Summary
斑马鱼在生物医学研究中被用作可靠的遗传模型有机体, 特别是随着基因编辑技术的出现。当幼虫表型预计, DNA 提取和基因的鉴定可能是挑战。在这里, 我们描述了一个有效的基因分型程序的斑马鱼幼虫, 通过尾部修剪, 早在72小时后受精。
Abstract
斑马鱼 (斑马斑马) 拥有 orthologues 已知与人类疾病相关的84% 的基因。此外, 这些动物有短的世代时间, 容易处理, 显示高繁殖率, 低成本, 并且容易地接受基因操作通过微注射 DNA 在胚胎。基因编辑工具的最新进展使斑马鱼的突变和转基因得到精确的引入。在斑马鱼的疾病建模往往导致幼虫表型和早期死亡, 这可能是挑战, 以解释, 如果基因的未知。在需要样本池的实验中也需要这种早期的基因型鉴定, 例如基因表达或质谱研究。然而, 广泛的基因型筛选受传统方法的限制, 在大多数实验室仅对成年斑马鱼或死后幼虫进行。我们解决这个问题的方法是, 采用一种分离 PCR 现成的基因组 DNA 从活斑马鱼幼虫, 可以达到早在72小时后受精 (hpf)。这一时间和成本效益的技术, 改进了从以前公布的基因分型协议, 允许鉴定的基因, 从微观鳍活检。随着幼虫的发育, 鳍迅速再生。然后, 研究人员可以利用这种高通量 PCR 的基因分型方法, 选择并提高所期望的成年期。
Introduction
斑马鱼 (斑马斑马)是一种脊椎动物有机体, 广泛用作疾病调查的模型, 以及治疗假说1,2,3的临床前检验。这些动物有短的世代时间, 容易处理, 显示高繁殖率, 低费用, 并且容易地接受基因操作通过显微注射 DNA 在胚胎4。通过新的转基因和基因编辑技术的不断发展, 如锌指核酸 (ZFN)5, 核酸 (TALENs)6,7和聚集定期 Interspaced 短回文重复 (CRISPR)/CRISPR 相关 9 (Cas9) 系统8, 斑马鱼准备大大提高对几个病理条件的理解。这些技术已经被用来在斑马鱼的体细胞和生殖细胞中产生靶向性的挖空, 有效地培养转基因动物8。最近在文献中的例子包括成功地开发了癫痫的遗传模型和代谢紊乱在斑马鱼3,9,10,11,12.
随着斑马鱼基因组编辑的进展, 快速而可靠的基因分型已成为不可否认的限速步骤。在预测基因组编辑目标站点附近的特定 DNA 突变的识别是该协议的一个重要阶段。传统上, 鳍片修剪的基因分型技术通常只在青少年或成年斑马鱼身上进行。然而, 将斑马鱼饲养到成年 (> 2 月) 的时间大大延缓了研究的进展。在许多情况下, 由于关键基因的挖空 (例如疾病建模) 或功能突变导致的表型效应, 成年无法实现。此外, 一些化验需要收集幼虫, 如在 RNA 或代谢物提取, 从而涉及事先鉴定的基因型, 这可能是挑战时, 只有特殊的基因组技术可用。上述例子突出了幼虫基因分型技术的重要性, 同时也是精确的, 能够充分恢复和正常发育的幼虫。早期斑马鱼的基因分型目前似乎没有得到广泛应用;最近的一些疾病模型的出版物反映了这一点, 其中幼虫基因型是通过验尸后基因类型确定的, 而不是在实验12、13、14的执行之前分基因。本文提出了一种幼虫夹鳍策略, 旨在改进以前建立的基因分型程序。
过去, 采用蛋白酶 K 消解基因型活斑马鱼幼虫的策略导致了变聚合酶链反应 (PCR) 效率15。虽然最近公布的显微尾部活检技术提供了更有希望的结果16, 我们和其他小组无法重现的高效率和 DNA 恢复报告的作者。威尔金森等所描述的协议的一个重大倒退。16可能是尾巴组织的转移到 PCR 管。由于其显微尺寸, 很难确保鳍被正确收集和配发的吹打。为了解决这一障碍, 我们开发了一种改进的协议, 用于对大量活斑马鱼幼虫进行基因分型, 其效率为 100%9。使用 microscalpel, 鳍尾的尖端被移除并放置在一张滤纸上。该片含有组织的滤纸可以很容易地可视化, 并正确地放入 PCR 管。然后进行基因组 DNA 提取, 然后进行 PCR 扩增的感兴趣区域基因型的标本。该方法的优点有: PCR 效率高, 假阳性率低, 死亡率低。另外, 使用该协议可以对大量胚胎进行基因分型。本文所述的协议允许在 2-3 小时内用这种方法对数以百计的幼虫进行翅片修剪, 并在两天内正确识别 genotyped 鱼和尾再生。
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Protocol
有关动物的程序已获批准, 并符合加拿大动物保育委员会和渥太华大学动物保育委员会提供的动物保育指引。
1. 准备
- 通过用高压釜胶带在其内部表面上贴上9厘米的培养皿盖, 准备解剖表面。在立体声显微镜下定位。
- 放置 3-5 天后受精 (dpf) 斑马鱼幼虫在培养皿和麻醉˜1.5 毫米 Tricaine 1x E3 胚介质 (5 毫米氯化钠, 0.17 毫米氯化钾, 0.33 毫米 CaCl2, 0.33 毫米 MgSO4, pH 7.2)。
- 用剪刀或剃刀刀片切断 P1000 吸管尖端的末端, 直径为2毫米, 以容纳3的 dpf 幼虫, 压力最小。
2. 斑马鱼幼虫的鳍片修剪
- 使用改良的 P1000 微提取麻醉幼虫, 将斑马鱼幼虫放在培养皿盖上放置的高压釜胶带上。
- 用微去除幼虫周围的过量 Tricaine 溶液。该区域应尽可能干燥, 以成功的部分, 并拿起鳍, 但仍然湿, 以确保生存。
- 使用微手术刀, 在一个立体声显微镜下的尾鳍切片, 如图 1所示, 如威尔金森et al16。在切口期间, 在尾翅的颜料间隙部位, 在血液循环的极限处应用稳定的下行压力 (图 1A)。施加温和的压力以避免损坏脊索。
- 在显微镜下可视化切片鳍, 并将该片放置在 microscalpel 刀片尖端的顶端 (图 2A)。将含有鳍的 microscalpel 放在一小片滤纸的表面上。
注意: 由于在横断组织中存在黑色素细胞, 这一步骤允许将鳍可视化为一个小黑点 (图 2B)。 - 使用剪刀和镊子 (图 2C), 将含有翅片的滤纸转移到一个96井 PCR 板上, 其中包含 25 ul 每井50毫米氢氧化钠溶液 (图 2D)。
- 准备一个平底的96井板, 根据 PCR 板的标签对油井进行编号。使用改良的 P1000 吸管填充200µL 新鲜 1x E3 胚培养基, 小心收集斑马鱼幼虫使用温和的压力。将幼虫放在96井组织培养板中, 与 PCR 板相同的井数 (图 2E)。
- 确保过滤器的纸张在溶液中被充分淹没 (图 2F)。清洁 microscapel 和镊子之间的刀片, 以防止交叉污染, 通过浸渍到70% 乙醇解决方案。用干净的纸巾擦拭刀片/擦拭。
- 重复步骤 2.1-2.7, 直到所有的胚胎被修剪。
- 将幼虫储存在96井板中28摄氏度, 直到鉴定出基因型。
注意: 胚胎介质不需要改变, 因为该协议可以很容易地完成在不到2天。如果需要更多时间, 建议进行媒体更改。
3. 基因组 DNA 提取
- 密封96井 PCR 板和离心机的样品在 1000 x g 1 分钟, 以确保所有的过滤器纸被淹没在氢氧化钠溶液中。
- 为组织裂解, 加热样品在一个 thermocycler 在95°c 为5分钟然后冷却到4°c 为10分钟。
- 添加 6 ul 500 毫米三 HCl, pH 8.0 到每个样品。涡。
- 在室温下, 将该板材离心为 1500 x g, 5 分钟。
- 每个 PCR 反应使用 1.5 ul 的 DNA 上清。
- 准备 PCR 的基因型的幼虫, 如表 1-2所示。
注: 本协议测试了两个应用: 多重 PCR 反应揭示的基因型使用琼脂糖凝胶9, 和 heteroduplex 熔融试验 (HMA) 揭示基因型的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页)17。
4. 用螯合树脂提取替代基因组
- 完成步骤2.5 通过添加带修剪翅片的滤纸到96井 PCR 板, 其中含有 30 ul 5% 螯合树脂 (含配对 iminodiacetate 离子的苯乙烯-二乙烯苯共聚物)。
注: 这种树脂通常用于组织裂解和制备 PCR 准备好的 DNA 快速有效的方式18。 - 按照指示执行步骤 2.6-2.8。
- 密封96井 PCR 板, 并简要离心样品, 以确保所有过滤纸被淹没在螯合树脂内。
- 为组织裂解, 加热样品在一个 thermocycler 在95°c 为15分钟然后冷却到4°c 为10分钟。
注意: 这一步允许在 DNA 和 RNA 保持溶液时, 将极性树脂珠子的溶解和随后的结合到细胞成分中。 - 简要地离心样品颗粒树脂珠并且获取脱氧核糖核酸在悬浮。
- 按照步骤 3.5-3.6 完成基因分型程序。
5. 应用 1: 多重 PCR 后琼脂糖凝胶分析
- 下表 1, 建立了多重 PCR 反应, 以使纯合突变体, 杂合子和野生幼虫之间的区别。利用表 3中描述的循环条件, 使用96井热循环仪进行 PCR 反应。
注: pcr 反应也可以在任何其他常规 pcr 热循环仪进行。这个例子描述了使用的 PCR 策略. 9 ) 在同一复用反应中识别aldh7a1和 5-bp 插入突变等位基因。 - 在硼酸钠缓冲液中制备1% 琼脂糖凝胶, 染色 1x GelRed。
注: 20x 硼酸钠缓冲液由40毫升10米氢氧化钠制成, 1800 毫升 ddH2O, pH 调整为 8.5, 硼酸76克, 然后用 ddH2O 完成2升最终容积。 - 在1x 硼酸钠缓冲液中运行凝胶15分钟, 250 v。为方便这一过程, 如果可能的话, 使用与多通道滴管兼容的凝胶系统, 通过减少加载样本的时间来实现更高的吞吐量能力。
- 图像的凝胶下紫外线 (UV) 光允许歧视的不同基因型。
6. 应用 2: Heteroduplex 熔融试验
- 准备12% 页凝胶使用1.5 毫米间隔板和15样品梳。用12.21 毫升的 ddH2O、2.52 毫升10x 三/硼酸/EDTA ()、10毫升30% 丙烯酰胺、250硫酸铵 (APS) 和 10% tetramethylethylenediamine (TEMED) 的 ul 来制备两页凝胶。使用1x 缓冲器 (0.089 米三盐酸, 0.089 米硼酸和0.002 米乙二胺乙酸 (EDTA)) 作为运行缓冲器。
- 将 PCR 产品加热94摄氏度, 5 分钟。
- 冷却管在冰或在 thermocycler 10 分钟在4°c。
- 每 PCR 样品负载 10 ul 和8个分子量标记 ul。
- 使用垂直电泳系统1小时, 或直到分子量标记几乎达到玻璃板的脚线, 以1x 的150伏运行该页面。
- 图像的凝胶在紫外线下, 以允许歧视的不同基因型。
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Representative Results
protocoll 的效率是通过基因分型的异型十字架 (aldh7a1+/ot100, 这里显示为aldh7a1+/) (图 3A-C)9。aldh7a1ot100突变等位基因有一个5基对 (bp) 插入的第一个编码外显子的斑马鱼aldh7a1基因导致 frameshift 和丧失功能, 由于早期停止密码子9。在多重反应中使用四引物, 以获得三个独特的带, 以区分异型 (aldh7a1+/) 和纯合突变体 (aldh7a1/) 基因型 (从...... 9): Gen1_FW 5 '-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ', "Gen2_RV": 5 '-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ', "5 nt-specific_FW": 5 '-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ', 和 "重量-specific_RV": 5 '-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 ')。两个等位基因的放大使用 Gen1_FW 和 Gen1_RV 引物导致 434 bp 扩增子。293-bp 波段是由突变等位基因的特定放大产生的, 195-bp 带是专为小波等位基因而获得的, 如图 3A所示。通过 PCR, 对20µL 反应量的8µL 进行了1% 琼脂糖/硼酸钠凝胶的分析, 如图 3B所示。从样品的 98% (n = 576) 中恢复了足够的幼虫 DNA, 从而提高了 PCR 效率。用氢氧化钠技术提取的 dna, 平均每样 4.7 0.5 µL 的幼虫 dna, 在翅片活检过程中, 在30µL 体积。用螯合树脂提取 dna 的结果是相似的产量, 平均每样 3.8 0.5 µL 的 dna。从幼虫鳍 transections 收集的 dna 数量生成了足够质量的 PCR 准备好的基因组 dna, 从而可以识别基因型。每个 DNA 样本可用于˜30 PCR 扩增反应。使用底漆 Gen1_FW 和 Gen2_RV 获得的放大产品也可用于测序应用9, 它成功地确定了 5-bp 插入在纯合突变体 (aldh7a1) (图3C).通过外部服务进行了桑格测序, 测试 PCR 产品是否适合此应用。采用琼脂糖凝胶确认的纯合突变体和 WTs (每种) 的 DNA 样品 (n = 3)。高 Phred19分数 (> 30) 获得了表明高质量的读数, 除了第一和最后40基对。
该协议随后被用于基因型的各种其他斑马鱼的突变通过 heteroduplex 熔融分析。plpbp基因的plpbpot101 和plpbpot102 突变等位基因 (图 4AD) 均导致 frameshift 和早期停止密码子。为了识别plpbp斑马鱼幼虫, 用两个引物放大了第一个编码外显子, 包括突变点 (plpbp-F 5 '-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 ' 和plpbp R 5 '-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3 ')。plpbp片段在小鼠体内的放大结果为 272-bp 扩增子 (homoduplex)。从plpbpot101 获得的扩增子 (4-bp 删除等位基因,图 4C) 由 268-bp 的片段和plpbpot102 (5 bp 替代, 2 bp 删除等位基因,图 4D) 组成;270-bp, 如图 4A-B所示。在变性和退火后, 异型动物的 PCR 片段包含 heteroduplex 和 homoduplex DNA17。Homoduplex 和 heteroduplex 带可以很容易地分离和可视化聚丙烯酰胺凝胶电泳 (页)。由于突变的发生而导致的匹配和不匹配的 dna 链之间存在一个开放的角度, 导致 heteroduplex dna 的迁移速度明显慢于 homoduplex dna17。独特的迁移模式是由不同的突变产生的。因此, 异型基因型 (plpbp+/ot101, plpbp+/ot102) 将显示 heteroduplex DNA 片段, 以及复合异型 (plpbpot101/ot102) (图4A-B)。通过这种 heteroduplex 熔融试验获得了精确的基因分型, 为每个基因类型提供了独特的页面模式, 并可可视化异型突变 (图 4A-B).纯合突变体在页面凝胶中显示 homoduplex 图案, 因此与 WTs 不区分。为了区分这些基因型, 应进行另一轮的凝胶分析, 其中的 PCR 产品, 应与研究的样品混合, 如另有说明,17。
大约 90% (88/98) 的野生和异型胚胎成功地提高到成年 (> 2 月)。由于aldh7a1和plpbp是功能丧失的突变体, 显示早期死亡表型, 未经治疗的动物不能被提升到成年。然而, 所有存活的异型和成虫的基因型与幼虫修剪结果相同, 表明100% 的准确率, 用于鉴定的基因型使用幼体鳍活检程序。
图1。幼虫鳍夹.(A) 在受精后三天内未切断的幼虫鳍 (dpf)。该线代表横断部位, 位于颜料间隙内。黑色箭头显示尾血循环的限制。(B). 幼虫跟随鳍修剪做法在 3 dpf。(C) 斑马鱼鳍幼虫在 5 dpf 中再生。从 blastemal 形成的翅片再生仅观察2天后翅片横断。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。幼虫修剪的程序.(A) 幼虫放置在胶带上, 多余的胚介质被移除。在显微镜下, 鳍在颜料缺口区域被切断, 如图 1A所示。使用 microscalpel, 鳍被收集, 并放置在过滤纸表面简单地通过触摸 (B), 并可以很容易地可视化为黑点。按住含有翅片的滤纸, 并在所需区域 (C) 周围切割一个小正方形。将含有翅片的小块滤纸放入96井板 (D) 井中。在200µL 胚介质 (E) 中, 应将相应的幼虫放入平底96井板的相应井中。滤纸片应浸入溶解液 (F) 中。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。aldh7a1异型的基因分型与幼虫翅片活检。(A)。预期的结果是, aldh7a1ot100 等位基因的放大会导致 434 bp 扩增子。293-bp 波段产生于突变等位基因 (aldh7a1ot100, 5-bp 插入) 的放大, 并获得了一个 195 bp 波段的小波等位基因。(B) 从aldh7a1幼虫组织中 PCR 扩增的例子。1 kb 分子量标记显示在7车道。车道 1-6 每个代表一个单鳍活检。PCR 结果识别aldh7a1 (aldh7a1ot100/ot100) 基因型 (1 车道), aldh7a1+/ 异型基因型 (aldh7a1+/ot100) (车道 3, 4 和 5) 和重量 (aldh7a1++)基因型 (车道2和 6)。(C) 在测序的aldh7a1ot100 等位基因之间对齐, 显示 5-bp 插入突变的位置。这个数字是根据5的补充图来改编的 。9从美国的遗传学学会允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图4。plpbp复方异型 (2 bp 删除/4 bp 删除) 的基因分型。(A)。预期的结果, 如放大的多等位基因导致 272 bp 扩增子。4-bp 删除等位基因 (plpbpot101) 和 5 bp 取代 2-bp 删除等位基因 (plpbpot102) 产生扩增子长度的 268 bp 和 270-bp 分别。heteroduplex 是在异型基因型 (plpbp+/) 中的一个多等位基因与突变等位基因之间形成的。由于不匹配的等位基因而形成的 heteroduplex 会导致凝胶内带的延迟与 homoduplex。(B). 由plpbp+/ot101x plpbp+/ot102 十字的后代的幼体鳍片引起的 PCR 扩增。1 kb 分子量标记显示在1车道。车道 2-10 每个代表一个单鳍活检。PCR 结果识别突变基因型 (plpbp异型plpbpot101/ot102, 车道 2, 4 和 8), 异型基因型 (车道 3, 6, 7, 9 和 10) 和基因型 (车道 5)。(C) 在测序的plpbpot101 等位基因之间对齐, 显示 4-bp 删除突变的位置。(D). 测序的plpbpot102 等位基因之间的对准显示 2-bp 删除和 5 bp 替代 (粗体) 的位置。请单击此处查看此图的较大版本.
| 组件 | 20 ul 反应 | 100反应 | 最后的轻质。 |
| 无核酸酶 H2O | 7.45 ul | 745 ul | |
| 去-Taq 2x (完成公司有关, M7122) | 10 ul | 1000 ul | 1x |
| 底漆 Gen1_FW | 0.25 ul | 25 ul | 0.125 微米 |
| 底漆 5 nt-specific_FW | 0.3 ul | 30 ul | 0.15 微米 |
| 底漆 Gen2_RV | 0.25 ul | 25 ul | 0.125 微米 |
| specific_RV 底漆 | 0.25 ul | 25 ul | 0.125 微米 |
| Dna | 1.5 ul | -- |
表1。该协议中aldh7a1等位基因多重 PCR 反应条件。所用引物如下: Gen1_FW 5 '-ATGATGCAGCGCGTGCTGAC-3 ', "Gen2_RV": 5 '-CCCTTTGAACCTCACAGGAGTT-3 ', "5 nt-specific_FW": 5 '-TGTTTTCAACGGTTCAACGG-3 ' 和 "重量-specific_RV": 5 '-TCCCTGTCCTCCCCAAGAAC-3 '。引物股为10µM。
| 组件 | 13 ul 反应 | 100反应 | 最后的轻质。 |
| H2O | 3.25 ul | 325 ul | |
| 去-Taq 2x (完成公司有关, M7122) | 6.25 ul | 625 ul | 1x |
| 底漆固件 | 1 ul | 100 ul | 0.77 微米 |
| 底漆 | 1 ul | 100 ul | 0.77 微米 |
| Dna | 1.5 ul | -- |
表2。用于plpbp等位基因的PCR 反应条件。所用的正向底漆为PLPBP 5 '-GCACTCTGGCTATGTGGAGA-3 ' 和反向, PLPBP R 5 '-AGCTGTCACTCATCCCTCGT-3 '。引物股为10µM。
| 循环步骤 | 临时。 | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 95°c | 3分钟 | 1 |
| 变性 | 95°c | 30秒 | 36 |
| 退火 | X °c | 30秒 | |
| 扩展 | 72°c | 20秒/kb | |
| 最终扩展名 | 72°c | 5分钟 | 1 |
| 4°c | 举行 |
表3。此协议中使用的 PCR 条件。
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Discussion
基因编辑工具已经被用来精确地引入突变和转基因在过去几年斑马鱼5,6,7,8。在斑马鱼进行疾病建模时, 早期幼虫或幼年表型通常观察到9、12、13、14。这里提出的协议描述了从小斑马鱼幼虫尾活检中提取 PCR 准备好的 DNA, 使幼虫的基因分型为 3 dpf。基因型的早期鉴定对于几个实验室的应用至关重要, 尤其是在不太可能发生的9。从早期就知道基因型, 也促进了突变体的生存研究和分析。该议定书对于提高特定基因型幼虫成熟度也特别有用。幼虫基因分型在世界各地的斑马鱼实验室中尚未得到广泛应用, 本议定书旨在促进这种技术的传播。在操纵横断鳍时, 使用这种方法可以对样品中的 DNA 存在有信心;在整个处理过程中, 翅片活检可以很容易地被看成是滤纸上的一个黑点。这是威尔金森发表的《议定书》的一个重要改进。16。
必须正确遵循协议中的几个关键步骤以获得质量结果。首先, 幼鳍的横断必须发生在色素间隙, 远端到血液循环的极限, 以避免出血。这保证了幼虫在鳍状活检中的存活。此外, 过滤纸上的黑点, 标记了鳍的位置, 必须在将滤纸放在氢氧化钠溶液中之前观察到。这保证了鳍组织 (因此, DNA) 在每个样品中的存在。过滤纸也必须浸泡在氢氧化钠溶液中, 以保证细胞裂解和成功的 DNA 提取。由于仅使用孵出的幼虫, 此项议定书未在年轻年龄比3个 dpf 测试。对基因型年轻的胚胎 (孵化 < 3 dpf) 绒毛膜清除需要。如果 pcr 扩增不足, 应采用标准 pcr 优化策略 (例如,不同的底漆浓度、退火温度和/或 DNA 浓度)。虽然提取了足够的 dna 以成功地执行几种 PCR 反应 (如aldh7a1和plpbp基因分型示例所示), 但在这种鳍修剪过程中获得的 dna 浓度很小 (每µL 5样本) 因此, 增加 DNA 在 PCR 反应中的浓度, 可能会使放大的成功率更高。
该协议提取的幼体鳍 DNA 可用于几种扩增反应, 允许准确地鉴定斑马鱼的基因型和高通量。在页凝胶中 heteroduplex 熔融测定可用于鉴别不同的突变17。鉴于30的 dna ul 是每个样本获得的, 而 1-1.5 ul 的 dna 被用于每一个 pcr 反应, 大约 30 pcr 反应可以运行每提取样品。PCR 产品也适用于桑格测序应用;获得了高质量的读数, 允许准确确认的aldh7a1和纯合突变序列。斑马鱼幼虫基因组 DNA 提取在研究中有许多应用。开发这项议定书的最初目的是为了有效地基因型幼虫不能达到成年由于特定突变在aldh7a19。此外, 该议定书还使基因型的分离和癫痫相关表单的观察, 特别是从幼虫期起9的aldh7a1/鱼。使用此幼虫修剪程序9, 可以准确地将每个基因型的幼虫汇集到 RNA 提取或代谢物提取等方法上。总之, 经过短时间的训练后, 一位经验丰富的调查员可以使用这种简单而高效的协议, 只需要最低和廉价的试剂, 每天例行执行数以百计的鳍片剪辑。使用这项议定书使这项研究成为可能. 希望能为更广阔的斑马鱼社区提供类似的目标。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
作者希望感谢稀有疾病模型和机制 (RDMM) 网络 (由加拿大卫生研究所 (卫生研究院) 和加拿大基因组资助)。CK 获得 UROP 奖学金 (渥太华大学) 的支持。DLJ 得到加拿大 Vanier 研究生奖学金的支持。由加拿大卫生研究院 (卫生研究院) 博士后奖学金奖资助。作者感谢美国遗传学学会批准发布这项协议, 并使用修改的补充图5的修订,等等。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
References
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