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Immunology and Infection

एक उच्च प्रवाह Cre-लोक्स सक्रिय वायरल झिल्ली फ्यूजन परख एचआईवी के अवरोधकों की पहचान के लिए-1 वायरल झिल्ली संलयन

Published: August 14, 2018 doi: 10.3791/58074
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute, 2Department of Biology, New Jersey City University

Summary

हम एक सेल का वर्णन करने के लिए आधारित परख एचआईवी पर रिपोर्ट करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से 1 फ्यूजन प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा । यह वायरल प्रवेश के अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता (विशेष रूप से संलयन कदम पर) सेल में मुक्त और सेल-टू-सेल संक्रमण प्रणालियों ।

Abstract

इस परख के लिए विशेष रूप से एचआईवी पर रिपोर्ट-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के जरिए 1 संलयन (GFP) प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा detectable बनाया गया है । एक एचआईवी-1 रिपोर्टर वायरस (एचआईवी-1 ढकोसला-iCre) एचआईवी में Cre recombinase डालने-मैट्रिक्स और झूठ polyprotein के कैप्सिड प्रोटीन के बीच 1 जीनोम के द्वारा उत्पंन होता है । वायरस कणों में Cre recombinase की एक पैकेजिंग में यह परिणाम है, जो तो एक लक्ष्य सेल लाइन में जारी छुरा एक Cre recombinase-आरएफपी स्विच कैसेट के लिए लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सक्रिय व्यक्त । बेसल राज्य में यह कैसेट आरएफपी ही व्यक्त करता है. लक्ष्य कक्ष में Cre recombinase के वितरण के बाद, आरएफपी, loxP साइटों, उत्पाद, GFP अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा पार्श्व । इस परख के लिए वायरल प्रवेश के किसी भी अवरोधकों का परीक्षण किया जा सकता है (विशेष रूप से संलयन चरण में) सेल मुक्त और सेल में करने के लिए सेल संक्रमण प्रणालियों और purinergic रिसेप्टर विरोधी के एक वर्ग की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में एचआईवी के उपंयास अवरोधों-1 वायरल झिल्ली संलयन ।

Introduction

उपंयास एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा के लिए आवश्यकता एचआईवी के अवरोधकों के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीन के विकास के लिए प्रेरित किया है-1 प्रविष्टि । चुप-iCre रिपोर्टर परख विशेष रूप से मेजबान सेल झिल्ली1के साथ वायरल झिल्ली संलयन को मापने से एक सेल में फ्यूजन कदम पर वायरल प्रविष्टि के अवरोधकों की पहचान करने के लिए विकसित की है-सेल संक्रमण प्रणाली । एक परख उपंयास अवरोधकों कि एचआईवी के प्रारंभिक चरण-1 वायरल झिल्ली संलयन के बिंदु तक संक्रमण पर विशेष रूप से काम के लिए स्क्रीन को विकसित किया गया था । कोशिका-कोशिका संक्रमण को मापने के लिए एक चुनौती यह है कि प्रारंभिक इनोक्युलम में संक्रमित दाता कोशिकाओं और संक्रमित लक्षित कोशिकाओं को शामिल किया जाता है, इसलिए नए संक्रमण को मापने से इनपुट कोशिकाओं से भेदभाव करना मुश्किल होता है । आदर्श प्रणाली एक heterologous जीन मार्कर कि एक लक्ष्य कोशिका संक्रमण की दीक्षा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है शामिल है और दाता सेल में मौजूद नहीं है । एक लोकप्रिय वायरल एक वायरल प्रोटीन के आधार पर परख मिश्रण सामग्री-एंजाइम फ्यूजन, दोष-Vpr, प्रभावी हो सकता है, लेकिन उच्च प्रवाह के लिए सीमाएं हैं, सेल सेल स्क्रीनिंग2। इस परख एक बीटा lactamase (दोष) रिपोर्टर जीन है कि एचआईवी से जुड़े-1 Vpr, virions में पैक, और वायरल झिल्ली संलयन पर लक्षित कोशिकाओं में दिया शामिल है । सब्सट्रेट CCF2-AM लक्ष्य कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में भरी हुई है और दरार पर एक प्रतिदीप्ति बदलाव से गुजरती है । CCF2 सब्सट्रेट महंगा है और उच्च प्रवाह स्क्रीन के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है । आदेश में दाता और लक्ष्य कोशिकाओं भेद करने के लिए, यह आवश्यक है डाई-लेबल लक्ष्य आबादी । अंत में, प्रोटोकॉल कई धोने और गर्मी कदम है जो भारी और महंगा हो सकता है जब यौगिकों की बड़ी संख्या के परीक्षण की आवश्यकता है ।

चुप-iCre परख इन मुद्दों के लिए एक समाधान के रूप में विकसित किया गया था, सेल में फ्यूजन के अवरोधकों के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग को विकसित करने के लिए सेल संचरण । इस प्रणाली सब्सट्रेट कोशिकाओं में लोड करने के लिए की आवश्यकता नहीं है. परख भी सेल मुक्त अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अंय वायरल संलयन छद्म टाइप एचआईवी-1 ढकोसला-iCre वायरस कणों का उपयोग कर अध्ययन के लिए अनुकूल है । एचआईवी Env मध्यस्थता सेल-सेल फ्यूजन परख वायरस Env प्रोटीन के उपाय कर सकते सेल संलयन मध्यस्थता, लेकिन इन एचआईवी के रूप में वास्तविक वायरस कणों का उपयोग नहीं करते-1 चुप-iCre परख3,4,5करता है । इस परख प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ पढ़ा जा सकता है । यह सफलतापूर्वक एफडीए पुस्तकालय के रूप में के रूप में अच्छी तरह से purinergic1,6के एक छोटे पुस्तकालय स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । अंय जांचकर्ताओं को भी एचआईवी में purinergic अवरोधकों की पहचान-1 फ्यूजन एक अनुकूलित और अनुकूलित उच्च प्रवाह संलयन परख कि वायरस के हस्तांतरण-encapsulated बीटा-lactamase कोशिका द्रव्य7,8 में रिपोर्ट का उपयोग कर .

चुप-iCre वायरस चुप-iGFP वायरस के लिए एक समान दृष्टिकोण के साथ बनाया गया था, मैट्रिक्स और कैप्सिड के बीच Cre recombinase डालने, एचआईवी द्वारा पार्श्व-1 चिढ़ा साइटें9। Cre एंजाइम एक ढोंग polyprotein के भीतर डाला है कि परिपक्व जब एचआईवी 1 चिढ़ा नवजात वायरस कण के भीतर सक्रिय है अग्रदूत के रूप में किया जाता है । Cre वितरण, इस प्रकार, एक एक वायरल झिल्ली संलयन प्रक्रिया के माध्यम से एक लक्ष्य सेल में एक तंग-एचआईवी सक्रिय-1 कण की सामग्री के वितरण पर निर्भर है । प्रोटोकॉल के दो संस्करणों यहां प्रदान की जाती हैं । पहले एक एचआईवी-1 संक्रमित आबादी को संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग करता है, के लिए प्रत्यक्ष सेल अध्ययन करने के लिए-एचआईवी के सेल संचरण । दूसरे संस्करण एक सेल मुक्त वायरस का उपयोग करता है एक सेल मुक्त वायरल संक्रमण का अध्ययन । कोशिका के लिए सेल संचरण परख दिन कोशिकाओं गल रहे हैं, या 5 दिन अगर कोशिकाओं को पहले से ही गल रहे है और मार्ग से पूरा करने के लिए 7 दिन लगते हैं । सेल मुक्त संक्रमण परख 5 दिनों में किया जा सकता है अगर कोशिकाओं को गल और 3 दिन अगर कोशिकाओं गल और पारित कर रहे है की जरूरत है । निर्देश भी एक आरजी (रेड-टू-ग्रीन) लक्ष्य सेल लाइन में वांछित सेल प्रकार (अगर एक मौजूदा आरजी लक्ष्य सेल लाइन का उपयोग नहीं किया जा रहा है) चालाकी10लैब द्वारा बनाई गई प्लाज्मिड का उपयोग कर उत्पंन करने के लिए दिए गए हैं । यह अनुशंसित है कि उचित सुरक्षा सावधानियों वायरस और इस परख में वायरस व्यक्त कोशिकाओं के साथ लिया जाता है । हम एक BSL2 + ऊतक संस्कृति की सुविधा में इस परख के संक्रामक भाग आचरण । कोशिकाओं को ठीक करने के बाद, वे मानक प्रवाह cytometry और सूक्ष्म सुविधाओं में विश्लेषण किया जा सकता है ।

यहाँ हम उपन्यास यौगिकों कि एचआईवी-1 वायरल झिल्ली फ्यूजन को बाधित करने के लिए स्क्रीन करने के लिए इस परख के आवेदन का वर्णन (चित्रा 1). Purinergic रिसेप्टर्स समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों हैं । हमारी प्रयोगशाला का प्रदर्शन किया है कि गैर purinergic रिसेप्टर्स के चुनिंदा अवरोधकों के रूप में एचआईवी के अवरोधकों-1 वायरल झिल्ली फ्यूजन6. हम रिपोर्ट है कि उच्च प्रवाह में इस परख के उपयोग के उपंयास एचआईवी-1 वायरल झिल्ली फ्यूजन अवरोधकों की पहचान कर सकते हैं । हम यह प्रदर्शित करता है कि रिसेप्टर्स के purinergic वर्ग के एक अवरोधक एचआईवी-1 वायरल झिल्ली फ्यूजन अवरोधकों के एक उपंयास वर्ग का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Protocol

1. लक्ष्य सेल लाइनों की पीढ़ी

नोट: यह चरण वैकल्पिक है; यदि मौजूदा आरजी लक्ष्य कक्ष पंक्ति का उपयोग कर रहा है, तो चरण 2 पर प्रारंभ करें ।

  1. Cotransfect 10% भ्रूण गोजातीय के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर में 293T कोशिकाओं11 [की एक ७०% धाराप्रवाह 10 सेमी प्लेट सीरम (FBS)] pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-पूरो-WPRE10 और pCL-10A112 (पैकेजिंग प्लाज्मिड) के साथ एक 1:1 अनुपात (20 µ g कुल) का उपयोग कर कैल्शियम आधारित अभिकर्मक13.
  2. फसल वायरल supernatant ४८ एच के 10 मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में थाली से मीडिया pipetting द्वारा अभिकर्मक और 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३,००० x जी में ट्यूब केंद्रापसारक किसी भी कोशिका मलबे गोली ।
  3. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक ०.४५ µm फिल्टर अनुलग्न करें । केंद्रापसारक के बाद, पूरे supernatant ले और सिरिंज लोड । एक साफ 15 एमएल ट्यूब में के माध्यम से नमूना भागो ।
  4. Aliquot उपयुक्त आकारों में फ़िल्टर वायरल supernatant (आमतौर पर, 0.5-1 मिलीलीटर aliquots) । ये अगले कदम में तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या पर जमे हुए किया जा सकता है-८० ° c और संग्रहीत ।
  5. ९६-अच्छी तरह से थाली में पसंद की एक सेल लाइन को संक्रमित करने के लिए वायरल supernatant के 50-100 µ एल का प्रयोग करें । संस्कृति 5% CO2के साथ ३७ ° c पर कोशिकाओं । आरएफपी संकेत के रूप में जल्द ही एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (40X आवर्धन, ५३२ एनएम उत्तेजना, ५८८ एनएम उत्सर्जन) के तहत 24 घंटे के रूप में प्रकट होना चाहिए, लेकिन ७२ एच तक ले सकते हैं ।
    नोट: इन प्रयोगों में, Jurkat कोशिकाओं का उपयोग किया गया है, लेकिन अन्य प्रकार के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता.
  6. 10 कुओं की एक श्रृंखला की स्थापना और प्रत्येक के लिए puromycin जोड़ने के द्वारा puromycin के साथ transduced कोशिकाओं का चयन करें, एक नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से अनुपचारित (०.५ µ जी से सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करें/एमएल से 5 µ जी/यह प्रति कक्ष प्रकार भिंन हो सकते हैं) । कोशिका व्यवहार्यता पर नजर रखने (कोशिका lysis puromycin प्रतिरोध के बिना कोशिकाओं में हो जाएगा) कई दिनों के दौरान अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में और puromycin की एकाग्रता का उपयोग करें जहां केवल आरएफपी-व्यक्त कोशिकाओं जीवित रहते हैं ।
    नोट: transfected कोशिकाओं के जीवित रहते समय untransfected कोशिकाओं को मार डाला है, जहां एकाग्रता का चयन करें.
  7. या तो एकल-सेल प्रवाह cytometry छंटाई या एक सीमित कमजोर पड़ने का प्रयोग (कदम 1.8 – 1.10 देखें), बढ़ती संस्कृतियों एकल कोशिकाओं1 से व्युत्पंन एक क्लोनिंग सेल लाइन विकसित करने के लिए (यह कई हफ्तों के लिए ले जाना हो सकता है) ।
  8. यदि कमजोर पड़ने विधि का उपयोग कर, एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती और लगभग ५०० कोशिकाओं को नमूना पतला/
  9. एक ९६-अच्छी तरह से थाली में, पिपेट ५० µ एल सेल के ५० µ एल मीडिया में कमजोर पड़ने [रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 10% FBS और 2% पेनिसिलिन-streptomycin के साथ मध्यम, अगर Jurkat कोशिकाओं का उपयोग] और 11 कुओं में 1:1 सीरियल कमजोरियां प्रदर्शन ५० µ मीडिया के एल युक्त । सबसे अच्छा परिणाम के लिए, कम से 10 प्रतिकृति करते हैं ।
  10. एक ऊतक संस्कृति मशीन (३७ ° c 5% CO2के साथ) या लगभग 4 सप्ताह में थाली की माइक्रोस्कोपी (40X) के माध्यम से सेल विकास की निगरानी । विकास के साथ सबसे कम puromycin एकाग्रता से संस्कृतियों का चयन (के रूप में माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा, 40X) क्लोनल संस्कृतियों के लिए ।
  11. संस्कृति के 20 मिलीलीटर (५००,००० कोशिकाओं/एमएल, एक hemocytometer के साथ गिना) ८०० एक्स जी में 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए और यह ५०० µ एल में FBS के 10% DMSO के साथ resuspend द्वारा aliquots फ्रीज । यह प्लेस-८० ° c एक सेल-ठंड कंटेनर का उपयोग कर और फिर यह तरल नाइट्रोजन में स्टोर ।

2. सेल से सेल वायरस संचरण

  1. लक्ष्य कक्षों की तैयारी
    1. गल १ ५०० µ l शीशी Jurkat आरजी रिपोर्टर कोशिकाओं के एक ३७ ° c पानी स्नान में रखकर । पिपेट की शीशी से कोशिकाओं को RPMI पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर में और फिर 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक । एक टी-७५ कुप्पी में RPMI पूरा मध्यम के 20 मिलीलीटर में गोली resuspend । रात भर कुप्पी (३७ ° c और 5% CO2) की मशीन ।
      नोट: RPMI पूर्ण माध्यम RPMI १६४०, 10% FBS, 2 मिमी एल-glutamine, १०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin शामिल हैं ।
    2. अगले दिन, जोड़ें ०.५ µ जी/puromycin के एमएल (1 µ एल के एक 2 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक के प्रति 8 मिलीलीटर मीडिया) । संस्कृति कोशिकाओं, 200000 का घनत्व बनाए रखने-800000 कोशिकाओं/एमएल (hemocytometer के माध्यम से गिना) ।
    3. स्थानांतरण परख स्थापित करने से पहले दिन, 200000 के लिए नीचे कोशिकाओं को विभाजित-ताजा RPMI माध्यम में 400000 कोशिकाओं/एमएल युक्त ०.५ µ जी/puromycin के एमएल ।
  2. दाता कोशिकाओं की तैयारी
    1. गल untransduced Jurkat कोशिकाओं और संस्कृति उन्हें एक टी-७५ कुप्पी में RPMI पूर्ण माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ (जैसा कि चरण २.१ में वर्णित है), 200000 का घनत्व रखते हुए – 800000 कोशिकाओं/
    2. ७,५००,००० कोशिकाओं के केंद्रापसारक (5 मिनट के लिए ८०० x g ) और उंहें १२० µ l में nucleofection समाधान वी के पूरक के साथ resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक electroporation cuvette करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और ४.५ µ जी के ढकोसला-iCre1 डीएनए जोड़ें । Transfect कोशिकाओं (एक electroporation आधारित दृष्टिकोण के माध्यम से, सामग्री की मेजदेखें) एक उपयुक्त प्रोग्राम (जैसे, एस-18) का उपयोग कर और फिर तुरंत उंहें RPMI मध्यम (10% FBS के साथ) के 3 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण ।
    3. कोशिकाओं उंहें ३७ ° c 5% CO2के साथ रात भर में गर्मी से उबरने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. अगली सुबह, 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक और उंहें RPMI पूरा माध्यम के 3 मिलीलीटर में resuspend, उंहें 2 ज ३७ डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए (5% सह2) की अनुमति के साथ आगे बढ़ने से पहले परख सेट अप ।
  3. सह संस्कृति
    1. एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती तो नीचे स्पिन ५०,००० कोशिकाओं (23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g ) प्रति अच्छी तरह से (दोनों दाता और लक्षित कोशिकाओं के) परख सकता है । resuspend 1 x 106 puromycin के बिना RPMI पूर्ण में सेल/
    2. एक थाली में, दाता सेल निलंबन के 25 µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से; एक और थाली में, लक्ष्य कोशिकाओं के 25 µ एल जोड़ें ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से, उचित एकाग्रता पर RPMI पूर्ण माध्यम में पतला परीक्षण यौगिक के 25 µ एल जोड़ें । 30 मिनट के लिए यौगिक के साथ दाता और लक्ष्य कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: एकाग्रता दवा के प्रति भिन्न हो जाएगा. यदि यह एक ज्ञात आईसी५०है, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस का उपयोग करें, ऊपर और नीचे titrating । यदि आईसी५० अज्ञात है, 10 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक २०० µ मीटर शेयर तैयार करते हैं ।
    4. उपचार के बाद, अंय में एक थाली की सामग्री pipetting द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं के साथ दाता कोशिकाओं गठबंधन और एक ऊतक संस्कृति मशीन में ४० ज के लिए कोशिकाओं को 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस में मशीन ।
  4. प्रवाह cytometry
    1. 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अच्छी तरह से paraformaldehyde (पीएफए) जोड़ें ।
      नोट: के लिए एक 16% शेयर समाधान, यह है 14 µ l प्रति १०० µ l अच्छी तरह से.
    2. सावधानी: पीएफए त्वचा और आंखों को उजागर करने के लिए हानिकारक है । एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने पहनते हैं, और सुरक्षा चश्मे, और एक सुरक्षा हुड में शेयर समाधान संभाल ।
    3. mCherry और FITC चैनलों के साथ एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं को पढ़ें ।
      नोट: यह देखने के लिए संभव है 5 – संक्रमित कोशिकाओं बनाममें पृष्ठभूमि के ऊपर GFP व्यक्त कोशिकाओं का 20% संक्रमित कक्ष ।
    4. GFP-विशिष्ट चैनलों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (40X) के माध्यम से GFP संकेत कल्पना (४०० एनएम और ५०८ एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर के एक उत्तेजना फिल्टर के साथ) ।

3. एक सेल मुक्त वायरस के संक्रमण के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल

  1. लक्ष्य कक्षों की तैयारी
    1. गल १ ५०० एक ३७ ° c पानी स्नान में रखकर Jurkat आरजी रिपोर्टर कोशिकाओं के µ एल शीशी । पिपेट की शीशी से कोशिकाओं को RPMI पूर्ण माध्यम के 10 मिलीलीटर में और फिर 23 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ८०० x g पर RPMI पूरा माध्यम केंद्रापसारक । एक टी-७५ कुप्पी में RPMI पूरा मध्यम के 20 मिलीलीटर में गोली resuspend । रात भर कुप्पी (३७ ° c और 5% CO2) की मशीन ।
    2. अगले दिन, जोड़ें ०.५ µ जी/puromycin के एमएल (1 µ एल के एक 2 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक के प्रति 8 मिलीलीटर मीडिया) । संस्कृति कोशिकाओं, 200000 का घनत्व बनाए रखने-800000 कोशिकाओं/एमएल (hemocytometer के माध्यम से गिना) ।
    3. स्थानांतरण परख स्थापित करने से पहले दिन, 200000 के लिए नीचे कोशिकाओं को विभाजित-ताजा RPMI माध्यम में 400000 कोशिकाओं/एमएल युक्त ०.५ µ जी/puromycin के एमएल ।
  2. एक सेल मुक्त वायरस का उत्पादन
    1. Transfect एक ७०% 293T कोशिकाओं की धाराप्रवाह 10 सेमी प्लेट11 (10% FBS के साथ DMEM के 10 मिलीलीटर में) 5 µ जी के साथ झूठ-iCre1 प्लाज्मिड का उपयोग कर कैल्शियम आधारित अभिकर्मक13.
      नोट: इस पैमाने पर वायरस के 10 मिलीलीटर है, जो लगभग दो से ४ ९६ के लिए पर्याप्त है उत्पादन होगा-अच्छी तरह से प्लेटें, अभिकर्मक की क्षमता पर निर्भर करता है ।
    2. फसल एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में प्लेट से मीडिया pipetting द्वारा ४८ ज पर पूरे वायरल supernatant और 5 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी में ट्यूब केंद्रापसारक सभी कोशिका मलबे गोली ।
    3. एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक ०.४५ µm फिल्टर अनुलग्न करें । केंद्रापसारक के बाद, पूरे supernatant ले और सिरिंज लोड । एक साफ 15 एमएल ट्यूब में के माध्यम से नमूना भागो ।
    4. वायरस का उपयोग करने के लिए लक्षित कोशिकाओं को संक्रमित तुरंत (चरण ३.३) या फ्रीज और वायरस की दुकान-८० डिग्री सेल्सियस (गल नमूना उपयोग करने से पहले की जरूरत के रूप में) ।
  3. संक्रमण
    1. आरजी Jurkat लक्ष्य कोशिकाओं की गणना (3.1.3 कदम से) एक hemocytometer का उपयोग कर और नीचे स्पिन ५०,००० लक्ष्य कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से ८०० में एक्स जी 5 मिनट के लिए, कोशिकाओं resuspend 1 x 106 कोशिकाओं में/एमएल RPMI पूर्ण माध्यम में puromycin के बिना ।
    2. एक थाली में, एक अच्छी तरह से आरजी Jurkat लक्ष्य कोशिकाओं के 25 µ एल जोड़ें; एक अलग प्लेट में, एक अच्छी तरह से 25 µ एल (2 एनजी) वायरस जोड़ें ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से, उचित एकाग्रता पर मीडिया में पतला, परीक्षण यौगिक के 25 µ एल जोड़ें । कोशिकाओं और 30 मिनट के लिए यौगिक के साथ वायरस मशीन ।
      नोट: परीक्षण एकाग्रता दवा के प्रति भिन्न हो जाएगा. यदि यह एक ज्ञात आईसी५०है, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस का उपयोग करें, ऊपर और नीचे titrating । यदि अज्ञात, 10 µ एम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक २०० µ एम शेयर माध्यम तैयार करते हैं ।
    4. उपचार के बाद, पूरी सामग्री (५० µ एल) के कुओं से वायरस/यौगिक मिश्रण लक्ष्य कोशिकाओं को जोड़ने और एक ऊतक संस्कृति मशीन में ४० एच के लिए सब कुछ के साथ ३७ ° c 5% CO2.
  4. प्रवाह cytometry
    1. 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक अच्छी तरह से पीएफए जोड़ें ।
      नोट: के लिए एक 16% शेयर समाधान, यह है 14 µ l प्रति १०० µ l अच्छी तरह से.
    2. mCherry और FITC चैनलों के साथ एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं को पढ़ें । GFP संकेत भी GFP चैनलों पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से visualized किया जा सकता है ।
      नोट: एक बार देखने की उंमीद कर सकते है 5-संक्रमित कोशिकाओं बनाममें पृष्ठभूमि के ऊपर GFP व्यक्त कोशिकाओं के 20% संक्रमित कोशिकाओं ।

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Representative Results

अनसंक्रमित आरजी Jurkat सेल एक बहुत मजबूत आरएफपी सिग्नल (चित्रा 2a, अनसंक्रमित कॉलम) के साथ बैकग्राउंड GFP सिग्नल (०.३%)) के निम्न स्तर का प्रदर्शन करते हैं । झूठ के साथ संक्रमण-iCre GFP संकेत में वृद्धि का कारण बनता है (२४.९%,) जबकि एचआईवी की उपस्थिति-1 फ्यूजन अवरोध करनेवाला AMD3100 (20 µ m) इस संकेत के विकास को रोकता है, यह नीचे लाने के लिए संक्रमित पृष्ठभूमि के स्तर (०.३४%). जब एक के बाद एक अवरोधक-संलयन घटना रिवर्स प्रतिलेखन अवरोध करनेवाला AZT (2 µ एम) के रूप में प्रयोग किया जाता है, संकेत काफी प्रभावित नहीं है (२३.५%), संकेत है कि GFP परख द्वारा उत्पादित संकेत एचआईवी के लिए विशिष्ट है-1 संलयन । चित्रा बी -PPADS (१०० µ एम), एक गैर चयनात्मक purinergic अवरोध करनेवाला के साथ ढकोसला-iCre संलयन के एक खुराक पर निर्भर निषेध इंगित करता है ।

चित्रा 3 सेल मुक्त एचआईवी-1 वायरल झिल्ली फ्यूजन का उपयोग कर-iCre परख (आंकड़ा3 ए) और कंवेंशन दोष-Vpr परख (बी 4 चित्र) की तुलना इंगित करता है । झूठ का एक अनुमापन-iCre और दोष-Vpr वायरस spinoculate-एक 2 एच लंबे १,२०० एक्स जी की स्पिन ९६-संक्रमण की शुरुआत में अच्छी तरह से संक्रमण की थाली के लिए इस्तेमाल किया गया था अपनी क्षमता को बढ़ाने के लिए-आरजी Jurkat कोशिकाओं के साथ झूठ iCre और Jurkat कोशिकाओं के साथ दोष-Vpr वायरस पहले वर्णित2. वायरस के एनजी 3 पर, दोनों परख ६४.७% (झूठ-iCre) और ४७.२% की एक मजबूत संकेत की पेशकश की कोशिकाओं की (दोष-Vpr) जुड़े थे । पर ०.३ वायरस के एनजी, संकेत थे १.१८% (झूठ-iCre) और 2% (दोष-Vpr) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि झूठ-iCre वायरस सांद्रता की एक सीमा पर अच्छी तरह से स्थापित आरोप-Vpr परख करने के लिए वायरल संलयन के लिए एक तुलनीय संकेत प्रदान कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: ढकोसला-iCre परख सिंहावलोकन । आरजी Jurkat कोशिकाओं सह रहे है दाता Jurkat कोशिकाओं एचआईवी झूठ के साथ transfected-iCre के साथ मशीन । वायरल झिल्ली संलयन पर, Cre लक्ष्य कोशिकाओं है, जो loxP साइटों पर dsRed जीन सट के लिए EGFP अभिव्यक्ति की अनुमति है, हरी fluorescing कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते है में जारी की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एक सेल से मुक्त और एक सेल-सेल ढकोसला-iCre संक्रमण से प्रतिनिधि परिणाम । (एक) सेल मुक्त ढकोसला-iCre फ्यूजन फ्यूजन अवरोध करनेवाला AMD3100 द्वारा बाधित है, लेकिन रिवर्स प्रतिलेखन अवरोधक AZT द्वारा नहीं. इन पैनलों संक्रमित आरजी Jurkat कोशिकाओं, अनुपचारित आरजी Jurkat कोशिकाओं संक्रमण के बाद ४८ ज दिखाने के लिए, और आरजी Jurkat सेल ४८ एच संक्रमण के बाद लेकिन AMD3100 या AZT के साथ इलाज किया, के रूप में संकेत दिया । ऊपरी पैनलों GFP चैनल पर फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ का प्रतिनिधित्व करते हैं, मध्य पैनलों आरएफपी चैनल पर फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि कम पैनलों प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) के नमूने के लिए डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं एक के सकारात्मक GFP दिखा फ्यूजन का प्रतिशत संकेत । स्केल बार = १०० µm । इस पैनल को एस्पोसिटो एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 1. (ख) एचआईवी-1 वायरल झिल्ली संलयन कोशिका के लिए सेल संक्रमण के बाद PPADS द्वारा बाधित है । आरजी Jurkat कोशिकाओं एचआईवी के साथ Jurkat कोशिकाओं transfected-1 चुप-iCre के साथ मिश्रित थे, और अवरोधकों AMD3100 और PPADS उनके लिए १०० µ एम पर वायरल झिल्ली संलयन ब्लॉक करने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया, के रूप में प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टर भूखंडों में दिखाया गया है । यह आंकड़ा Swartz एट अल से संशोधित किया गया है । 6. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एचआईवी चुप-iCre रिपोर्टर संकेत दोष के लिए तुलनीय है-Vpr । इन पैनलों के एक FACS विश्लेषण के परिणाम दिखाने के (क) आरजी कोशिकाओं spinoculated एक ढकोसला-iCre वायरस के साथ और (ख) Jurkat कोशिकाओं spinoculated दोष NL43 के साथ, एक 6 एच संक्रमण के बाद 16 एच वायरस के संकेत एकाग्रता पर. इस पैनल को एस्पोसिटो एट अल से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है । 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चुप-iCre परख के लिए बहुत उपयोगी साबित हो गया है स्क्रीनिंग दवा उंमीदवारों जो वायरल प्रतिकृति के फ्यूजन कदम को बाधित कर सकते हैं । जब इस परख प्रदर्शन, सबसे महत्वपूर्ण कदम एक अच्छा संकेत पाने के लिए सबसे वायरल संक्रमण परख के समान हैं । पहली महत्वपूर्ण कदम अच्छी गुणवत्ता वायरस के उच्च titers उत्पादन कर रहा है । इस चरण की आवश्यकता है कि 293T कोशिकाओं अक्सर पारित कर रहे हैं (कम से कम 1x हर ४८ ज) ताकि वे overconfluent और झुरमुट एक साथ नहीं बन जाते । इसके अतिरिक्त, यह अलग अभिकर्मक तरीकों के साथ प्रयोग के लायक हो सकता है, के रूप में कुछ शोधकर्ताओं का पता है कि कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक बेहतर परिणाम देता है, जबकि दूसरों के पक्ष लिपिड-आधारित रिएजेंटों । इसी प्रकार, इस प्रोटोकॉल में अंय महत्वपूर्ण कदम के लक्ष्य कोशिकाओं को तबदील नहीं होने देना है, लेकिन उंहें संक्रमण से पहले घातीय वृद्धि के चरण में रखने के लिए, के रूप में स्थिर चरण में उनकी क्षमता संक्रमित हो कम कर देता है ।

अच्छी तरह से स्थापित दोष-Vpr2परख, चुप-iCre परख की तुलना में कोई लक्ष्य कोशिकाओं लेबल की जरूरत के साथ एक सब्सट्रेट मुक्त परख प्रदान करता है । यह यह अच्छी तरह से कुछ उच्च प्रवाह अनुप्रयोगों1के लिए अनुकूल बनाता है । इसके अतिरिक्त, परख वायरल प्रवेश के लिए एक स्थाई मार्कर प्रदान करता है भले ही कोशिका अव्यक्त हो जाता है, कुछ अव्यक्त संक्रमण का अध्ययन करने की क्षमता की पेशकश की । विलंबता के लिए भविष्य के अध्ययन चूहों में इस प्रणाली का उपयोग कर सकते हैं, जहां आरजी कोशिकाओं जो झूठ-iCre जोखिम के कारण हरी को बंद कर दिया गया है, अभी तक उत्पादक संक्रमित नहीं कर रहे हैं, एक अव्यक्त वायरस या अनुत्पादक संक्रमण के साथ कोशिका आबादी का अध्ययन अलग किया जा सकता है । विलंबता के अलावा, परख अंय संभावित अनुप्रयोगों है । यह सफलतापूर्वक छद्म के लिए उपयोग किया गया है ऐसे Ebola और VSV (अप्रकाशित डेटा) के रूप में अंय वायरल लिफाफा प्रोटीन के साथ टाइपिंग, इस परख के लिए क्षमता खोलने के लिए एक जीवित के साथ काम करने से एक सुरक्षित तरीके से वायरस की एक किस्म के लिए फ्यूजन अवरोधकों की पहचान वायरस.

झूठ-iCre परख की एक संभावित सीमा यह है कि यह संकेत के लिए एक अतिरिक्त दिन लेने के लिए विकसित करता है, दोष-Vpr की तुलना में । इसके अलावा, अपने वर्तमान राज्य में झूठ iCre वायरस केवल एक चक्र है, जो शर्तों हम वर्णित है, लेकिन दीर्घकालिक अध्ययन या विकास घटता के लिए उपयुक्त नहीं होगा के तहत दवा स्क्रीनिंग के लिए काम करता है के लिए प्रतिकृति । भविष्य में, परख के नए संस्करणों के विभिंन रिपोर्टर संकेतों के साथ किया जाएगा ऐसे luciferase के रूप में, का उपयोग करता है की एक व्यापक विविधता के लिए अनुमति । इसके अलावा, बड़े यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की संभावना उपंयास अवरोधकों वायरल प्रतिकृति के फ्यूजन कदम के लिए विशिष्ट उपज जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को NIH/NIAID AI112423 और NIH/NIGMS GM113885 बेंजामिन K. चेन और NIH/NIAID K08-AI120806 को तिलिया H Swartz करने के लिए अनुदान का समर्थन किया गया था । हम माउंट सिनाई डीन फ्लो Cytometry कोर में Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Sigma Aldrich D5546 Media for 293 Cells
RPMI-1640 Sigma Aldrich R0883 Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin Gibco 16140-071 Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.03 Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution GE Healthcare Life sciences SV30010 Penn/Strep used in both media
T75 Flasks Corning 3073 Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates Corning 430167 Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated) Corning 3595 Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent Signagen SL100688 Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537-100ML Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease GE Healthcare Life sciences SH30042.01 For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus GE Healthcare Life sciences 17144002 For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes Fisher Brand 13-678-11E For all tissue culture
Pipettor Tips Denville Scientific P3020-CPS For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm) Millipore SLHA033 For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes BD Diagnostics 309656 For filtration of virus
Amaxa Nucleofector Lonza 2b for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood Various models Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE Addgene 32702 Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1 Novus Bio NBP2-29542 Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre Benjamin Chen Lab Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).

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References

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  6. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).
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  13. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium Phosphate Transfection. Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३८ एचआईवी-1 प्रवेश फ्यूजन स्क्रीनिंग Cre recombinase सेल-टू-सेल ट्रांसमिशन purinergic रिसेप्टर्स
एक उच्च प्रवाह Cre-लोक्स सक्रिय वायरल झिल्ली फ्यूजन परख एचआईवी के अवरोधकों की पहचान के लिए-1 वायरल झिल्ली संलयन
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Esposito, A. M., Soare, A. Y.,… More

Esposito, A. M., Soare, A. Y., Patel, F., Satija, N., Chen, B. K., Swartz, T. H. A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (138), e58074, doi:10.3791/58074 (2018).

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