Summary
ここでは、確立されたセルラインの嫌気の長期培養を可能にする新しい手法について述べる。テストされた最大生存期間は 17 日です。このメソッドは、細胞毒性薬のテストと、anoxically 複製細胞の生理機能の探索に適しています。
Abstract
腫瘍と幹細胞ニッチにおける中点と共に最も粘膜表面が無酸素体の地理的な領域です。先行研究により平地 (空気 5% CO2 ) で孵化が示す低酸素または限られた可能性 (2-3 日) で無酸素インキュベーション (遊離酸素の不在) 結果続く条件 (低酸素のレベル)。小説の方法論は、(少なくとも 17 日; 最大時間テスト) の無酸素の培養を可能にする開発されました。この手法の最も重要な側面は、システムに酸素が生じないことを確認することです。これは、脱ガス、メディア、フラッシュ チューブや料理、フラスコ、ピペット、嫌気性ガスの混合物 (H2CO2N2) と無酸素 (無酸素) 環境に釣り合うために材料を許可することによって続いてによって得られる使用する前に。ときに得られる顕微鏡写真には、成果物が含まれていないことを確認するため顕微鏡写真を取得、追加のケアを行使しなければなりません。酸素のない場合は、細胞の形態を大幅に変更します。嫌気成長のすべてのセルの 2 つの異なる型が記載されています。成長し、酸素のない状態で哺乳類の細胞を維持する能力は、細胞生理学、モデルの相互作用、および小説がん新薬開発の生合成経路の特性の解析に適用できます。
Introduction
固形腫瘍、幹細胞ニッチと粘膜の表面を裏から細胞が低酸素レベル、無酸素1,2,3、4を含む環境で存在します。通常の生理学的状態の酸素は低酸素血症低酸素 (酸素の完全な欠如)5,6のそれを越える異なります。大気中の酸素に悪影響哺乳類細胞複製劣化酸素条件下での in vitro細胞成長を最適化できる実現は、1970 年代初頭に報告されました。リヒターら7は、酸素レベル (低酸素) の 1-3% が大気中の酸素 (20%) と比較してめっき効率を高めることを示した。ヒト二倍体細胞の寿命は、低酸素培養条件8にも拡張されます。
酸素店が劣化 (例えば、激しい運動中に)生体内で、低酸素の条件が発生する発酵 (嫌気呼吸) に好気性の呼吸からの骨格筋における ATP の生産をスイッチにより前記の乳酸9の最終製品。悪性腫瘍、内部の病理、腫瘍の質量は貧しい血管新生による無酸素に低酸素10。義務づける嫌気性菌1によって植民地化腫瘍インテリアで腫瘍内部に限られた血流の影響は独立して検証します。機械論的に、低酸素の腫瘍細胞の生存は、低酸素誘導因子 1 α 遺伝子の発現に依存すると考えられる (HIF1-アルファ)、低酸素4,11初期の自発的な応答であります。,12. HIF1-アルファ、 HIF1をバインド熱ショックタンパク質に起因する低酸素の条件の下で-アルファ プロモーターと遺伝子転写12活性を上昇させる。これら熱ショック蛋白質は腫瘍低酸素環境で見られる様々 な表現型の誘導を支援するためと考えられています。これらの表現型は、細胞膜糖輸送担体の発現増加と解糖系 (Warburg 効果)13の率を表わします。その結果、乳酸発酵するミトコンドリアの酸化的リン酸化からスイッチです。
無酸素の生存はまた生存現象14,15をサポートするグルコースに選択肢を利用できます。最高の学び哺乳類の例はほくろのラットは、果糖駆動糖発酵経路14を介して酸素なしにほぼ 20 分間生き残ることができます。特定の魚の代替の適応が発生します (例えば、大幅に長く生き残ることができる鯉 [フナsp] の期間にターミナルの副産物としてエタノールと解糖系を使用して)15。両方のケースで発酵は酸素のない状態での生存を可能に代謝を駆動します。無酸素の生存のための現在の仮説は、長い間HIF1として-16嫌気的条件下で発生する酸素の必要性なしに、低酸素症、ミトコンドリア呼吸時にアルファがアクティブします。さらに、細胞は細胞生存17に有害であることを証明できる酸化ストレスを避けるので発酵経路の低酸素・無酸素の生存のための使用が腫瘍の生存率を高めることを仮定します。この仮説は、心筋、低酸素血症が腫瘍細胞17は、酸化ストレスを減少させることを示す最近の研究によってサポートされます。
日には、無酸素の哺乳類細胞の生存のための発酵経路の本質染み付いている文献、ため、できないこと 3 日以上酸素の完全な欠如に哺乳類細胞には、大部分の。しかし、細菌の嫌気性の生存のためには、解糖系の代わりに発生します。ある特定の細菌の窒素または硫酸 (他の化合物) の間では、酸素18の不在のチトクロム酸化酵素システムのターミナル電子アクセプターとして使用できます。ミトコンドリアが細胞にエネルギーを提供する 154 万 2000 年19 海の酸素化前に、の最後の普遍的な共通の祖先から分岐後並行発生した細菌や真核生物の進化が推定されています。.研究者は、分離ミトコンドリアがターミナル電子アクセプターとして亜硝酸の酸素の存在下で ATP を作り出すことができることを示しているので細胞が酸素のない状態で 3 日間よりも長い期間にわたって機能すると仮定するが妥当です。20,21,22,23. 本研究の方法論は多数の細胞の嫌気性の哺乳類細胞の成長のためのユーティリティ。
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Protocol
1. 様々 な哺乳類細胞の嫌気性培養メディアを準備します。
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無酸素細胞文化25の完全な PS 74656 培地を作る。
- 50 mL の脱イオン水の亜硝酸イオンの 17.25 g を溶解して滅菌亜硝酸原液 (100 x; 5 M) をし、それを殺菌するためにフィルターします。
- 110 mg/l L-グルタミン, ピルビン酸ナトリウムと 10% 牛胎児血清の 584 mg/L の低血糖 DMEM (ブドウ糖 1 g/L) の 50 mL あたり亜硝酸原液 0.5 mL を追加 (FBS; 熱不活化)。
注: FBS 濃度の有毒である 10% より大きいを使用します。テスト 1 つの癌細胞株は、注意、亜硝酸 (MDA MB 231、乳房癌細胞株) メディアの低い耐性を持っていたおよび、したがって、亜硝酸の不在で育った。さらに、PS 74656 媒体が調べたすべての細胞の成長をサポートされています (n = 9)、特定の細胞 (例えば、Vero 細胞) 細胞濃度が高いと高グルコース (4.5 g/L) DMEM で PS 74656 で高い生存率を展示25。 - 滅菌 50 mL の円錐形遠心チューブに培地 20 mL を配置します。キャップを締めていません。それは緩いはずです。
- 解消ガス媒体で真空ベルジャーのチューブを配置することによって、約 45 ° の角度、媒体の表面積を最大化します。
- 部屋の温度で真空ポンプまたは同等のものを使用して真空を適用します。泡はもはや観察されない (24-48 h) までの真空を維持します。
- 瓶からチューブを削除し、すぐに中への空気の導入を最小限に抑えるためにチューブをシール、キャップを閉じます。
- 商業の嫌気性チャンバーにチューブを置きます。
- チューブ キャップを緩めます、少なくとも 24 のチャンバーで嫌気性ガスの混合物の平衡にチューブの大気を許可します。
注: それが尽きるまで媒体を商工会議所でなければなりません。チューブ フラッシュ プロセスをスピードアップするため無菌転送ピペットを使用して無酸素ガスの混合物で、少なくとも 3 倍は N、CO2H2から成っている無酸素ガスでいっぱい2. - ドガのすべてのチューブ (10-15 分) チューブをシールし、商工会議所に配置する前に上記のように嫌気性チャンバーに配置されます。使用前に 1.5-2 mL 転送ピペットを使用して嫌気性ガス混合物でそれをフラッシュまたは無酸素とフラッシュされているピペット チップ ガスの少なくとも 3 倍。
- 嫌気性チャンバー中に無菌脱マイクロ遠心チューブに媒体の 100 μ L を取り外してチャンバ内酸素プローブを使用して溶存酸素のそれをテストします。
注: 使用する前に製造元のプロトコルあたり酸素電極を校正します。正しく脱と釣合い嫌気性ガス混合メディアの測定値は、0 です。
注意: 測定値は 0.3 ppm の酸素を超えている場合、は、媒体を平衡により多くの時間が必要なので、嫌気性チャンバー内のメディアをインキュベートに進みます。
2. 無酸素栽培様々 な哺乳類細胞株の
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指定日-1
- 3 24 ウェル プレート (80% 合流) の細胞の十分な数を提供するために、無酸素と比較文化コントロールの 90% 合流 T150 フラスコ細胞 (37 ° C、5% CO2) に拡張します。
注: この研究では、hela 細胞 229 および Vero 細胞が使用されました。このプロトコルはまたテストされ、成長と 7 他のセル行の25の維持の成功した証明しました。 - 吸引フラスコからメディアを取り出して、HBSS の 10 mL で洗います。
- 5 ml のトリプシンのメディアを交換してください。セルを視覚的にプラスチックからデタッチするまでフラスコを揺り動かしなさい。、トリプシンのほとんどを吸引し、付着性のセルを除去するフラスコをタップします。高グルコース DMEM の 10-15 mL を追加 (グルコースの 4.5 g/L、110 mg/L L-グルタミン、10% の FBS、ゲンタマイシンの 50 μ g/mL)、トリプシンを不活化します。
- すべての細胞塊が中断されるまでに 25 mL のピペットを使用してセルをカップ刻んだ。
- セルをカウントし、標準検定とトリパン ブルー色素排除法または自動化された同等を使用しての生存率を決定します。
- 105セル/mL x 2.24 の細胞密度に前述高グルコース DMEM でセルを中断します。
- 24 ウェル培養プレートの井戸に細胞懸濁液の 1 mL を追加 (2.24 105細胞/ウェル x; 80% 合流)。無酸素の文化とコントロールによる文化の種子 1 プレート。
- 37 ° c 24 時間の培養条件 (5% CO2) で細胞を孵化させなさい。
注: セルは様々 な広い板にめっきすることが。ただし、フラスコで無酸素成長細胞を播種酸素導入のリスク システムにしない限り実行されます注意を払っても大気中のガスを完全に洗い流す。
- 3 24 ウェル プレート (80% 合流) の細胞の十分な数を提供するために、無酸素と比較文化コントロールの 90% 合流 T150 フラスコ細胞 (37 ° C、5% CO2) に拡張します。
-
指定日 0
- 平地培養 24 時間後嫌気性チャンバー (商業嫌気性チャンバー; に無酸素の成長のためプレートを配置します。図 1)。
- 嫌気性チャンバーに 24 h の順応されて抗生物質無料デ熟れた PS 74656 媒体媒体をすぐに変更します。湿ったタオルでコンテナーにプレートを置き、疎の水分を維持するためにそれを閉じます。
注: 平地成長板は、すべての治療法は、大気条件下で行われる例外と同じ処理されます。
-
指定日 1
- 嫌気培養の日 1 は 80% N210% の CO210% H2の標準的な嫌気性ガスの混合物が含まれている商業嫌気性チャンバー内培養 24 時間後に開始します。
- さまざまな期間のセルを孵化させなさい。
- 時間の経過とともに色の変化のための嫌気性媒体を監視します。
注: 赤オレンジからマゼンタの色シフト信号媒体を変更する時間です。発生するまで 2 週間かかるでしょう。赤オレンジ黄色に培地の色ずれは、細菌汚染の存在を示します。 - 中は赤からマゼンタに変化したときは、吸引して無宿者セルを削除します。
- 脱、嫌気性ガスの無宿者のセルと吸気の使用済みメディアの場所平衡 microfuge の管、シールが、安全性し、遠心分離 (326 gx; 10 分室温で) それらを確認しながらチューブを閉じます。すぐに井戸に吸気のメディアを新しい脱 PS 74656 培地 1 mL に置き換えます。
- それを開く前に嫌気性チャンバーに播種細胞および microfuge の管を配置します。使用済み培地を吸引し、新鮮な脱 PS 74656 媒体および microfuge の管に 1 ml の容量にそれを置き換えます。
- 24 ウェル培養プレートのウェルにチューブからセルを返します。
3. 嫌気培養細胞の顕微鏡観察による形質細胞分化の評価
-
嫌気性チャンバー中に嫌気性ガス混合物でフラッシュ ジッパーのついた箱にプレートを置き、ボックスを閉じます。
注: ボックスは、水分を提供し乾燥からプレートを防ぐため少し湿らせたペーパー タオルを含める必要があります。顕微鏡、サンドイッチ袋は薄いのでベストを働かせます。- 顕微鏡下で細胞を観察するには、完全に袋を密封、商工会議所から取り外します。
- 慎重に板の上にビニール袋を伸ばす、カメラの添付ファイルと逆の位相差顕微鏡を使用してセルを調べて、様々 な倍率での顕微鏡写真を取る。
- 室に密封された袋のプレートを戻り、2.3.3 の手順で説明するように孵化を続けます。
- 懸濁液にある無宿者セルを別々 に分析するには、手順 2.3.5 に示した手順に従います。
注: これらの細胞は好気性をテストするため使用できます。 または嫌気性チャンバーこの人口の特定のテストのために返すことができます。
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Representative Results
このプロトコルの強さには、長寿と複数の細胞の成長のサポートと深遠な変化と細胞形態25の発散があることの認識があります。この研究の最も重要な要素は、転送と厳密な嫌気下で細胞の維持です。これは、嫌気性チャンバー構成プロトコル (図 1) を最大化する顕微鏡または他のテストのいずれかのセルが削除される保証は、密閉された環境で保たれます必要があります。までに、無酸素生存の範囲細胞不滅癌の 15-17 日であったし、を 17 日の変形細胞 (無酸素成長のため上映 9 セル行)。実行可能なセルのレベルこれらの細胞は、無酸素状態に移動した後は、彼らが安定する前に少なくとも 10%、90%、最大を避けた。デュアルの表現型に戻されるすべての細胞 (テザーと無宿者) 時間経過と共に増加中断のセルの割合。数週間の長期の潜伏後でさえも残っていくつかの連結の細胞が、細胞の大部分は、丸みを帯びた無宿者形態 (図 2)。報告、これらの無宿者細胞が現実的で、細胞周期を通じて進んだです。血糖値と亜硝酸濃度に調整する必要がある変数が含まれていることに注意してください。つまり、平地と無酸素インキュベーションの両方をサポートする機能のためにテストされた 60 以上の異なるメディア製剤から PS 74656 中生存とテストのほぼすべてのセル行のレプリケーションをサポートすることができた。
重要な観察だったテスト、2 つの異なる表現型、テザーと無宿者 (図 2) にセルに関係なく、無酸素の細胞の分化。平地の単層細胞と同様、連結の細胞培養プラスチックに付した。ただし、添付ファイルは弱く、簡単に trypsinize または平地の条件下で発生した添付ファイルよりも、削って外します。さらより多くのスピンドル (樹状突起) 拡張26で細胞の形態が小さかった。観察 2 番目の携帯電話 morphotype は、懸濁液 (すなわち、無宿者細胞) の細胞だった。これらの細胞は、小さいセル サイズとなり、細胞質に四捨五入した組織培養処理プラスチックの存在下で浮遊単細胞サスペンションに自発的に変換されます。通常酵素の適応を必要とする、凝集体の成長、無処理組織培養容器を必要とする、その平地のカウンター パート27より大きい古典的な懸濁液の培養細胞は異なっています。時間をかけて、主につなぎ縄でつながれた単分子膜から無宿者細胞懸濁液中にシフトする無酸素細胞集団を観察できます。懸濁液のこれらの細胞が実行可能で、複製する;したがって、ケアがされなければならなかった上清を削除する必要があります。また、ノートは、培地を必要としない全体の嫌気培養期間を変更することです。その平地コントロールと対照をなして、無酸素インキュベーションの下で培地の pH インジケーターもあった (すなわち、残った赤) に変更します。調査官は無宿者細胞を収穫する媒体が変更される、細胞は嫌気性チャンバー内でしっかりと嫌気性ガス フラッシュ マイクロ遠心チューブが閉じているを使用して得られます。連結セルの洗浄セル、任意の露出は酸素を除去するために商工会議所のプロシージャも実行する必要があります。
長期栽培の最終セル実行可能性は、かなりの程度、使用されているセルと合流する井戸やフラスコが当初シード (図 3および4) に依存します。良い出発点は 80%、最適な成長の最大のチャンスを持っていたと述べた。さらに、セル行依存損失生存率の 10% から 60%、初期の 2-4 日間で発生します。しかし、この実験のパフォーマンス中に残りのセルは細胞周期を通って循環し、28をレプリケートします。細胞培養の長寿への播種の合流影響は図 3と4で見ることができます。初期の合流点の 80%、60%、40 %24 ウェル プレートで HeLa 229 および Vero 細胞を播種 (100% 合流 = 105細胞/ウェル x 2.8) と、17 日間の酸素の存在下で培養します。229 HeLa 細胞の無酸素成長に 80% の初期シードの合流点で最適化されました。対照的に、Vero 細胞の最適な合流をシード 60% であった。これは当初使用セル行に依存して播種密度を最適化する必要性を示しています。
図 1: 哺乳動物細胞の培養のための嫌気性チャンバー セットアップ モデル。必要最小限の材料は、組織培養プレート、無菌転送 pipets、バイオハザード バッグ、解除包まれたメディア、維持しながら顕微鏡にプレートを転送するメディアまたはその他の液体、ジッパーのついた袋の廃棄のための管嫌気的条件。
図 2:無酸素 HeLa 細胞の形態学的分化します。(A) このパネル平地 HeLa 細胞制御の位相差顕微鏡を示します 4 日後接種、20 倍の倍率。(B)このパネルに表示されます無酸素の HeLa 細胞 17 日後の接種 (と、そのまま 1 日 PS 74656 媒体やシード 80% の合流点、20 倍の倍率から)。(C) このパネルは、無酸素 24 ウェル プレートを含む密閉されたビニール袋の内側に水滴の顕微鏡成果物を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:培養可能な HeLa 229 に無酸素の比率は細胞ポスト 17 日インキュベーションします。このパネルは、比較対照と比べて PS 74656 中 229 HeLa 細胞生存率の播種密度の効果を示しています。結果は平均 ± SEM. として表示されます。
図 4:17 日後の培養細胞の比による実行可能なベロに無酸素。このパネルは、比較対照と比べて PS 74656 中ベロ細胞生存性に播種密度の効果を示しています。結果は平均 ± SEM. として表示されます。
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Discussion
このメソッドは、酸素のない状態で長期間培養初めて哺乳類セルを表します。現在の観測に基づいて、無酸素成長機能を介して非発酵的経路嫌気性成長が表現型の相違で起因した哺乳類細胞ラインの28日間で普遍的なようであります。これはテストしたすべての細胞の観察されました。嫌気培養細胞の比率を増やす丸くなった、懸濁液のような人口を開発し、レプリケートすることができた。基板に付けられて残った二次電池の種類しかし、細胞の形態は、スピンドル (樹状突起) 図形に戻ります。これらの知見は解析と無酸素培養栽培に関する見解の一般的なエラーを指摘します。哺乳類細胞培養条件 (5% CO2) 栽培がラウンド アップ、デタッチすると、彼らが死んでいることを一般に認められます。逆に、酸素の場合は、不在を切り上げている細胞を育つセルのため正しく、戸建、単に形態学的に異なる細胞の集団。
無酸素の成長条件の最適化はセルライン依存です。中 PS 74656 全体的にサポートされているすべてのセルの成長線平地と MDA-MB-231 を除いて、無酸素の成長条件下で亜硝酸の不在の成長を優先する乳房癌細胞株。奨励の観察は、ウェルあたりの細胞の 98% ダイオフでも残りの部分をレプリケートするな人口に終っています。重要なアクションは、のみ少数の細胞は顕微鏡で直接観察した場合でも文化を維持することです。したがって、剥離細胞の死んだ、トリパン ブルー色素排除または代替細胞生存率検出法のいずれかを確実にする注意が必要です。それは、細胞数の減少が大きいと十分な井戸をその後の実験の適切な合計のセル番号をシードする必要があります注意してください。実行可能なセルの予想される損失は細胞と合流依存; を播種したがって、時間をかけて、最適な細胞数は実験的に決定する必要があります、他の細胞との調査結果から推定することはできません。良い出発点は、80% の合流点最適成長の最大のチャンスを持っていると述べた。それにどんなに、簡単な手順で嫌気性の手順中に酸素への露出が報告された自発的な細胞HIF 1により調査結果を妥協は明記する必要があります-アルファ応答11,12。
この手順では、最も重要なステップは、媒体、チューブ、その他器具と使用される材料の脱ガス処理のことです。酸素の非常に低水準の導入は、発酵代謝から嫌気性の呼吸への移行を停止でした。また、低酸素、無酸素ではない測定で実験ができるように発酵代謝を長引かせる可能性がそれ。細胞毒性と化学療法の活動を測定するこの新しいプロシージャの使用は、固形腫瘍の治療における薬の失敗を説明する助けることができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、中西部大学研究局と主催のプログラムを彼らのサポートありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
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