Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.
Abstract
Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación al ayudante de T 1 (Th1) las células es una manera útil de evaluar el papel desempeñado por las células T en una respuesta inmune. Este protocolo describe la diferenciación en vitro de progenitores de médula ósea (MO) para la obtención de granulocitos macrófago colonia-que estimulan el factor (GM-CSF) deriva-células dendríticas (DCs). El protocolo describe también la transferencia adoptiva de péptidos de ovoalbúmina (OVAp)-cargado DCs de GM-CSF-derivados e ingenuo CD4 T cells de ratones transgénicos OTII para analizar la en vivo la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de la transferidos de las células T CD4. Este protocolo evita la limitación de puramente en vivo los métodos impuestos por la imposibilidad de manipular o seleccionar la población celular estudiado específicamente. Además, este protocolo permite estudios en un ambiente en vivo , evitando alteraciones a factores funcionales que pueden ocurrir en vitro e incluyendo la influencia de los tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos. El protocolo es una herramienta útil para generar cambios en DCs y células de T que modificar las respuestas de adaptación inmune, potencialmente proporcionando importantes resultados para entender el origen o el desarrollo de numerosas enfermedades asociadas inmunes.
Introduction
Las células T CD4 y el antígeno que presenta las células (APCs) como DCs son necesarios mediadores de inmunidad a patógenos microbianos1,2. En los órganos linfoides periféricos, se activan las células T CD4 a partir del reconocimiento de antígenos específicos presentados por APCs3,4,5. Las células T CD4 activadas proliferan y se diferencian en células de Th de distintos efectores específicos que son necesarias para el desarrollo de una correcta respuesta inmune adaptativa6,7. Control de estos procesos es fundamental para producir una defensa adaptativa adecuada que mata el patógeno sin producir tejido dañino daño8. Las células TH se definición según la expresión o producción de moléculas de superficie, factores de transcripción y citoquinas efectoras y funciones esenciales y precisos en respuesta a patógenos1. Células del subconjunto de células Th1 expresan el factor de transcripción T-bet y la citocina interferón γ (IFNγ) y participan en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares1. Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación de Th1 es un medio útil de evaluar el papel T que desempeñan las células en una respuesta inmune.
Este protocolo permite in vivo análisis de la capacidad de in vitro -generan derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de las células CD4 naïve. El protocolo sirve también para evaluar la capacidad de las células de T CD4 ingenuo para ser activado, induce a proliferar, y Th1 diferenciadas (figura 1). Este protocolo versátil sortea la incapacidad para manipular o seleccionar la población de células estudiadas en puramente en vivo protocolos específicamente. Los efectos de diversas moléculas y tratamientos por el DCs pueden ser estudiados mediante BM de ratones modificados genéticamente5 o tratar o manipular genéticamente aislado de células BM9. Del mismo modo, las respuestas de células T pueden ser exploradas mediante la obtención de las células T para la transferencia adoptiva de diferentes fuentes o después de varias manipulaciones3,8,10.
Las principales ventajas de este protocolo son dos. Activación de la célula de t, la proliferación y diferenciación de Th1 se analizan con un enfoque de citometría de flujo; y esto se combina con en vivo estudios, evitando así alteraciones que pueden ocurrir en vitro y como tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos11.
El uso de colorantes vitales es una técnica ampliamente utilizada para rastrear la proliferación celular, evitando el uso de la radiactividad. La medición de la proliferación con estos reactivos se basa en la dilución del colorante después de la división celular. Además, estos tintes pueden detectarse en varias longitudes de onda y son fácilmente analizados por citometría de flujo en combinación con múltiples anticuerpos fluorescentes o marcadores. Destacamos la utilidad de este protocolo, mostrando cómo la activación de células T, la proliferación y diferenciación de Th1 pueden ser analizadas por citometría de flujo.
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Protocol
Procedimientos experimentales fueron aprobados por la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) y la Comunidad Autónoma de Madrid con arreglo a las directrices españolas y europeas. Ratones fueron criados en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF) y fueron sacrificados por la inhalación de dióxido de carbono (CO2).
1. aislamiento de células de médula ósea de ratón de Tibias y fémures
Nota: La cepa de ratón C57BL/6 congenic lleva el diferencial leucocitario marcador Ptprcun, reconocido generalmente como CD45.1 o Ly5.1, mientras que cepas de tipo salvaje C57BL llevan el alelo de Ptprcb , conocido como CD45.2 o Ly5.2. Variantes CD45.1 y CD45.2 pueden distinguirse mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos. Ratones CD45.1, CD45.2 y CD45.1/CD45.2 pueden utilizarse como fuentes de células o como recipientes para transferencia adoptiva, permitiendo el seguimiento de las poblaciones celulares distintas por citometría de flujo. Utilice preferentemente edad- y los ratones machos o hembras sexo-emparejado por debajo de 12 semanas de edad.
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Preparación de fémures y Tibias
- Eutanasia a ratones utilizando el protocolo aprobado por el Comité institucional de cuidado animal.
- Desinfectar los miembros posteriores rociando la superficie animal con etanol al 70%.
- Utilice bisturís, pinzas y tijeras estériles. Con un bisturí, hacer un corte en la piel y quitar la piel de la parte distal del ratón incluyendo la piel que cubre las extremidades posteriores. Pelar la piel que rodea el músculo de la pantorrilla inferior y retire la piel de las piernas completamente (figura 2A, 2B).
- Separar el músculo cuadriceps del fémur con un bisturí. Desarticular la articulación coxofemoral sin romper la cabeza del fémur. Quitar los músculos de la tibia con un bisturí (figura 2, 2D). Separar el fémur la tibia sin romper los extremos del hueso.
- Mantener los huesos en una placa Petri que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina en medio de helada 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
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Aislamiento de células
Nota: Todos los pasos posteriores deben realizarse bajo una campana de cultura y con material estéril para evitar la contaminación.- En una placa Petri estéril, cortar cuidadosamente los extremos distales y proximales de cada hueso con un bisturí.
- Lavar los huesos varias veces con un volumen total de 10 mL de cálido Medio RPMI completo (RPMI + 10% SFB, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina, 20 mM HEPES, 55 μm 2-Mercaptoetanol, piruvato de sodio 1 mM y 2 mM L-glutamina). Lavar los huesos de ambos extremos con una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 1 mL.
- Transferencia de la effluate a un tubo cónico de 50 mL equipado con un filtro de web de nylon μm 70. Sacar cuidadosamente conglomerados de desechos y células por agitación suave y pipeteo.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos fríos (0,15 M de NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0.1 mM EDTA, pH ajustado a 7.2 con 1 HCl de N, 0,4 μm estéril filtrada y almacenada a 4 ° C). Mantener en hielo durante 5 minutos con agitación manual.
- Añadir 10 mL del tampón frío (1 x de tampón fosfato salino (PBS), EDTA 2 mM + 2% de albúmina sérica bovina (BSA)) para inactivar y eliminar el tampón de lisis de glóbulos rojos.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Lavar las células con 25 mL de Medio RPMI completo y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender las células en 5 mL de Medio RPMI completo. Mezcle 50 μl de la suspensión de la célula 1:1 con azul tripán. Determinar el número de células en una cámara de conteo bajo el microscopio. Calcular el número de celda mediante la fórmula: células/mL = [(cuenta de células no teñidas/4) x 2 x 10.000]12.
Nota: Este método rendimientos de 40 x 106 60 x 106 células de la médula por 8 no infectada del ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad ósea. - Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
2. DC la diferenciación, maduración y carga de antígenos
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Celulares BM cosecha
- La cultura completa en 6 bien ultra baja fijación chapas en 106 células por mL de medio, por lo general en 5 mL por pocillo de la semilla. Los macrófagos diferenciados adjuntará a las placas de cultura. Después de 12 h, transferir el sobrenadante, que contiene principalmente monocitos, para limpiar las placas de 6 pozos, descartando las placas de 6 pozos viejos con los macrófagos adheridos.
- Para promover la diferenciación celular, las celdas no adherente de 5 x 105 células por mL en típicamente 5 mL por pocillo de Medio RPMI completo que contiene 20 ng/mL obtenidos comercialmente murino recombinante GM-CSF a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono (CO2) de la cultura y observar diariamente.
- Cada 3 días, desactivación de células suspensión y recoger las células adherentes con 5 mM de EDTA en PBS y desactivación. Combinar y resuspender en 5 x 105 células/mL de medio fresco que contiene 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- El día 8, recoger las células adherentes y separadas como arriba y resuspender en 5 x 105 células/mL en medio que contiene 20 ng/mL GM-CSF y el lipopolisacárido ng/mL 20 (LPS) por 24 h en un Tratado de cultivo de tejidos no estéril de Petri, para inducir alta MHC-II , Expresión de CD80 y CD86.
- Diferenciación de control DC mediante citometría de flujo como se indica en el paso 2.2.
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Análisis de la maduración y diferenciación de citometría de flujo.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces.
- Receptores de Fc de bloque por incubando el precipitado de células resuspendidos en ratón Fc bloqueador de los receptores (purificada anti anticuerpo de ratón IgG CD16/CD322b ) por 15 min a 4 ° C según las instrucciones del fabricante.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Para cada sondeo, resuspender las 250.000 células en 300 μL de tampón de citometría de flujo (1 x PBS + 2 mM EDTA + BSA 2%) a 4 ° C.
- Transferencia 30 μl de la solución de células por pocillo de una placa de 96 pozos.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y añadir 30 μl de anticuerpo que contiene tampón de cada bien siguiendo las indicaciones del fabricante. Incubar las células con anticuerpos por 20 min a 4 ° C.
Nota: Generalmente empleado marcadores para DCs, monocitos y macrófagos son CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 y CD86 (figura 3). - Centrifugar las muestras a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender en 200 μL por pocillo del tampón de citometría de flujo en frío que contiene un marcador para excluir las células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o una amina reactiva del tinte ) del fabricante de la concentración recomendada13.
- Diferenciación de la célula del monitor por transferir las muestras a tubos de citómetro de flujo y realizar el análisis de citometría de flujo excepto las células muertas en los días 0, 3, 6 y 9.
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Carga DC antígeno.
- El día 8, centrifugar las muestras a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el pellet en 200 μL de medio (RPMI + 10% SBF sin antibióticos). Repita este paso dos veces.
- Incubar el DCs con 10 μg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) por 1 x 107 DCs en 1 mL de medio (RMPI + 1% FBS) en un tubo de plástico por al menos 30 min a 37 ° C. Uso no carga OVAp DCs como una condición de control negativo.
- Centrifugar las muestras a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el pellet en 200 μL de Medio RPMI completo. Repita este paso dos veces.
- Centrifugar las muestras a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender el pellet en 200 μL de medio (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 células/ml.
3. aislamiento de ingenuo CD4 células T de ratones OTII
Nota: Este método produce aproximadamente 100 x 106 spleenocytes por 8 no infectada a ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad. Pueden utilizarse tanto en hombres como en mujeres. Las células T CD4 pueden ser aisladas de bazo o ganglios linfáticos; Las células T CD4 son responsables de aproximadamente el 25% y 50% de las células en estos órganos, respectivamente. Realice los pasos siguientes en condiciones estériles.
- Aislar los nodos de linfa inguinales, axilares, braquiales, cervicales y mesentéricos y el bazo de ratones transgénicos OTII (figura 4) y transferirlas a una placa de Petri que contiene 10 mL de Medio RPMI completo de plástico.
- Enjuague el colador de células con 2 mL de Medio RPMI completo y quitar del tubo 50 mL. Los ganglios y el bazo a un filtro de 70 μm células se colocan en un tubo de 50 mL. Homogeneizar con un émbolo de la jeringa (figura 5) y añadir medio hasta 15 mL.
- Centrifugar las muestras a 250 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender la pastilla en 15 mL de Medio RPMI completo. Repita este paso dos veces.
- Para la suspensión de células de bazo, Resuspender el precipitado de células y lisar los glóbulos rojos, como se indica en el paso 1.2.5.
- Centrifugue la suspensión de células a 250 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Lavar las células con 25 mL de Medio RPMI completo y centrifugar a 250 x g durante 5 min a TA.
- Resuspender las células en 5 mL de medio. Mezclar 50 μl de la suspensión 1:1 con azul de tripano. Determinar el número de celular con una cámara de conteo bajo el microscopio. Calcular el número de celda mediante la fórmula: células/mL = [(cuenta de células no teñidas/4) x 2 x 10.000]12.
- Repetir el punto 2.2.2.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante, incubar las células con diluciones de 1: 800 de anticuerpos biotinilados CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 y DX5 por 30 min en hielo para más tarde la selección negativa de células T CD4.
- Siguiendo las instrucciones del fabricante y basados en el número de células y la capacidad de los granos, calcular la cantidad necesaria de microesferas magnéticas recubiertas de estreptavidina y aislar células CD4 T usando un separador magnético de la célula y la adecuada columnas de separación.
- Resuspender las células en 5 mL de Medio RPMI completo y mantenerlos en el hielo contando células vivas como se describe en el paso 3.7.
- Extraer 2 x 105 células y comprobar la pureza de las células colectadas usando anti CD3, CD4 y CD8, B220 anticuerpos fluorescentes en un citómetro de flujo utilizando las diluciones de anticuerpo recomendación de fabricante.
- Para teñir las células de T CD4/OTII ingenuo aislado, resuspender 106 células en 500 μl de tampón (1 x PBS + EDTA 2 mM + 2% BSA). Preparar 500 μl de buffer (1 x PBS + EDTA 2 mM + 2% BSA) que contiene doble la concentración recomendada por el fabricante final de tinte trazador de vital de la célula. Mezclar ambas soluciones agregando lentamente la solución de rastreador de celular a la suspensión de células. Incube las células durante 5 min a 37 ° C.
- Lavar las células con 5 mL de Medio RPMI completo y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces. Resuspender las células en 1 mL de Medio RPMI completo en 1 x 107células/mL.
4. in Vivo la activación, proliferación y diferenciación de Th1 ensayo
Nota: El celular vital tracer tinte carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster (CFSE) y otros tintes de succinimidyl basado en éster, que están y emiten fluorescencia a diferentes longitudes de onda, son ampliamente utilizados para evaluar la proliferación de linfocitos por el flujo de Citometría debido a su intensidad de fluorescencia alta, larga duración, variabilidad baja y toxicidad baja14.
- Eventualmente la transferencia por vía intravenosa (i.v.) 1 x 106 vivo de la célula vital tracer manchado de tinte ingenuo CD4/OTII T las células en 100 μl de PBS por ratón. Etiquetado células T pueden transferirse eventualmente por la vena de la cola o inyección retro-orbitales15; en ambos casos, las células se inicio a órganos linfoides (figura 6A).
- Desafiar a los ratones receptores un día más tarde transfiriendo eventualmente 100.000 LPS-madurado cargado OVAp DCs por inyección subcutánea (s.i.) en las patas (Figura 6B).
- Ganglios poplíteos de los ratones receptores de cosecha y proceso hasta la obtención de suspensiones de la célula siguiendo los mismos pasos como se ha descrito en 3.1 y 3.2. Hacer esto de inmunización posterior al día 2 para medir la activación de las células T CD4/OTII y el día 5 para medir la proliferación y diferenciación de Th1.
- Para analizar la activación de células T en el día 2, mancha las células con anticuerpos fluorescentes contra el CD4, CD69 y CD25 (opcionalmente CD45.1 y CD45.2) y determinar el porcentaje de C69+CD25 células+ T en la población de CD4. Análisis por citometría de flujo (figura 7).
- Para comprobar la proliferación de la célula de T el día 5, mancha las células utilizando anticuerpos fluorescentes apropiados contra CD4 y opcionalmente, CD45.1 y CD45.2. Analizar el decaimiento de la señal de tinte trazador de célula vital en la población de CD4 por citometría de flujo (figura 8). Varios parámetros pueden determinarse en estos estudios, como el número de divisiones celulares de las células con el tinte de trazador de célula vital, el porcentaje de células divisorias en cada pico de fluorescencia y el porcentaje de células divisorias en la celda total población.
- Para determinar la diferenciación Th1 en el día 5, 400.000 células placa por pozo de una placa de 96 pocillos en 200 μL de Medio RPMI completo que contiene 1 ionomycin μm y 10 ng/mL forbol 12 13 acetato de miristato (PMA) durante 6 h a 37 ° C en la incubadora. El pasado 4 h, añadir 3 – 10 μg/mL brefeldin A bloquear la secreción de citocinas al medio.
- Centrifugue las placas durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por inversión rápida de la placa de 96 pocillos.
- Repetir el punto 2.2.2.
- Mancha de las membranas celulares por incubar durante 15 min a 4 ° C en 30 μl de tampón (1 x PBS + EDTA 2 mM + 2% BSA) con anticuerpos contra CD4 y, opcionalmente a CD45.1 y CD45.2 en diluciones recomendadas por el fabricante. Lavar las células mediante la adición de 150 μL de tampón (1 x PBS + EDTA 2 mM + 2% BSA) y centrifugue las placas durante 5 minutos a 250 x g a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Fijar las células mediante la adición de 100 μl de sacarosa 2% paraformaldehyde/1% por 20 min en centrífuga de RT. las placas de 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Permeabilizar las células añadiendo 50 μl de buffer de permeabilización intracelular (1 x PBS + 0.1% de BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% saponina) e incubar durante 30 min a 4 ° C.
- Añadir 150 μL de PBS y centrifugar durante 5 min a 1.000 x g en RT. descartar el sobrenadante.
- Tinción intracelular citoquinas mediante la adición de 30 μl de fluoróforo conjugada anti anticuerpo IFNγ en tampón (PBS + 0.1% saponina) e incubar por 30 min a TA.
- Lavar las células mediante la adición de 150 μL de tampón (PBS + 0.1% saponina). Centrifugue las placas durante 5 minutos a 1.000 x g a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Repita este paso dos veces.
- Análisis de poblaciones celulares por citometría de flujo (figura 8).
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Representative Results
La figura 1 ilustra los pasos descritos en este protocolo. La figura 2 ilustra el aislamiento y cultivo de células de ratón BM. La adición de GM-CSF y LPS a estas culturas permite la generación en vitro y la maduración de DCs. figura 3 ilustra el análisis de citometría de flujo de la diferenciación y maduración de las DCs obtenidos cargado DCs. OVAp derivadas de GM-CSF BM y aisladas células vitales rastro manchado de tinte T CD4/OTII células eventualmente se transfieren a los ratones. La figura 4 muestra la ubicación de los ganglios linfáticos que se utiliza para el aislamiento de células T CD4/OTII. La figura 5 muestra un tubo de 50 mL equipado con el filtro de nylon de 70 μm y un émbolo de la jeringa utilizada para homogeneizar los ganglios linfáticos y bazo. La figura 6 muestra la inyección i.v. de las células T CD4/OTII en el plexo retro orbital y la inyección s.c. de OVAp cargada derivada de GM-CSF BM DCs en el bandolero. Las células T CD4/OTII distribuyen a los diferentes órganos linfoides, mientras que GM-CSF DCs emigran a los ganglios linfáticos poplíteos donde DCs de GM-CSF activa las células de T CD4/OTII ingenuo por la presentación de OVAp. Las células de T de CD4/OTII ingenuo entonces proliferan y diferencian hacia el fenotipo Th1. Figura 7 muestra la cuantificación de ingenua la activación de la célula T CD4/OTII desde el análisis de membrana CD69 y CD25 expresión. La figura 8 muestra la cuantificación de la proliferación de células T CD4/OTII. Figura 9 muestra la cuantificación de la diferenciación de las células T CD4/OTII hacia el fenotipo Th1.
Figura 1: esquema de protocolo. 1) aislar células del BM de fémur de ratón y osificados. Derivan de las células del BM 2) cultura con GM-CSF, GM-CSF BM de generar-DCs. 3) diferenciación control DC y maduro GM-CSF BM deriva-DCs con LPS. 4) comprobar la maduración de la DC. 5) carga de DCs con OVAp. 6) células T CD4/OTII aislante forman bazo de ratón. 7) las células T CD4/OTII con tinte trazador de célula vital de la mancha. 8) comprobar la pureza del aislamiento y célula vital tracer colorante tinción de las células T CD4/OTII aisladas. 9) transferencia eventualmente i.v. de células T CD4/OTII aislados a los ratones receptores. 10). transferir eventualmente s.c. DCs OVAp cargado y madurado a los ratones receptores. 11) comprobar la activación de las células T CD4/OTII. 12) comprobar la diferenciación y proliferación de células T CD4/OTII. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: proceso de aislamiento de médula ósea de fémur de ratón y osificados. (A) incisión de la piel con tijeras. (B) retiro de la piel de la extremidad. (C) incisión del músculo con las tijeras. (D) eliminación del músculo de la extremidad con un bisturí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: flujo cytometry análisis de la maduración de DCs derivadas de GM-CSF BM. Superficial expresión de MHCII, CD80 y CD86 en LPS activados (+ LPS) y desactivado (-LPS) derivadas de GM-CSF BM DCs. números muestran la intensidad media de fluorescencia en unidades arbitrarias (a.u.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: ubicación de los nodos de linfa inguinales, axilares, braquiales, cervicales y mesentéricos y el bazo de los ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: configuración Experimental para nodo de linfa y bazo homogeneización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: transferencia adoptiva de células T CD4/OTII y cargado de OVAp GM-CSF BM-derivado-DCs. (A) la inyección intravenosa de células T CD4/OTII en el plexo retro orbital. (B) inyección subcutánea de OVAp cargada derivada de GM-CSF BM DCs en el bandolero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: cuantificación de la activación de la célula de T en vivo. El flujo cytometry parcelas y gráfico que muestra el análisis y la cuantificación de la expresión de membrana de CD69 en linfocitos T CD4. CD45.1/CD45.2 ratones fueron eventualmente transferido i.v. con ratón CD45.1/CD4/OTII y CD45.1/CD4/OTII células 24 h antes de la transferencia adoptiva de s.c. de la BM de GM-CSF OVAp cargado-derivado-activación de las células DCs. T se midió en 2 días post-DC transferencia mediante citometría de flujo después de la tinción con anticuerpos fluorescentes etiquetadas a los antígenos indicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: cuantificación de la proliferación de la célula de T en vivo. Flujo cytometry diagramas y gráficos mostrando el análisis y cuantificación del tinte de tracer de célula vital disminución de tinción en la proliferación de las células T CD4. CD45.2 ratones fueron eventualmente transferido i.v. con células de ratón CD45.1/CD4/OTII 24 h antes de la transferencia adoptiva de s.c. de la BM de GM-CSF OVAp cargado-derivado-proliferación de células DCs. T se midió a 5 días post-DC transferencia mediante citometría de flujo después de la tinción con el indica anticuerpos fluorescentes. Proliferación de la célula de t puede determinarse midiendo el porcentaje de células de la proliferación, el porcentaje de células en cada punta de la división, o contando el número de picos de división como se muestra en los gráficos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: cuantificación de la diferenciación de células T hacia Th1 fenotipo en vivo. Parcelas de citometría de flujo y gráficos mostrando el análisis y la cuantificación del porcentaje de células T CD4 expresando IFNγ. CD45.2 ratones fueron eventualmente transferido i.v. con células de ratón CD45.1/CD4/OTII 24 h antes de la transferencia adoptiva de s.c. de la BM de GM-CSF OVAp cargado-derivado-diferenciación de las células DCs. T se midió en días post-DC transferencia mediante citometría de flujo después de la tinción con el indica anticuerpos fluorescentes. Diferenciación de las células t hacia el fenotipo Th1 se determinó como expresa IFNγ células como un porcentaje de células T CD4 totales y sólo las proliferación células T CD4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo permite la caracterización de la capacidad de derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de las células CD4 naïve. Además, puede también utilizarse para evaluar la susceptibilidad de las células T CD4 a modulación por DCs derivados de BM. Con este protocolo, cambios en estos eventos pueden ser medidos en vivo.
Según la hipótesis de la investigación, se pueden utilizar varias combinaciones de células T y DCs. Por ejemplo, uno puede analizar las consecuencias de golpes en o noqueando a genes específicos o la eficacia de un estímulo específico de activación de las células T CD4, proliferación o diferenciación de Th1. Estos procedimientos se pueden realizar en DCs o T CD4 células o en ambos tipos de células. Así, las células T CD4 de los ratones de tipo salvaje o genéticamente modificados pueden combinarse con DCs derivados de ratones de tipo salvaje y viceversa.
Este protocolo puede ser adaptado para distinguir el origen de las diferentes poblaciones celulares mediante citometría de flujo y anticuerpos contra CD45.1 y CD45.2. De hecho, ratones CD45.1/CD45.1 y CD45.2/CD45.2 pueden utilizarse como fuente de cualquiera de los tipos de células utilizados o como recipientes para transferencia adoptiva en cualquier combinación. Por ejemplo, las células T CD4 pueden obtenerse CD45.1/CD45.1/OTII ratones mientras que ratones CD45.2/CD45.2 pueden ser el origen del BM para la generación de DC. En este experimento, ambos tipos de células pueden transferirse eventualmente a los ratones CD45.1/CD45.2. Además, las células T CD4/OTII de CD45.1/CD45.1 uno tipo ratones y ratones de tipo dos CD45.2/CD45.2 pueden combinarse en el mismos o diferentes recipientes de tipo tres CD45.1/CD45.2 para comparar el comportamiento de tipo uno y tipo dos poblaciones de células T CD4 en la competencia y no que compiten con las condiciones, respectivamente.
Este método describe la generación de derivados de GM-CSF BM DCs. Sin embargo, protocolos alternativos están disponibles para DC la maduración y diferenciación; por ejemplo, la papaína puede utilizarse en lugar de LPS o ligando de quinasa 3 de tirosina relacionadas con fms (Flt3-L) en vez de GM-CSF, lo que permite el estudio de la capacidad de DCs fenotípicamente distintos para activar la inmunidad adaptante de la célula T CD4. Con la misma intención, DCs para la carga de antígenos y presentación pueden ser aislada directamente de ratones. Combinación de este protocolo con otros9 permite la manipulación de los ingenuos las células T CD4/OTII por infección viral16 antes de su transferencia adoptiva a los ratones receptores. BM puede ser transduced también con retrovirus9 para estudiar el efecto de modificaciones de la célula controlada en controladores de dominio antes de su utilización en el protocolo.
Además, este protocolo puede ser adaptado para microscopia intravital estudios17 usando células expresando la proteína fluorescentes. Por ejemplo, ratones CD4/OTII pueden ser cruzados con los ratones para obtener ratones GFP o cereza/OTII CD4 expresando GFP o cereza. Estos ratones pueden utilizarse como fuente de células T CD4 y se pueden combinar con derivados de BM DCs de ratones cherry o GFP-expresando, según sea necesario, experimentos en vivo .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Simon Bartlett para la edición de inglés. Este estudio fue apoyado por becas del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), el programa de Miguel Servet y la Fundación Ramón Areces; con la cofinanciación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). El CNIC es apoyado por el Ministerio de economía, industria y competitividad (MEIC) y la Fundación Pro CNIC y es un centro de excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF es fundado por la Fundación Ramón Areces y CNIC, VZG por el ISCIII, BHF por Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) y JMG-G por el ISCIII Miguel Servet programa y imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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