Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.
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Methodenartikel
Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.
Einleitung
Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo 1,2 ,3,4,5,6,7. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wieder....
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Protokoll
Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.
1. Vorbereitung von Imaging-Kammern
-
Imaging-Kammer19
- Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).
- Slice-Abst....
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Ergebnisse
Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadium. E.......
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Diskussion
Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit können d.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken für ihre Beratung auf die AbScale Experimente, Charles Yokoyama zur Bearbeitung des Manuskripts, Atsushi Miyawaki und Hiroshi Hama Eriko Ohshima und Miyuki Kishino für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Forschungsgeldern aus RIKEN, t.h. und Grants-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan, t.h. unterstützt (Innovative Bereiche "Mesoskopischen Neurocircuitry"; 22115004) und S.S. (25890023).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Crym-egfp transgene Mäuse | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgene Mäuse | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato Mäuse | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silikonkautschukplatte | AS ONE | 6-611-01 | 0,5 mm |
| Dicke Silikonkautschukplatte | AS ONE | 6-611-02 | 1,0 mm Dicke |
| Silikonkautschukplatte | AS ONE | 6-611-05 | 3,0 mm Dicke |
| Petrischalen | Falcon | 351008 | |
| Deckglas | Matsunami | C022241 | |
| Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 488 Konjugat | Invitrogen | C22841 | |
| Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 555 Konjugat | Invitrogen | C22843 | |
| Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 594 Konjugat | Invitrogen | C22842 | |
| Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 647 Konjugat | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G Hamilton Spritze | Hamilton | 701N | |
| Injektorpumpe | KD Scientific | KDS 310 | Pons Injektion |
| Injektorpumpe | KD Scientific | KDS 100 | Superior Colliculus |
| Injektion Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Natrium-Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isofluran | Pfizer Lidocain | ||
| AstraZeneca | Xylocain Injektion 1% mit Adrenalin | ||
| Bohrer | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene mikrofibrillärer Hämostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Chirurgische Seide | Ethicon | K881H | |
| Inkubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glaspipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Elektrodenabzieher | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, leicht | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Kochsalzlösung | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyd | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Wolframnadel | Inter medical | Φ 0,1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL Kunststoffrohr | Falcon | 352070 | |
| α-Thioglycerin | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Zwei-Photonen-Mikroskop | Nikon | A1RMP | |
| Objektive für den Wasserimmersionsbereich mit langem Arbeitsabstand | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Objektive für den langen Arbeitsbereich mit Wasserimmersion | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorischer Tisch | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL Kunststoff Tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL Kunststoff | Tube Eppendorf | ||
| Harnstoff | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-Sorbit | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β--Cyclodextrin | Tokyo chemische Industrie | M1356 | |
| γ- Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-Acetyl-L-Hydroxyprolin | Essentielle Wirkstoffe für die Haut | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai Tesque | 13445-45 | |
| Rinderserum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1,1 g/ml) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbiert sekundär Antikörper, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Ziege anti-Kaninchen IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Ziege anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Ziege anti-Maus IgG (H+L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Konfokalmikroskop | Olympus | FV1000 | |
| Wasserimmersion Objektive mit langem Arbeitsabstand | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
Referenzen
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat....
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Nachdrucke und Genehmigungen
