסוג הנפקות הכלביים, נוספים של3 FeCl מוכן הטבור הקלטת ייתכן שיהיה צורך להתרת 30 דקות עבור סגר מתרחשים לפני יישום מחדש. אין הבדלים נצפו ב פקקת על-ידי יישום הברזל ותחמוצת כלורי עם מגדר ביגל. זה לא נמצא הצורך עם מודל זה החלה מחדש של טרי FeCl3 משתובב יותר מפעם אחת, יש לעולם לא חרג מן הפרוטוקול הכנה FeCl משתובב3 . אם המעבדה הוא משתמש גזע אחר או גיל של כלב, FeCl3 משתובב, אבל צריך להיות מוחל על הנושאים הראשונית כדי לוודא כי הפרוטוקול פקקת לא לסטות, או קבוצה של הכלבים ייתכן שיהיה צורך להקים FeCl3 יישום זמן זה גזע או גיל במחקר הספציפי שלהם. הפעמים סגר, בניסוי זה, נע בין 8-30 דקות לאחר FeCl3 משתובב היישום. - כדי לקבוע האחסון שבץ או דימום בנוסף האירועים תרומבואמבוליים במורד הזרם, העלולות לנבוע התערבויות תרופתי, להעביר הולכי על ארבע עם קטמין נוספים הזרקה אל מכונת הדמיית תהודה מגנטית (ראה להלן הנחיות עיבוד נוסף).
- אמנם עדיין תחת מטוס כירורגי עמוק של הרדמה מ לקבל הסופי אנגיוגרפיה/MRI (ראה להלן הנחיות פרוטוקול הדמיה), המצוין על-ידי חוסר תגובה לגירויים יתמודד, לאסוף דם רצוי לניתוח בשלב מאוחר יותר, ואז פתח את התיבה על ידי לחתוך לצלעות החל מ- החזה, ואת בלו הלב על ידי חיתוך כלי הדם (דימום למוות).
הערה: בניסוי זה, כל דם (< 10 מ ל) צויר ב בסיסית, 5 דקות אחרי סוכן הניהול ו- 60 דקות לאחר אינפוזיה מהנדן הירך וראיתי אין השפעה על התהליך של thrombolysis. -הקרבה, אמצעי אחסון ללא הגבלה ניתן להסיק לאחסון פלזמה נוספים אם תאושר בפרוטוקול בעלי חיים. לנתח, לעבד ולאחסן כל דם בתוך 30 דקות של הקרבה. ודא כי דם לא נמשך מעל האחוז המאושרות של משקל הגוף של החיה כמפורט בפרוטוקול בעלי חיים מאושרים. כל הניסויים שתוארו היו ללא שחזור. - לשטוף את הלב עם סליין 0.9%, פלאש הקפאת דגימות של החנקן הנוזלי במידת הצורך.
- לפני הסרת לעורק הראש, למדוד את אורך קריש-הדם על-ידי הצבת בסרגל לצד זה ולהקליט. במקום דה מרקר רקמות על האמצע של קריש הדם, באותו מקום על בעורק contralateral על מנת להקל ב היסטולוגיה זמירה. סמן בעורק contralateral-באותו האורך.
הערה: האורך הממוצע קריש דם עם מודל זה הוא 1.75 ס"מ. - הסר לכל אורכה של קריש הדם ההפלגה ותקן בפורמלין 10%. הסר את העורק הראשי contralateral לרוחב מסומן על ידי דה מרקר רקמות. לחצי את העורק הראשי contralateral באמצע של קריש הדם. פלאש להקפיא חצי contralateral העורק הראשי של חנקן נוזלי לניתוח בשלב מאוחר יותר ותקן את החצי השני בפורמלין 10% כדי להטביע לצד בעורק פצוע לבדיקה היסטולוגית להלן.
- להסיר איברים עבור כל ניתוח הרצוי, לשטוף עם saline 0.9%, הקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
- הסר את הגולגולת עם מסור עצם עגול. הסר את הגולגולת ללא פגיעה במוח מתחת.
- אחרי המוח יוסר הגולגולת, לשטוף אותו ב- saline 0.9% קר, חותכים שני מקטעים 4 מ מ מהאמצע של המוח, חיתוך רוחבית באזמל חד. מקום אחד הסעיפים 4 מ מ לתוך 2% TTC עבור התיחום איסכמי (ראה נוספים לעיבוד במוח TTC), בעוד אחרים הפרוסה מניחים בפורמלין 10% במשך 7 ימים עבור H & E מכתים (ראה עיבוד נוסף עבור המוח H & E).
3. הכלבים מסתמים
הערה: זו מוצגת באיור 2, במהלך הניתוח בנקודות זמן עניין.
- להרגיש את הדופק באזור במפשעה נכון, עושים חתך הסאגיטלי הגחון 3-5 ס מ.
- לחשוף את עורק הירך ולהפריד אותו מן הרקמות הסובבות באמצעות עמום.
- השתמש עוצר דימום מאונכים מקום suture 0-משי סביב הקצה הדיסטלי של העורק חשוף.
- לקשור את התפר 0-משי דיסטלי ולהחיל מתח קלה על העורק על ידי מחבר חובק למעקה את הקצוות רופף תפר 0-משי על העור עם ועוצרי דימום.
- מקום suture 0-המשי השני בסוף המקטע חשוף הפרוקסימלית.
- לנקב את העורק מידוויי בין תפר 0-משי לקרע, הקשרים באמצעות מחט introducer של 18 גרם כדי להעביר חוט מדריך לתוך העורק.
- לטעון, נדן 6Fr שהורכבו ו מרחיב על החוט מדריך, אוחז את החוט עם יציאתו מההרכבה.
- לקדם את שאת רוצה. ואת מעטפת מעבר לגדר מדריך. הקפד לשמור על הבנה טובה של החוט בזמן זה בולטת מרחיב תוך קידום מכלול נדן מרחיב.
- לאחר ההוספה מלא, לקשור את התפר 0-משי proximal סביב נדן לשמור hemostasis החדירה עורקי.
- בו זמנית להסיר את מרחיב את החוט.
- . פתח את הברז בכיוון אחד כדי לאמת את הנוכחות של זרימת הדם פועמת לשטוף עם 3-5 מ"ל של תמיסת מלח
- לחבר את הגישה נדן שסתום חד-כיווני נוזל מילוי הארכת הקו מחובר מתמר לחץ למדידות לחץ דם פולשנית צג ולהקליט.
- לטעון מראש 0.35" מדריך חוט לתוך 4Fr. angiographic צנתר וחבר סעפת הזרקת חדות עם מתאם-y טוהי.
- משוך את קצה החוט מדריך ממש בתוך בקצה הדיסטלי של הקטטר, לשטוף את מכלול שלם עם מי מלח.
- הכנס את הצנתר angiographic לתוך השסתום hemostatic של נדן, ואז לקדם את החוט כ 5 ס מ מעבר קצה הצנתר דיסטלי.
- תחת הדרכה fluoroscopic ושימוש בגישה טרנס-ותיני רטרוגרדית, באיטיות את הצנתר לתוך קשת אבי העורקים.
- להזריק 2-3 מ"ל של הסוכן מדולל ניגודיות 1:1 עם תמיסת מלח כדי לזהות את ההמראה של תא המטען brachiocephalic.
- השתמש את החוט לכוון את הצנתר לתא המטען brachiocephalic, ולאחר מכן באופן סלקטיבי לתוך עורק תרדמני ממש.
- להסיר את החוט ולהזריק 2-3 מ"ל של ניגוד מדולל כדי לוודא כי הצנתר ממוקם בעורק.
- להזריק 3-4 מ"ל של ניגוד מדולל בעת הקלטת angiographic פועל באמצעות חיסור דיגיטלי וטכניקות angiographic רגיל.
- חזור על הצעדים 3.18-3.21 מסתמים חוזר ונשנה בנקודות זמן נוסף.
4. תהודה מגנטית - דיפוזיה משוקלל הדמיה (DWI) ו- T2 משוקלל הדמיה (T2WI) של המוח הכלבי
הערה: זו מוצגת באיור 3 א-3B.
- ודא כי הכלב בהרדמה עמוקה.
- ודא כי פרמטרים פיזיולוגיים של הכלב מנוטרים במהלך ההדמיה כולל אק ג וקצב הלב.
- ודא כי הכלב שוכב במצב פרקדן עם ראשו של הפתחים דו צדדיים של הסליל המוח.
- הפעל את המגנט 3 טסלה (3T).
- לבצע הדמיה T2 משוקלל (T2WI), רצפי הדופק הבסיסי ה MRI.
הערה: הרצף משתמשת ההבדלים בזמן רגיעה T2 של רקמות-מצבים פתולוגיים שונים. - לבצע מבצע לוקליזציה הדמיה לרכוש תמונות פיילוט של מוח הכלב לפני ההדמיה אנטומי באמצעות אקו הדרגתיות משוקלל T2 הדמיה רצף ולקבוע את שדה הראיה (FOV), מספר פרוסות ואת עובי הפרוסה לכסות לחלוטין את המוח.
- השתמש T2-בפרמטרים הבאים: פורסים בעובי = 3 מ מ, TR = 4,000 ms, טה = 75 ms, ETL = 7, מטריקס רכישה = 320 x 256, הפא = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 פיקסלים, רזולוציה של תמונה = פיקסלים 2.4615 מ מ.
- לבצע הדמיה דיפוזיה משוקלל (DWI) באמצעות אקו פלנר DTI רצף 4 שעות לאחר MCA סגר מיד לפני ההקרבה.
- השתמש בפרמטרים DWI הבאים: b = 1,500 מ"מ/s2, עובי הפרוסה = 3 מ מ, TR = ms 4,600, ואח = 86 ms, ETL = 55, מטריקס רכישה = 140 x 140, הפא = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, רזולוציית התמונה = פיקסלים 0.9333/מ מ (טבלה 1).
5. hematoxylin ואאוזין (H & E) כתמים שהגודל
הערה: זה מוצג איורתלת-ממד.
- לאחר 7 ימים ב- 10% פורמלין, להטביע את המקטעים המוח 4 מ מ פרפין.
- חתוך את אבני פרפין עד שהם נמצאים בגובה מיקרוטום, הסרת כל פרפין נוספים מהחלק העליון של רקמת המוח, ואז חותכים את רקמת המוח 4 מיקרומטר ומניחים מקטע אחד של המוח על כל סנטימטר שקופית 2 "x 3".
הערה: לפני צביעת, המקום כל הפתרונות במיכלים נפרדים כך שקופיות ניתן להעביר פתרון אחד למשנהו ללא ייבוש. - Paraffinize מבטל את כל שקופית המוח, מימה עם מי ברז.
- מקם כל שקופית המוח Hematoxylin 560 במשך 8 דקות.
- לשטוף כל שקופית המוח במי ברז.
- להבדיל כל שקופית המוח עם 1% חומצה אלכוהול 1 s שלוש פעמים.
- לשטוף כל שקופית המוח במי ברז.
- כחול שקופיות כל המוח עם 1% אמוניה מימית 1 s.
- לשטוף כל שקופית המוח פועל מי ברז למשך 2 דקות.
- מייבשים כל שקופית המוח ב- 70% אתנול (EtOH) עבור 1 s 12 פעמים.
- Counterstain כל שקופית המוח ב eosin עבור 1 דקות.
- מייבשים כל שקופית המוח ב- 95% EtOH 1 s 12 פעמים.
- מייבשים כל שקופית המוח ב- 100% EtOH.
- נקה כל שקופית המוח של קסילן ולאחר מכן החל על 2 "x 3" אינטש coverslip על גבי השקופית המוח, הסרת בועות אוויר עם הרכבה שרפי מדיה.
הערה: כל הפתרונות ממחזרת למעט מים, אתנול מספר ימים מכתים, שקופיות מרובות. כל עיבוד לאחר סעיפים המוח ממוקמים בשקופיות מתבצעת צביעת צנצנות זכוכית, אך מיכלי פלסטיק מכתימים הינם זמינים מסחרית. להחליף כל פתרון כאשר זה הופך דהוי ולשמור אותם בחוזקה מכוסה.
6. hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת של הכלבים לעורק הראש
הערה: זה מוצג באיור 1 (משמאל).
- לאחר 24-72 h ב- 10% פורמלין, לחצי נפגע בעורק באמצע של קריש הדם ולהטביע ~ 1 ס מ של עורק הצוואר פצועים ו ~ 1 ס מ של הפקד contralateral במגרה פרפין אותו.
הערה: קריש דם בתוך בעורק שביר. המתן עד הספינה תוקנה בפורמלין 10% לפני חיתוך כך קריש הדם לא מופרע. הטבעה שני הפצועים ולשלוט בעורקים, הפרפין באותו בלוק יאפשר חיתוך באותו הזמן באותו מקום בתוך כלי הדם. - חתוך פרפין בלוקים עד רמה עם מיקרוטום, הסרת פרפין נוספים כלשהם. ואז לחתוך קטעים ב- 4 מיקרומטר ל- 25 מ"מ x 75 מ"מ x שקופיות מ"מ 1 מבלי לסובב לבלוק פראפין כך הסעיפים העורק contralateral ממוקמות בחלק העליון של השקופית.
הערה: שלושה מקטעים העורק הונחו על כל שקופית, אבל אחד יכול להוסיף בהתאם כתמי עניין. - Paraffinize מבטל את כל שקופית העורק, מימה במי ברז.
הערה: בניגוד השקופית המוח אשר צריך להיות מעובד באופן אינדיבידואלי, שקופיות העורק יעובד בכמויות גדולות על ידי הצבת בצנצנות אשר מתאימים כמה שקופיות בכל פעם בלי לגעת אחד בשני. - מכתים כל שקופית העורק ב hematoxylin במשך 8 דקות.
- לשטוף כל שקופית העורק במי ברז.
- להבדיל כל שקופית העורק עם 1% חומצה אלכוהול 1 s שלוש פעמים.
- לשטוף כל שקופית העורק במי ברז.
- כחול כל שקופית העורק עם 1% אמוניה מימית 1 s.
- לשטוף כל שקופית העורק פועל מי ברז למשך 2 דקות.
- מייבשים כל שקופית העורק ב 70% EtOH 1 s 12 פעמים.
- Counterstain כל שקופית העורק אאוזין או 1 דקות.
- מייבשים כל שקופית העורק ב 95% EtOH 1 s x 12.
- מייבשים כל שקופית העורק 100% EtOH.
- נקה כל שקופית לעורק הצוואר של קסילן ולהוסיף coverslip 24 מ"מ x 50 מ"מ עם הרכבה שרפי מדיה כדי להסיר את בועות האוויר.
7. 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium כלוריד (TTC) כתמים שהגודל
הערה: זו מוצגת באיור 3C.
- המקום השני בסעיף 4 מ מ שהוסר האמצע של המוח מיד proximal בסעיף H & E לתוך בעבר מוכן 2% TTC (העורק הראשי סגר). דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפחות, מתהפך בסעיף המוח אפילו מכתים כל 5 דקות.
הערה: לאחר 20 דקות, המקטע להיות דובדבן אדום משני הצדדים. ייתכן שיהיה צורך זמן נוסף מבוסס TTC רעננות ועובי של סעיף הרקמה. - הסר את הפתרון TTC ולהחליף אותו עם paraformaldehyde 4% ב- PBS, pH 7.4 כדי למטב את חדות הצבעים.
- כאשר הניגוד בין אדום ולבן מכתים אופטימלית, מניחים פרוסות המוח TTC בין יריעות פלסטיק שקוף, יבש של עודפי הנוזלים, סריקה ברזולוציה גבוהה עבור מעקב של אזורים איסכמי.
הערה: סעיפים יכול להיות מאוחסן באופן בלתי מוגבל paraformaldehyde פתרון, אך מכתים תתפוגג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצוע הפרוצדורות מפורט במסמך זה יביא התפתחות מודל שיכול לשמש עבור הערכה מניעתי או thrombolytic של התערבויות עורקי ריטלין. איור 1A מציג מהירות זרימה בסיסית, את מהירות זרימת הדם וכתוצאה מכך לפני, במהלך ואחרי הטיפול שהוקלט על ידי תוכנה מסחרית. נתוני ההקלטה הזאת יכול לשמש כדי לקבוע את אחוז זלוף מחדש עם פגיעה העורק וטיפול במודל זה הכלביים. איור 1B מספק דוגמה של contralateral (למעלה) והן מקטעים העורק הכלבי פצוע (למטה), מוכתם H & E המאמתת את המצב מחדש המוניות בזמנו של הקרבה. שפע של תוכניות זמינות לנתח את האזור perfused של כלי השיט ע י איתור כלי הדם (ללא כגון), אשר ניתן לחלק לפי אזור הכולל של כלי השיט להגיע באחוז המוניות עם כל טיפול. איור 2 מציג כמה דוגמאות של העורק מסתמים המפורט בעלון זה כלב הדמיה פרוטוקול אשר יכול לשמש כדי לקבוע אם כגון ריטלין. בנוסף, באמצעות המכשיר זרימה מרובע כסמן, חוקרים יכולים לקבוע את האורך של כגון בכל נקודה בזמן שהאנגיוגרפיה נלקח. למרות, כאן הוצגו תמונות לפני הפציעה, 60 דקות לאחר הטיפול ברכב, בזמנו של הקרבה, החוקר יכול להתאים הדמיה לצרכים שלהם. איור 3 הוא התוצאה של הפרמטרים הדמיה מגנטית שהוחל שהגודל ~ 4 שעות לאחר העורק הראשי סגר מיד לפני ההקרבה, ניצול דיפוזיה משוקלל (איור 3 א) והן T2 משוקלל הדמיה (איור 3B) מפורט בסעיף 4 של פרוטוקול זה. למרות מראות לנו רק תמונה אחת של המערך כולו נלקח ברמות שונות במוח, יכול בגודל של דימום מוחי ושבץ נפח מזוהה רמות שונות ובאזורים של המוח, quantitated בכל נקודה בזמן הרצוי על-ידי החוקר. כימות הושלמה באמצעות תוכנה המכונה MRI ספציפי ספיציפית imager של החוקר. המכללה מכתימה את התוצאות כפי שמוצג באיור 3C יכול לשמש על רקמת המוח שבו התאים הם עדיין פעיל סמויה בנוסף לאלה שאינם. TTC יקטן enzymatically את התוצאה אדום מוכתם תאים חיים ואילו תאים מתים לא ישמרו את TTC, ובכך לא יהיה אדום. לבסוף, hematoxylin ואת אאוזין מכתים טכניקה הפגינו שהגודל דמות תלת-ממד וכתוצאה מכך צביעת תאי דם אדומים אדום בוהק אשר יכול לשמש כדי לוודא אזורים שבהם התרחש דימום.
איור 1: ניטור של זרימת הדם בעורק הראש. (א) מהירות דם העורק נציג (mL/min) הקליטה של הדופלר בדיקה מקו לפני הפציעה דרך הקרבה. (B) נציג H & E מכתים של שניהם occluded העורק הראשי (התחתון) ושליטה contralateral (למעלה). ההגדלה היא בגיל 20 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: פיקוח של זרימת הדם בעורק הראש על-ידי אוגרי נתונים. מסתמים נציג מבט נכון הכלבי העורק הראשי. התמונות צולמו בסיסית לפני הרכב אינפוזיה (א), 60 דקות לאחר אינפוזיה הרכב (B), ועל זמן הקורבן, 4.5 h לאחר סגר (C). חצים אדומים מציינים את המיקום על הספינה של FeCl3-induced פציעה היכן הטבור שהקלטת נמסרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: להחליפן בתמונות של שהגודל אחרי הטיפול הרכב. דימות תהודה מגנטית (MRI) ביצע ~ 4 h לאחר סגר, מיד לפני הקרבה, ניצול דיפוזיה משוקלל הדמיה (DWI, (א) ו- T2 משוקלל הדמיה (ב). TTC מכתים סעיף המדיאלי בזמנו של ההקרבה על חיים מן הרקמה המתה (ג). H & E כתמים המדיאלי סעיף, מיד proximal למקטע TTC, זמן ההקרבה על רקמות אשר סמויה פעיל (אדום) מאלו שאינם TTC מופחתת למוצר אדום כאשר נלקח על ידי תאים חיים, לכן, וכתוצאה מכך קטעים שניתן לכמתו שפע של תוכנה לאיתור חיים לעומת אזורים מתים. (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פרמטר ניסיוני | משוקלל T2 | דיפוזיה משוקלל |
| החזרה זמן (TR) ms | 4000 | 4600 |
| הד הזמן (TS) ms | 75 | 86 |
| היפוך זוית, מעלות | 180 | 90 |
| רכישת מטריקס | 320 x 256 | 231 x 257 |
| מספר of ממוצעים | 2 | 4 |
| המטוס תמונה ברזולוציה (פיקסלים/מ מ) | 2.4615 | 0.9333 |
טבלה 1: פרמטרים דימות תהודה מגנטית (MRI). פרמטרים MRI שפותחו עבור הכלבים T2 ו דיפוזיה-משוקלל תמונות כדי למקסם להערכה מדידה נפח שבץ ושטפי במודל פקקת הכלבי העורק הראשי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל המושרה פגיעה בכלי הדם של3 FeCl נעשה שימוש נרחב ללמוד פקקת של חיות קטנות, והוא קל לתרגם מודל בעלי חיים פרה-קליניים גדולים עם שפע של יתרונות. שינויים קלים לעבד את הפרוטוקול כלב לאפשר הניצול של שני תהודה מגנטית כדי להעריך את קו ומסוג דימום לאחר להתערבות פרמקולוגית אוגרי נתונים להערכת כלי המוניות לפני, במהלך, ו לאחר הטיפול. דגמים בעלי חיים גדולים קדחת אחרים לא למדו מיוצב ריטלין thrombi באתר של פציעה, ולכן לא יכול לנצל מסתמים, היסטולוגיה של העורק הראשי כדי להעריך את היקף המוניות מחדש עבור כל מניעה או thrombolytic טיפול. בנוסף היתרונות של חיה גדולה הכוללים רקמות בשפע לניתוח (פלזמה, שתן, איברים עבור מחקרי רעילות, וכו '), המודל בעלי חיים גדולים הרבה יותר מקרוב מחקה את קצב הלב, לחץ הדם, ודירוג קרישה בבני אדם מודלים מכרסמים. גודל נאותה עורקי המוח והן בעורק, התוצאה וחומר היסטולוגית ביולוגי יכול לשמש למגוון רחב של חקירות דלקתיות וביוכימי על כל חיה ניסיוני. יתרון נוסף של שינוי של FeCl3-המושרה מודל כלי הדם לתוך כלב הוא כי נפח דם הרבה יותר גדול ניתן לחילוץ במהלך הניסוי מבלי לשנות טסיות תגובתיות או כגון היווצרות כזה זה דם, דם מלאה והגז ספירות ניתן לנטר במהלך העירוי חבלה וסמים. בנוסף, הפגיעה הברזל ותחמוצת כלוריד יוחסה הנזק חמצון; לכן, זה לחקות נזק טרשת עורקים שעיצוב הקו קליני, אוטם שריר הלב הרבה יותר קרוב מאשר סוגים אחרים של לאור פגיעה עורקית מודלים7. לבסוף, התערבויות מכניים כגון thrombectomy, אשר משמשים שגרתי קלינית, באפשרותך לבצע טיפול תרופתי כך re-היצרות ומצב הבריאות קיר אנדותל ניתן לטפל ברקמות היסטולוגית בשפע למרובים חקירות על הכלבים אותו.
מגבלות של מודל זה מעטים אבל צריך לקחת בחשבון. הראשון, למרות נקודת הזמן, והטיפול שבחרת בפרסום זה (להקריב. 4.5 h לאחר פגיעה העורק הראשי, הרכב) לא לגרום קו מדידה או דימום, שיטה זו היא הרלוונטית קלינית לחקירה של רומן נגד קדחת וסוכנים thrombolytic כדי לקבוע את היעילות ואת המינון. אכן, הן שבץ מוחי ו/או דימום עם קדחת הראשונית להעליב או עם טיפול תרופתי (קרי: rTPA) להתרחש עם מודל זה. שנית, הכלבים עלויות רכישת, משלוח, הנדסה גנטית של אש הם די גבוהים, העלות אוסרני עד סם הוא מאופיין היטב במודלים מכרסמים.
שלבים קריטיים במרכז פרוטוקול על הפעלת טסיות, צבירת והצמדות, עיקרה של פקקת. מאז במנתח תפקוד טסיות (PFA-100) יכול להתבצע עם 1600 µL של דם מלא ב כפילויות, שיטה זו היא פשוט וקל לעקוב טסיות תגובתיות לאורך כל ההליך מבלי להשפיע על הומאוסטזיס דם. Ex-vivo מחקרים נוספים פעילות טסיות באמצעות אימפדנס או lumi-aggregometry יכול להתבצע לפני פגיעה בכלי הדם מבלי להשפיע על פקקת ניסיוני כל עוד לקיחת הדם האחרונה > 1 שבוע לפני הניתוח בנוסף לאחר פציעה הטיפול בזמן של הקרבה. כפי שכבר שוחחנו, יישומים נוספים של משתובב טבולים 50% FeCl3 עשוי להיות נחוץ תלוי מגדר, גזע, או הגיל של כל הכלבים. אנו מורשים 30 דקות לאחר פציעה סגר, מוחל מחדש טריים FeCl 50%3 עבור עוד 15 דקות אם יש צורך בכך. תהליך זה לא לגרום הבדל משמעותי בסטיית thrombolytic עם גיל או מין באמצעות ביגל למבוגרים. במחקר זה, לנו יש מבואר פעפוע קריטי, המדינה-of-the-art משוקלל הדמיה (DWI), מר הדימות מבוססת על מדידת תנועה בראונית (דיפוזיה אקראית של חלקיקים) של מולקולות מים בתוך voxel רקמות. טכניקה זו שימושית בזיהוי של שבץ איסכמי אקוטי בקרב פתולוגיות אחרות כגון גידולים על-ידי מציג דיפוזיה ברקמות hyper-סלולר או אלה עם נפיחות הסלולר הוא נמוך עם גבוה דיפוזיה מקדם17,18 ,19. דיפוזיה מפות להשתנות עם פעפוע של מולקולות מים18,1917,רקמות המוח. ערך ה-B מודד את מעבר הצבע עבור דיפוזיה של מולקולות2O H. באתר איסכמי המים חינם חוויות הנחתה האות החזק ביותר ב B-ערכים גבוהים19.
בנוסף השימוש בפרוטוקול הכלבים זה ללימודי מינון, רעילות, ואת היעילות של סוכנים מניעתי thrombolytic, בגודל של כלב עושה ניסויים thrombectomy מכני הרלוונטית קלינית ואפשריות בקלות. לעורק הראש יכולים להיות מעובדים בקלות, ויטראז'ים, המוערך ניצול פרוטוקולים עבור היסטולוגיה אנושית למחקר של תאים חיסוניים חדירה לאחר אחזור קריש דם. מחקרים אלה יהיה פרוטוקולים מפורט הבא שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד
Acknowledgments
ברצוננו להודות למרכז ומטה קוגניטיביים לדימות המוח ההתנהגותי-אוניברסיטת אוהיו על תמיכתם פיננסיים ומדעיים לפתח ולבצע תהודה מגנטית הכלביים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
