Summary
우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 구체적으로 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 (GFP) 감지의 표현 하도록 설계 되었습니다. 에이즈-1 기자 바이러스 (에이즈-1 개 그-iCre)는 Cre recombinase 매트릭스와 개 그 polyprotein의 capsid 단백질 V-1 게놈으로 삽입 하 여 생성 됩니다. 다음 대상 셀에 발표 바이러스 입자로 Cre recombinase의 포장에서이 결과 라인 Cre recombinase 활성화 빨간 형광 성 단백질 (RFP) GFP 스위치 카세트를 안정적으로 표현. 기저 상태에서이 카세트만 RFP를 표현합니다. 목표 셀에 Cre recombinase의 배달, 다음 loxP 사이트에 의해 형벌 RFP, GFP 식 결과 excises. 이 분석 결과 어떤 억제제 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 셀 및 셀 감염 시스템에서 테스트를 사용할 수 있는 그리고 HIV-1 바이러스 막 융합의 비 발한 억제제로 purinergic 수용 체 길 항 근의 클래스를 식별 하는 데 사용 되었습니다.
Introduction
소설 항 레트로 바이러스 치료를 위한 필요 에이즈-1의 억제제에 대 한 높은 처리량 스크린의 개발을 자극 했다. 개 그-iCre 기자 분석 결과 특히 호스트 세포 막1바이러스 막 융합을 측정 하 여 셀 감염 시스템에서 융해 단계에서 바이러스 항목의 억제제를 식별 하기 위해 개발 된다. 분석 결과 개발 되었다 바이러스 막 융합의 지점까지 에이즈-1 감염의 초기 단계에서 구체적으로 행동 하는 비 발한 억제제에 대 한 화면으로. 한 도전-셀 감염 측정은 새로운 감염을 측정 하는 것은 입력된 셀에서 차별 어렵다 그래서 초기 inoculum 감염된 기증자 세포와 ininfected 대상 셀 포함. 이상적인 시스템 분리 유전자 마커를 대상 세포 감염의 개시에 의해 유도 될 수 있다 포함 하 고 기증자 세포에 존재 하지 않습니다. 인기 있는 바이러스 내용을 바이러스 성 단백질 효소 퓨전, 연기-Vpr에 따라 분석 결과 혼합 효과적일 수 있다, 그러나 높은 처리량, 셀 심사2에 대 한 제한이 있다. 이 분석 결과 베타-lactamase (연기) 리포터 유전자를 에이즈-1 Vpr을 융합, virions로 포장 이며, 바이러스 성 막 퓨전 시 대상 세포에 전달이 포함 됩니다. 기판 CCF2 오전 대상 세포의 세포질에 로드 하 고 분열 시 형광 변화를 겪 습. CCF2 오전 기판 비싼 이며, 높은 처리 화면에 대 한 금지 될 수 있습니다. 기증자 및 대상 셀을 구별 하기 위하여 그것은 염료 레이블에 필요한 대상 인구. 마지막으로, 프로토콜 화합물의 큰 숫자를 테스트 하는 경우 부담 하 고 비용이 많이 드는 될 수 있는 몇 가지 세척 및 인큐베이션 단계를 요구 한다.
개 그-iCre 분석 결과 높은 처리량 셀 전송에서 퓨전의 억제제에 대 한 검사를 개발 하는 것이 문제에 해결책으로 개발 되었다. 이 시스템은 기판 셀으로 로드할 수 필요 하지 않습니다. 분석 결과 셀 무료 연구에도 사용할 수 있습니다 그리고 의사 형식화 된 HIV-1 개 그-iCre 바이러스 입자를 사용 하 여 다른 바이러스 성 융합 연구에. 그러나 에이즈-1 개 그-iCre 분석 결과3,,45마찬가지로 이러한 실제 바이러스 입자를 사용 하지 않는 HIV 환경을 중재-셀 퓨전 분석 바이러스 환경을 단백질 중재 세포 융합, 측정할 수 있습니다. 이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경으로 읽을 수 있습니다. 그것은 FDA 라이브러리 뿐만 아니라 purinergic 억제제1,6의 작은 도서관을 화면으로 성공적으로 사용 되었습니다. 다른 수 사관 들도 보고 바이러스 캡슐화 beta lactamase 세포질7,8 로 전송 하는 적응 하 고 최적화 된 높은 처리량 퓨전 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 융합 저 해제 purinergic 식별 .
개 그-iCre 바이러스는 매트릭스와 에이즈-1 효소 사이트9에 의해 형벌 capsid Cre recombinase 삽입 개 그-iGFP 바이러스에 유사한 방식으로 설계 되었습니다. Cre 효소 성숙 hiv-1 프로 테아 제 초기 바이러스 입자 내에서 활성화 되 면 개 그 polyprotein 내에서 삽입 하는 전조로 이루어집니다. 따라서, Cre 납품은를 대상 셀 을 통해 바이러스 성 막 융해 과정에 효소 활성화 HIV-1 입자의 내용 전달에 의존 합니다. 프로토콜의 두 가지 버전은 여기에 제공 됩니다. 첫 번째는 에이즈-1 감염 인구를 사용 하 여 직접 셀 전송의 HIV 연구 대상 세포를 감염. 두 번째 버전 셀 무료 바이러스를 사용 하 여 셀 무료 바이러스 감염 연구. 셀 전송 분석 결과 셀은 이미 해 동 하 고 passaged 세포를 해 동 하는 날 로부터 7 일 또는 5 일 걸립니다. 경우에 세포를 해 동 하 여 passaged 셀 무료 감염 분석 결과 5 일 셀 해 동 될 필요가 있는 경우 및 3 일에서 수행할 수 있습니다. 지침은 또한 Clevers 랩10에 의해 만들어진 플라스 미드를 사용 하 여 원하는 셀 형식 (해당 되는 경우 기존의 RG 대상 셀 라인은 사용 하지 않는)에 RG (빨강-녹색) 대상 셀 라인을 생성 하 주어진 다. 적절 한 biosafety 주의 바이러스와 바이러스 표현 셀이 분석이 결과에 찍힌다는 것이 좋습니다. 우리는 BSL2 + 조직 문화 시설에서이 분석 결과의 감염 부분을 수행합니다. 셀 고정 후 표준 흐름 cytometry 및 현미경 시설에서 분석할 수 있습니다.
소설 화합물에 대 한이 분석 결과의 응용 프로그램 화면을 설명 하는 여기 HIV-1 바이러스 막 융합 (그림 1)을 억제. Purinergic 수용 체는 프로-염증 성 중재자. 우리 연구소는 비 선택적 억제제 purinergic 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 퓨전6의 행위로 설명 했다. 우리는 높은 처리량이 분석 결과의 활용 소설 HIV-1 바이러스 막 융합 억제제를 식별할 수 있는 것을 보고 합니다. Purinergic 클래스의 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 융합 억제제의 새로운 클래스를 나타냅니다 보여 줍니다.
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Protocol
1입니다. 대상 셀 라인의 세대
참고:이 단계는 선택 사항; 기존의 RG 대상 셀 라인을 사용 하 여, 2 단계에서 시작.
- 70% confluent 10 cm 접시 pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 와 pCL 10A112 (포장 플라스 미드) [10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10 mL]에 293T 세포11 의 cotransfect는 1:1 비율 (총 20 µ g)에 칼슘에 기초를 둔 transfection13사용 하 여.
- 15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 23 ° C에서 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 바이러스 표면에 뜨는 48 h 후 transfection의 10 mL를 수확.
- 10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.
- 적절 한 크기에 필터링 된 바이러스 상쾌한 약 수 (일반적으로 0.5-1 mL aliquots). 이러한 다음 단계에서 즉시 사용할 수 또는 수 있습니다-80 ° C에서 냉동 고 저장.
- 바이러스 성 상쾌한의 50-100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시에는 선택의 셀 라인을 감염. 5% CO2와 37 ° C에서 세포 문화. RFP 신호 대로 24 h (40 X 확대, 532 nm 여기, 588 nm 방출) 형광 현미경에 나타납니다 하지만 최대 72 시간 소요 될 수 있습니다.
참고:이 실험에서 Jurkat 세포 사용 되었다, 그러나 다른 유형 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. - 10 우물의 시리즈를 설정 하 여 puromycin와 적어도 1을 잘 떠나, 각각 추가 puromycin 선택 불리고 셀 컨트롤 (5 µ g/ml에서 0.5 µ g/mL 농도의 범위 사용;이 5 월 셀 형식에 따라 다릅니다)로 치료. 세포 생존 능력 (셀 세포 puromycin 저항 없이 셀에 발생 합니다) 몇 일 동안에 비해 치료 제어 및 puromycin RFP 표현 셀만 생존의 농도 사용 하 여 모니터.
참고: transfected 세포 생존 하는 동안 untransfected 셀을 살해 하는 농도 선택 합니다. - 단일 셀 흐름 cytometry 정렬 또는 제한 희석 사용 하 여 (참조 단계 1.8-1.10), 단일 셀1 클론 셀 라인 (성장에 몇 주 걸릴 수 있습니다)를 개발 하는 것에서 파생 된 문화를 성장.
- 희석 메서드를 사용 하는 경우는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 그리고 약 500 세포/ml 샘플을 희석.
- 96 잘 접시에서 [10 %FBS 2% 페니실린 스, Jurkat 세포를 사용 하는 경우와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체] 미디어의 50 µ L로 셀 희석의 50 µ L 플라스틱 하 고 11 웰 스를 포함 하는 미디어의 50 µ L로 1:1 직렬 희석을 수행 합니다. 최상의 결과 얻으려면 적어도 10 복제를 수행 합니다.
- 조직 문화 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C) 또는 약 4 주 판의 현미경 검사 법 (40 X)을 통해 세포 성장을 모니터링 합니다. 클론 문화에 대 한 (볼 통해 현미경, 40 X)로 성장 최저 puromycin 농도에서 문화를 선택 하십시오.
- 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 문화 (500, 000 셀/mL는 hemocytometer로 계산)의 20 mL centrifuging와 10 %DMSO FBS의 500 µ L에서 resuspending는 aliquots를 고정 합니다. 셀-냉동 컨테이너를 사용 하 여-80 ° C에서 그것을 배치 하 고 액체 질소에 저장 합니다.
2. 세포-세포 바이러스 전송
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대상 셀의 준비
- 37 ° C 물 욕조에 그것을 두어서 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 800 x g 23 ° c.에서 5 분 동안에 혼합물을 원심 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어.
참고: RPMI 완전 한 매체 RPMI 1640, 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 mg/mL 스 포함 되어 있습니다. - 다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.
- 전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.
- 37 ° C 물 욕조에 그것을 두어서 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 800 x g 23 ° c.에서 5 분 동안에 혼합물을 원심 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어.
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기증자 세포의 준비
- 해 동 untransduced Jurkat 세포와 RPMI의 20 mL와 T-75 플라스 크에 그들 완료 중간 (단계 2.1에서에서와 같이), 200000-800000 셀/mL의 조밀도 유지 하는 문화.
- 원심 7,500,000 셀 (800 x g 5 분) 및 그들의 보충과 nucleofection 솔루션 V 120 µ L에서 resuspend ( 재료의 표참조). Electroporation 베트 셀 전송 하 고 개 그 iCre1 DNA의 4.5 µ g을 추가 합니다. Transfect 세포 (electroporation 기반 접근을 통해 테이블의 자료를 참조 하십시오)를 적절 한 프로그램 (예:S-18)를 사용 하 여 및 다음 즉시 RPMI 매체의 3 mL에 그들을 전송 (10 %FBS).
- 셀 5% CO2와 37 ° C에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 복구할 수 있습니다.
- 다음날 아침, 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 세포를 원심 고 RPMI 완전 한 매체, 2 h 37 ° C (5% CO2)에서 시험 설치를 진행 하기 전에 복구할 수 있도록 3 mL에 그들을 resuspend.
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공동 문화
- (기증자 및 대상 셀)의 분석을 잘 당 50, 000 셀 (800 x g 23 ° C에서 5 분) 내려 hemocytometer 다음 스핀을 사용 하 여 셀을 계산. 1 x 106 셀/mL RPMI puromycin 없이 완전 한에 resuspending.
- 한 접시에 추가할 기증자 세포 현 탁 액의 25 µ L 각 잘; 또 다른 접시에 대상 셀의 25 µ L를 추가 합니다.
- 각 잘 복합 테스트의 25 µ L 희석 RPMI 적절 한 농도에서 완전 한 매체에 추가 합니다. 30 분 동안 화합물과 기증자 및 대상 셀을 품 어.
참고: 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. IC50 를 알 수 없는 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 준비. - 전처리, 후 다른 한 접시의 내용을 pipetting으로 대상 세포 기증자 세포를 결합 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 셀을 품 어.
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Cytometry
- 2%의 최종 농도에 각 음에 paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다.
참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘. - 주의: PFA 노출 된 피부와 눈에 유해한입니다. 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 고글을 착용 하 고 안전 후드에서 재고 솔루션을 처리.
- MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기.
참고: 그것은 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포. - GFP 특정 채널에 형광 현미경 검사 법 (40 X) 통해 GFP 신호를 시각화 (여기 필터 400 nm와 508의 방출 필터 nm).
- 2%의 최종 농도에 각 음에 paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다.
3. 대체 프로토콜 셀 무료 바이러스 감염에 대 한
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대상 셀의 준비
- 37 ° C 물 목욕으로 배치 하 여 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 원심 RPMI 완전 한 중간 800 x g 23 ° c.에 5 분에서 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어.
- 다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.
- 전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.
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셀-무료 바이러스의 생산
- Transfect 293T 세포11 의 70% confluent 10 cm 접시 (10 %DMEM 10 ml에서 FBS) 칼슘에 기초를 둔 transfection13를 사용 하 여 개 그 iCre1 플라스 미드의 5 µ g를.
참고:이 규모는 약 2 ~ 4 96 잘 접시, 여 transfection 효율에 따라 충분 하다 바이러스의 10 mL을 생산할 예정 이다. - 15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 48 h에 전체 바이러스 상쾌한 수확.
- 10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.
- 바이러스를 사용 하 여 대상 셀 즉시 (단계 3.3) 감염 또는 동결 하 고-80 ° C (사용 전에 필요에 따라 샘플 thaw)에 바이러스를 저장.
- Transfect 293T 세포11 의 70% confluent 10 cm 접시 (10 %DMEM 10 ml에서 FBS) 칼슘에 기초를 둔 transfection13를 사용 하 여 개 그 iCre1 플라스 미드의 5 µ g를.
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감염
- (에서 단계 3.1.3) RG Jurkat 대상 셀의 개수를 사용 하 여 hemocytometer를 스핀 800 x g 에 잘 당 50000 대상 셀 5 분, puromycin 없이 매체 완료 resuspending 1 x 106 셀/mL RPMI에 셀.
- 한 접시에 추가할 RG Jurkat 대상 셀의 25 µ L 각 잘; 별도 접시에 25 µ L 추가 (2 기) 각 우물에 바이러스.
- 각 잘 추가 25 µ L 복합, 테스트의 적절 한 농도에서 미디어에 희석 합니다. 셀과 30 분에 대 한 화합물과 바이러스를 품 어.
참고: 테스트 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. 알 수 없는, 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 매체 준비. - 전처리, 후 대상 셀에 우물에서 바이러스/화합물 혼합의 전체 콘텐츠 (50 µ L)를 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 모든 것을 품 어.
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Cytometry
- 2%의 최종 농도에 각 잘 PFA 추가.
참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘. - MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. GFP 신호는 GFP 채널에 형광 현미경 시각 을 통해 수 있습니다.
참고: 한 번 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 기대할 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.
- 2%의 최종 농도에 각 잘 PFA 추가.
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Representative Results
감염 되지 않은 RG Jurkat 세포 (그림 2A, 감염 되지 않은 열) 매우 강한 RFP 신호 배경 GFP 신호 (0.3%)의 낮은 수준 전시. 개 그-iCre 감염 에이즈-1 융합 억제제 AMD3100의 존재 동안 GFP 신호 (24.9%) 증가 하면 (20 µ M)이이 신호를 감염 되지 않은 배경 수준 (0.34%)으로 데 려의 개발을 억제. 때 반전 녹음 방송 억제 물 어 같은 후 퓨전 이벤트의 억제제 (2 µ M) 사용, 신호에 영향을 받지 않습니다 크게 (23.5%), GFP 신호 분석 결과 제작한 것은 에이즈-1 융합 관련. 그림 2B 나타냅니다 PPADS와 함께 개 그 iCre 퓨전의 복용량 의존 억제 (100 µ M), 비-선택적 purinergic 억제제.
그림 3 나타냅니다 셀 무료의 비교 개 그 iCre 분석 결과 (그림 3A)와 (그림 3B) 대회 연기-Vpr 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 바이러스 막 융해. 개 그-iCre 및 연기-Vpr 바이러스의 적정 spinoculate 하는 데 사용 되었다-그것의 효율성을 증가 하는 감염의 시작에 96-잘 감염 격판덮개의 2 시간 긴 1200 x g 스핀-개 그 iCre과 Jurkat 세포로 연기-Vpr 바이러스와 RG Jurkat 세포 이전 설명된2. 3 바이러스의 ng, 두 분석 제공 64.7% (개 그-iCre) 및 셀의 47.2% (연기-Vpr)의 강력한 신호를 융합 했다. 0.3에서 ng 신호 하는 바이러스의 1.18% (개 그-iCre) 및 2% (연기-Vpr) 했다. 이러한 데이터 개 그 iCre 바이러스 퓨전 바이러스 농도의 범위에서 잘 설립 연기-Vpr 분석 결과에 대 한 유사한 신호를 제공할 수 있는 것이 좋습니다.
그림 1: 개 그 iCre 분석 결과 개요. RG Jurkat 세포 기증자 Jurkat 세포 에이즈 개 그-iCre와 페 공동 알을 품는. 바이러스 막 퓨전 시는 Cre fluorescing 그린 셀에 결과 수 EGFP 식 수 있도록 loxP 사이트에서 dsRed 유전자 다니엘, 대상 세포로 출시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 무료 셀 및 셀 개 그 iCre 감염에서 결과. (A) 셀 무료 개 그 iCre 퓨전 반전 녹음 방송 억제 물 시대가 아니라 융해 억제 물 AMD3100에 의해 저해입니다. 이러한 패널 감염 후 감염 되지 않은 RG Jurkat 세포 치료 RG Jurkat 세포, 감염 후 48 h, RG Jurkat 세포 48 h를 표시 하지만 표시 된 대로 AMD3100 또는 어, 치료. 상위 패널 대표 GFP 채널에 형광 현미경, 낮은 패널 대표 형광 활성화 된 세포 (FACS)의 긍정적인 GFP를 보여주는 샘플에 대 한 데이터를 정렬 하는 동안 중간 패널 RFP 채널에 형광 현미경을 나타냅니다는 융합을 나타내는 백분율입니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 패널 스 포 외 허가 수정 되었습니다. 1. (B) 에이즈-1 바이러스 막 퓨전 셀 감염 다음 PPADS에 의해 저해. RG Jurkat 세포 iCre-에이즈-1 개 그와 함께 페 Jurkat 세포와 혼합 했다 그리고 대표적인 형광 활성화 된 세포 분류 음모와 같이 AMD3100와 PPADS 억제제 100 µ M에서 블록 바이러스 막 융합 하는 능력에 대 한 테스트 되었습니다. 이 그림 Swartz 외 에서 수정 되었습니다. 6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: HIV 개 그-iCre 기자 신호 연기-Vpr은. 이 패널의 개 그-iCre 바이러스 (A) RG 셀 spinoculated 및 (B) Jurkat 세포 spinoculated NL43 연기-Vpr와 바이러스의 표시 농도에서 6 h 감염 후 16 h FACS 분석의 결과 보여줍니다. 이 패널 스 포 외 허가 수정 되었습니다. 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
개 그-iCre 분석 결과 바이러스 성 복제의 융해 단계를 억제 수 있습니다 약물 후보 심사에 대 한 매우 도움이 될 입증 되었습니다. 이 분석 결과 수행할 때 좋은 신호를 얻을 가장 중요 한 단계는 대부분의 바이러스 감염 분석 유사. 첫 번째 중요 한 단계는 좋은-품질 바이러스의 높은 titers 생산 하 고 있다. 이 단계에서는 293T 세포 passaged 자주 (적어도 모든 48 h x 1) 그래서 그들은 될 overconfluent와 함께 덩어리 하지 않는. 일부 연구 자들은 그 인산 칼슘 transfection 다른 지질 기반 시 약을 선호 하는 동안 더 나은 결과 제공 찾을 또한, 그것은 다른 transfection 방법으로 실험 하는 가치가 있을 수 있습니다. 마찬가지로,이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 대상 셀 자라 다을 못하게 하지만 감염, 직전 지 수 성장 단계에 그들을 유지 고정 단계 감염 될 그들의 능력을 감소.
잘 설립 연기-Vpr 분석 결과2에 비해 개 그 iCre 분석 결과 라벨 대상 셀 필요 없이 기판 무료 분석 결과 제공 합니다. 이것은 특정 높은 처리량 응용 프로그램1에 대 한 적합 합니다. 셀 되 잠재성, 잠재성 감염 연구를 몇 가지 가능성을 제공 하는 경우에 또한, 분석 결과 바이러스 항목에 대 한 영구 마커를 제공 합니다. 대기 시간에 대 한 미래의 연구는 RG 셀 그린 개 그 iCre 노출 때문에 전환 된 아직 생산은 감염 될 수 있습니다. 있는 잠재성 바이러스 또는 nonproductive 감염 세포 인구를 공부 하는 고립 된 쥐에이 시스템을 이용할 수 있습니다. 대기 시간, 뿐만 아니라 분석 결과 다른 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다. 그것은 성공적으로 이용 되어 에볼라 바이러스의 다양 한 융합 억제제는 라이브와 함께 보다 더 안전한 방식으로 식별 하는이 분석 결과 대 한 가능성을 열어 VSV (되지 않은 데이터) 등 다른 바이러스 성 봉투 단백질 의사 입력에 대 한 바이러스입니다.
개 그-iCre 분석 결과의 한 가지 잠재적인 한계 걸릴 것입니다 그것은 개발, 신호에 대 한 추가 하루 연기-Vpr에 비해. 또한, 현재 상태에서 개 그 iCre 바이러스만 작동 하는 우리는 설명 하지만 장기 연구 또는 성장 곡선에 적합 하지 않을 것 이다 조건에서 약물 검사에 대 한 단일 사이클에 대 한 복제 합니다. 미래에 분석 결과의 새 버전은 luciferase, 다양 한 사용에 대 한 허용과 같은 다른 기자 신호와 만들어질 것 이다. 또한, 더 큰 화합물 라이브러리의 심사 가능성이 항복 소설 억제제 바이러스 성 복제의 융해 단계를 특정 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH/NIAID AI112423와 벤자민 K. 첸을 NIH/NIGMS GM113885와 탈리 아 헤 Swartz에 NIH/NIAID K08-AI120806 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 아이 칸 학교 의학의 마운트 시 나이 학장의 흐름 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 μm) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
References
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