Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/58154
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 2,4, 2
1European Molecular Biology Laboratory, 2Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University, 3Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 4Heidelberg Partner Site, German Center for Infection Research

Summary

שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.

Abstract

בשל שלה ברזולוציה גבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) הוא כלי הכרחי עבור עשרים ושלוש. עם זאת, אחד הקשיים העיקריים בעת ניתוח תאים הנגועים בנגיף או transfected ויה EM הן היעילות נמוכה של זיהום או תרביות תאים, הפרעה הבחינה של תאים אלה. על מנת להתגבר על הקושי הזה, מיקרוסקופ אור (LM) ניתן לבצע קודם להקצות את subpopulation של תאים נגועים או transfected. לכן, מנצל השימוש פלורסנט חלבונים (FPs) התמזגו חלבונים נגיפיים, LM משמש כאן כדי להקליט את העמדות של תאי "transfected חיובי", המבטאת FP וגדל על תמיכה עם דוגמת מילוי אלפאנומריים. כתוצאה מכך, תאי מעובדות נוספות עבור EM באמצעות לחץ גבוה קפוא (HPF), הקפאת שרף והטבעה של החלפת (FS). שלב ההקפאה אולטרה מהיר מבטיח ממברנה מעולה לשימור התאים שנבחרו מסוגל ואז לנתח ברמת ultrastructural על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM). . הנה, זרימת עבודה שלב אחר שלב correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) מסופק, המתארים הכנת הדוגמא, הדמיה, המתאם בפירוט. הנבחנים ניתן להחיל גם להתייחס הרבה שאלות בביולוגיה של התא.

Introduction

הרעיון של שילוב שתי שיטות מיקרוסקופ כדי לקבל תמונה טובה יותר של תהליך ביולוגי מסוים היא זקנה למדי. לפיכך, המחקר הראשון על וירוסים באמצעות "מיקרוסקופ correlative" פורסם בשנת 1960 שני פרסומים נפרד1,2. במחקר זה, המחברים ניתח את השינויים המורפולוגיה של גרעין שנגזרות adenoviruses באמצעות שתי טכניקות במיקרוסקופ. בפרסום הראשון, תצפיות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) המתאר את הפרטים מורפולוגי הקשורים אדנו זיהום היו דווח על1. בפרסום השני, המבנים שונים נצפה ע י EM היו בקורלציה עם מיקרוסקופ אור (LM) תמונות של דפוסי מכתימים פתולוגיה, להגדיר את מהות של המבנים נצפה בעבר ע י EM2.

במחקרים אלה מוקדם, עם זאת, שלהם תצפיות בוצעו באמצעות תאים נגועים שונים מוכנים כמו ניסויים עצמאית. "הקשר", ואכן, נועד כמו השילוב של המידע שמגיע שתי שיטות הדמיה כדי להבין תופעה מסוימת, השוואת כל הממצאים אשר הושגו עם מבחני שונות על מנת להבין נתון ביולוגי תהליך.

כיום, המונח correlative מיקרוסקופ, הידוע גם בשם אור correlative ואלקטרון (קלם), חלה על מספר גדל והולך של שיטות (נבדקה הפניות3,4,5), עם המכנה המשותף כי שתי טכניקות הדמיה (LM ו- EM) מתבצעות על הדגימה אותו. השילוב של שתי השיטות תוצאות, ובכך, ניתוח ומשולבות, סולם רב, רב ממדית הזה מדגם3. היתרונות הם כי LM יכול לספק סקירה רחבה של תאים שונים רבים, המאפשרים זיהוי תא subpopulations חלבון או חלבונים עניין בתוך אוכלוסיה הטרוגנית התא. אם מתגבר על מגבלת רזולוציה של LM, מתן של תמונה ברזולוציה גבוהה יותר של אירוע מסוים תאיים. יתר על כן, EM מאפשר את הפריט החזותי של הקשר הלא-פלורסנט subcellular, לרבות כל organelles ממברנה מאוגדים, מתחמים גדולים macromolecular (למשל, ריבוזומים, centrioles, וכו '), אלמנטים cytoskeletal, ובכך מתן מידע מרחבי נוסף, שנקרא "מפנה שטח"6, ולתת בהקשר לנקודה פלורסנט זוהה על ידי LM.

במהלך השנים האחרונות, קלם הפך להיות כלי רב עוצמה תא ביולוגים5, אלא גם עבור עשרים ושלוש (נבדקה ב הפניה7) שרוצה להבין את האינטראקציות וירוס מורכבים-תא להוביל הפצת וירוסים מוצלחות. לפיכך, הבנה כיצד וירוסים לשנות קרום התא, organelles שלהם לטובת חיוני לפתח תרופות אנטי להשמיד וירוסים פתוגניים.

. הנה, שיטה קלם מתואר המאפשר הזיהוי על ידי LM של תאים המבטאים חלבונים ויראלי דבוקה חלבון פלואורסצנטי (FP). תאים אלה הם לאחר מכן משותק הקפאה נוספת מוכן לניתוח ultrastructural באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לקבל תובנות חדשות איך הביטוי של חלבונים אלה מחדש תאיים ממברנות (איור 1). קלם בוצעה עם תאים כימי קבוע ברוב המחקרים וירולוגיה פורסם תאריך8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. זאת בעיקר בשל הצורך של inactivating חומר זיהומיות מסיבות אבטחה אבטחה ברמה 2 ו-3 (BSL-2 ו- BSL-3) מעבדות, איפה הקפאה-הנייח של תאים בדרך כלל אינה אפשרית. לשאלות אלה הדורשים שימור של האופטימלית לקרום התא, ויטריפיקציה באמצעות לחץ גבוה קפוא (HPF), עם זאת, מומלץ מאוד20. במקרים אלה, ניתן להחיל את פרוטוקול קלם המתוארים כאן. מעניין, במיוחד בעת עבודה עם דגימות זיהומיות, HPF יכול להתבצע על דגימות שהיו בעבר כימית מוחלש, לדוגמה במעבדות BSL-2 ו- BSL-3. השילוב של קיבוע כימי ואחריו HPF הוא אפשרות להרוויח לפחות חלקית היתרונות של שימור-הקפאה שיטות21,22.

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי של זרימת העבודה עבור הניתוח של תאים דרך קלם. גדל דיסקים ספיר בדוגמת התאים מנותחים קודם על ידי LM כדי להתאים לשפה התאים לבטא FPs לפני העיבוד שלהם עבור EM. ברגע ממוקם, תאים מיד קבועים על ידי HPF FS להיות מוטבע לאחר מכן שרף. בעת הפילמור של השרף, התמיכה בו צמחו תאים (= דיסקים ספיר) יש להסיר מן הרחוב שרף. הרחוב המכילות את התאים מוטבע נחתך כיסוי trapezium קטן שממנו הם התאים הנותרים, המבטאת FPs, למחלקה עם סכין יהלום. סעיפים זגוגית נאספים על חריץ רשתות וכוח נוסף שבדק TEM לקבל מידע ultrastructural של תאים אלה. איור זה הותאם, ששינה באישור הפניה29. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. הכנת ספיר בדוגמת דיסקים עבור תרבית תאים

  1. העבר את הדיסקים ספיר בדוגמת (ראה טבלה של חומרים), דוגמת אלפאנומריים משיניך באחד משטחי שלהם, לתוך צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"ל.
    הערה: לחלופין, מ מ 0.05 קונבנציונאלי עבה ספיר ללא דפוס אלפא-נומריים ניתן להשתמש בדיסקים שבו תבנית הפניה נוצר על ידי פחמן ציפוי אותם עם רשת finder למעלה. לכוונה זו, הם צריכים לנקות עם אתנול לפני החלת התבנית פחמן.
  2. לשטוף ביסודיות אותם עם אתנול. פני צלחת פטרי עם נייר סינון ולתת להן להתייבש. למקם אותם על משטח זכוכית נפרדים אחד מהשני באמצעות פינצטה ארוך דק.
  3. בדוק עם מיקרוסקופ הפוכה (4 X הגדלה) אם התבנית של נקודות הציון הוא ניתן לקריאה בכל דיסק ספיר.
    הערה: אם זה לא המקרה, להעיף את הדיסקים ספיר עם העזרה של הפינצטה.
  4. חנות הדיסקים ספיר בצלחת פטרי.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

2. התא תרבות עם דיסקים ספיר בדוגמת

  1. לחטא את הדיסקים ספיר בדוגמת עם crosslinker אולטרה סגול (UV) במשך 5 דקות.
  2. קח את הדיסקים ספיר אבטחה תרבות תא ארון. לחטא את הפינצטה ארוך עם אתנול ב אבטחה הקבינט.
  3. להוסיף חצי של המדיום התרבות התא (ראה טבלה של חומרים) לצלחת תרבות התא. העבר את הדיסקים ספיר בקפידה הפינצטה ארוך לתוך המנה התרבות התא.
  4. זרע עונה 1 פרק 105 Huh7-Lunet תאים, stably לבטא את פולימראז T7 resuspended לחצי השני של המדיום התרבות תאים, על המנה תרבות.
    הערה: לחשב את מספר התאים כדי להיות נזרע באופן כזה כי בנקודת הקצה של הניסוי confluency התא צריך להיות לא יותר מ 20-30%. צפיפות גבוהה תא יפריע המעבר של התאים בשלבים מאוחרים יותר על ידי EM. יתר על כן, מעל-confluency עלולה לגרום להתנתקות תאים מן הדיסקים ספיר.
  5. בדוק כי הדיסקים ספיר נשארים בתחתית של המנה תרבות כי הקואורדינטות אלפאנומריים הם עדיין קריא עם המיקרוסקופ הפוכה.
    הערה: אם לבמה דיסקים במדיום התרבות תאים, השתמש את הפינצטה זמן לדחוף את הדיסקים התחתון ובסופו של דבר להפוך אותם בחזרה לכיוון הנכון.
  6. Transfect התאים למחרת דיווח כאמור הפניות21,23 בעקבות הוראות יצרן של הסוכן תרביות תאים.

3. LM הדמיה של תאי גידול בדוגמת דיסקים ספיר

  1. להעביר את הדיסקים ספיר-נקודת הסיום של הניסוי צלחת מתכת הדמיה המכיל 30 – 50 µL / הצב של pH חינם מחוון בינונית להפחתת קרינה פלואורסצנטית רקע לא ספציפית.
    הערה: לוחית המתכת מה שמתואר כאן (איור 2) תוכנן בסדנת המעבדה לביולוגיה מולקולרית האירופית (EMBL). בהיעדר הצלחת הזו או דומה, זכוכית-התחתון תא תרבות מנות יכול גם לשמש במקום LM. חשוב לשינוי אמצעי התרבות תאים נורמליים עבור בינונית ללא מחוון ה-pH. שימו לב גם כי יש להימנע פעמים חשיפה ארוכה כי הם עשויים לגרום photobleaching, המוביל הצטברות (ROS) מינים חמצן תגובתי ונזק פיזיולוגיים של תאים24,25.
  2. תמונה התאים תחת מיקרוסקופ זריחה widefield הפוך.
    הערה: בעת שימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-חלבון מתויגות, כפי שמוצג התוצאות נציג, 450 – 490 nm ומסננים 500-550 ננומטר עירור, פליטה, בהתאמה, אמור לשמש.
  3. רוכשים לראשונה תמונה הגדלה נמוכה (10 – 20 X) של התאים כדי להקצות תאים המבטאים רשומת FPs. את הקואורדינטות של הדיסקים ספיר בדוגמת היכן ממוקמים התאים של עניין על-ידי שימוש במיקרוסקופ ניגוד (DIC) התערבות דיפרנציאלית.
    הערה: תפרים במספר תחומים עשוי לעזור סקירה טובה יותר של המיקום של התאים/התא עניין. שימו לב שגם מיקרוסקופ ניגודיות בשלב הזה יכול לחלופין לשמש כאן.
  4. לרכוש תמונות בהגדלה (זריחה, DIC) (63 – 100 X, מטרות נפט-טבילה) של התא/התאים אותו להבחין טוב יותר לוקליזציה subcellular של החלבון עניין בתוך החלל תאיים.
    הערה: תמונות DIC מספקים מידע הקשרי. מידע זה הוא קריטי כדי לתאם LM תמונות עם EM micrographs בהמשך, לעיתים קרובות כי המתאם הסופית היא מדויקת יותר עם ציוני "אנטומיה" של התא. כמו כמה דיסקים ספיר עלול לשבור במהלך הקפאה-הנייח, מומלץ מאוד להכין triplicates לכל תנאי. יתר על כן, כמה תאים ניתוק מן הדיסקים במהלך HPF והשלבים הבאים של פרוטוקול זה, ואילו ultrastructure של תאים אחרים, עשוי להכיל חפצים אלו קופאים נזק. לכן, כדאי אזורים לפחות שני דיסקים לדימות ויה LM כדי להבטיח כי בסופו של דבר יהיו מספיק תאים כדי להיות מנותח. חשוב, שני אזורים אלה צריך להיות בצדדים מנוגדים של הדיסק. באופן זה ניתן לחתוך הרחוב שרף איפה מוטבעים התאים לשני חצאים, ניתן להשיג חלקים של אזורים אלה.

Figure 2
איור 2 : סכימה עבור ההדמיה LM של תאים שצומחים בדוגמת דיסקים ספיר. (א) הדיסקים ספיר מועברים בעזרת פינצטה בסדר צלחת הדמיה. (בג) הצלחת הזו תוכנן במיוחד במהלך הסדנה EMBL בהיידלברג להשתלב עם מיקרוסקופ אור, היכן הדיסקים ספיר יכול לדימות תא תרבות בינונית ללא מחוון ה-pH. זה מורכב של שקופית מתכת, 75 מ מ x 25 מ מ x 1 מ מ, עם ארבעה-חמישה חורים פיקנטיים לתוכה עם מקדחה 3 מ מ כדי להתאים לגודל של הדיסקים ספיר. בנוסף, חריצים קטנים היו פיקנטיים בכל צד של החורים בזווית של 90 מעלות. חורים אלה להקל על גישה הדיסקים עם מלקחיים כאשר ומתמרנים אותם. כדי לאפשר תנאים אופטימליים הדמיה coverslips זכוכית דקה מס 0 (0.085 כדי 0.13 מ"מ עובי) היו מודבקים מתחת החורים עם דבק UV, תחת אור UV להקשיח. (ד) התמונה בהגדלה של הדיסק ספיר בדוגמת המתארים את הקואורדינטות אלפאנומריים הם חרוט על פני השטח שלו. הדיסקים ספיר בדוגמת הינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. הקפאה-הנייח של תאים שצומחים ספיר בדוגמת דיסקים דרך HPF

  1. למקם את "A" ו- "B" אלומיניום ספקיות שירות עבור HPF (ראה טבלה של חומרים) בצלוחית עם מסנן נייר ספוגה 1-hexadecene. לטבול את הדיסקים ספיר בדוגמת המכילות את התאים בצלוחית עם 1-hexadecene.
    הערה: להזיז את הדיסקים קצת כדי לשטוף את המדיום התרבות תאים.
  2. להרכיב את הדיסקים ספיר בין "מצוין" נשאית אלומיניום "B" בהמחזיק HPF כדלקמן (איור 3ב). בתחתית, מקום נשאית "B" עם הצד השטוח שלו כלפי מעלה. מקם את הדיסקים ספיר בצד השטוח הזה עם תאי כלפי מעלה. הוסף נושאת "A" עם העומק שלה-0.1 מ מ מול התאים.
    הערה: בגלל הדיסקים ספיר בדוגמת עבה יותר הדיסקים ספיר קונבנציונאלי, המוביל זמינים מסחרית "A" (המיועד לשמש עם שאינם בדוגמת דיסקים ספיר מ מ 0.05) היה צריך להיחתך עד 0.05 מ"מ בצד הזה-0.2 מ מ עומק-EMBL סדנא על מנת להשתלב המחזיק HPF (איור 3א). לכוונה זו, המוביל "A" מוכנס לתוך סוף צינור מתכת כך צידה 0.2 מ מ נחשף ונשאר עדיין בזמן כורתים אותו. הקיצוץ בצד איזה מין רעש אז כך שהוא שטוח. לחלופין, ניתן להשתמש נשאית אלומיניום מיוחד על גבי התקליטור ספיר בדוגמת (זמינים מסחרית, ראה טבלה של חומרים), שהוא במקרה זה HPF "כריך" מורכב רק התקליטור ספיר ובכל נושא זה.
  3. סגור בעל המכונה HPF, להקפיא את התאים.
    הערה: פרוטוקול זה הוא ספציפי מכונה HPF מסוים. מכונות HPF אחרות יכול להיות בשימוש לחלופין6,26. בכל מקרה, עליך להיות מודע לקיומו של דור חדש מכונות מן הספקים.
    התראה: שימוש משקפי בטיחות והאוזנייה להגנת שמיעה.
  4. הצב הקפוא "כריך" בתיבת פוליסטירן עם חנקן נוזלי לאחסון קבצים זמניים.
    התראה: שימוש משקפי ולקבל בקשר עם הקצינים בטיחות המקומי לקבל מידע על הסכנות בעת טיפול בחנקן נוזלי.
    1. כדי למנוע בלבול, במקום כל "כריך" צינור microcentrifuge נפרד 0.5 mL (בתוך הקופסה פוליסטירן) מסומן עם מספר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אם החלפת ההקפאה (FS) לא ניתן לבצע באופן מיידי, הדגימות יכול להיות מאוחסן הקפאה-צינורות (עם חור בחלקו העליון) בתוך תיבות, מוחזק בתוך ארון תקשורת של חנקן נוזלי הקפאה דיואר (ראה טבלה של חומרים). מיכל חנקן נוזלי הזה צריך להיות ממוקם בחדר עם חיישני גז חמצן, כדי למנוע חנק במקרה מחסור בחמצן.
      שים לב: כל ההליכים המתוארים להלן (שלבים 5 ו- 6) צריך להתבצע באבטחה ארון. יתר על כן, רוב ריאגנטים בשימוש הם מסוכנים. לפני השימוש בהם, זה חובה לקרוא בקפידה את גליונות נתונים בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרנים, כמו גם לשאול את קציני בטיחות על החוקים המקומיים כדי להבטיח טיפול בטוח. לרשות הנכון של חומרים משומשים אלה, כמו גם עבור השימוש של הציוד המתוארים להלן, זה נדרש גם להתייעץ עם נהלי בטיחות ובריאות של המכון המקומי.

Figure 3
איור 3 : סכימת ההרכבה של ספיר בדוגמת דיסקים בין שני ספקים אלומיניום עבור HPF. (א) לחתוך משם תצפית נשאית קונבנציונאלי "A", כי צריך להיות חתוך בצד עמוק יותר מ- 0.2 מ מ עד 0.05 מ"מ. (B) הדיסק בעובי 0.16 מ"מ ספיר עם התבנית אלפאנומריים חרוט על פני השטח הוא לצרפן יחד שני ספקים אלומיניום עבור HPF , כדלקמן: הדיסק ספיר מניחים על הצד השטוח של חברת "B" עם תאי כלפי מעלה. קצוץ "A" המוביל עם העומק שלה-0.1 מ מ מול התאים מושם על למעלה קרוב "HPF הכריך". אלומיניום נושאות את הדיסקים ספיר בדוגמת זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. FS תאי הקפאה-קבוע

  1. למלא את המכונה FS (ראה טבלה של חומרים) עם חנקן נוזלי. הגדר את הטמפרטורה ל-90 ° C והמתן עד המכונה מגיע לטמפרטורה הזו.
  2. להכין המדיום FS המכיל 0.2% אוסמיום ארבע-חמצני (OsO4) (v/v), אצטט uranyl 0.1% (UA) (w/v) במזוקק זכוכית אצטון תוך המכונה FS להתקרר קצת.
    הערה: כדי להכין, (למשל) 12 מ ל FS בינוני, מערבבים 600 µL של 4% OsO4עם 0.012 גרם UA במיכל זכוכית קטנים. התמוססות תערובת זו בהתקן באמבט אולטרא עבור 5 דק להוסיף 11.4 מ של אצטון מזוקק זכוכית עם פיפטה ומערבבים היטב.
  3. למלא 1.5 mL צינורות microcentrifuge עם 200-500 µL FS בינוני, סגור את המכסה ולהעביר אותם אל המכונה FS. חכה 10 דקות עבור המדיום FS להתקרר.
  4. העברת קפוא "הכריכים" המכיל את הדיסקים ספיר עם תאים חנקן נוזלי באמצעות פינצטה ארוכה מקורר על הצינורות המכילים המדיום FS.
    התראה: שימוש הקפאה-מגן כפפות ומשקפי מגן.
    הערה: HPF "כריכים" יכול לפרק באופן ספונטני במהלך הטיפול שלהם. במקרה זה, ודא כי הדיסקים וספיר קפוא מועברים הצינורות microcentrifuge. יכול להיות מושלך נושאות אלומיניום.
  5. הפעל את FS כדלקמן עד היום הבא27: מ-90 ° C ל-80 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות; מ-80 מעלות צלזיוס ל-50 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות; מ-50 ° C ל-20 ° C עבור 2 h; מ-20 ° C עד 0 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.

6. שרף ההטמעה של ההקפאה שהוחלפו דגימות

התראה: כל ההליכים המתוארים להלן חייב להתבצע בתוך ארון אבטחה. יתר על כן, רוב ריאגנטים בשימוש הם מסוכנים. לפני השימוש בהם, זה חובה לקרוא בקפידה את גליונות נתונים בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרנים, כמו גם לשאול את קציני בטיחות על החוקים המקומיים כדי להבטיח טיפול בטוח. לרשות הנכון של חומרים משומשים אלה, כמו גם עבור השימוש של הציוד המתוארים להלן, זה נדרש גם להתייעץ עם נהלי בטיחות ובריאות של המכון המקומי.

  1. להוציא את דגימות שהוחלפו מהמכונה FS ולמקם אותם על קרח למשך 20 דקות.
  2. שומרים את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ולשטוף אותם ביסודיות (3 פעמים, 10 דקות כל אחד) עם אצטון מזוקק זכוכית. להתעלם נושאות אלומיניום עם פינצטה ארוכה אם הם עדיין בתוך הצינורות microcentrifuge לאחר FS.
  3. לחדור לתאים (על הדיסקים ספיר הנותרים) סדרה של שרף אפוקסי ארבעה שלבים באמצעות 1 h incubations ב- 25%, 50% ו 75% שרף אצטון מזוקק זכוכית, ואחריו הדגירה לילה עם 100% שרף. חילופי השרף 100% ביום המחרת לשעה.
  4. בזהירות המקום הדיסקים ספיר לטבעות זרימה דרך רכוב בתוך אמבטיות ריאגנט מלא 100% שרף. טבעות אלו משמשים הפילמור בתבניות 10 דיסקים ספיר.
    הערה: הדיסקים ספיר חייב להיות לגמרי דחף לתחתית הציון כלפי מעלה באופן קריא. זה יכול להיבדק בעזרת משקפת מצורף extractor fume. לחלופין, משקפת בתוך ארון אבטחה יכול לשמש במקום. חשוב, ישנם מספרים (1-10) חרוט על החלק התחתון של ריאגנטים לעזור לזהות הדגימות.  בנוסף, עבור זיהוי של הדגימות יכול לכלול תג נייר בבלוק שרף.
  5. פולימריזציה הדגימות בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.

7. הסרה של ספיר בדוגמת דיסקים של אבני Polymerized שרף

  1. הסר את אבני קשה שרף המכילות את התאים מן התנור.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אם לא, ומצננים את רחובות עד לטמפרטורת החדר לפני חיתוכם.
  2. חותכים את התבניות ההטבעה עם סכין גילוח גישה הבלוקים שרף. הסר את גושי שרף גלילי באמצעות פינצטה.
    הערה: אם תג נייר לא נכללה השרף לחסום לפני הפילמור, מספר אבני עם סמן קבוע ולאחסן אותם 1.5 mL microcentrifuge צינורות. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.
  3. לטבול את קצה הרחוב שרף המכיל את הדיסק ספיר בקופסה פוליסטירן המכילה חנקן נוזלי עד לעצירתו "מבעבעים". לאחר מכן, לטבול את קצה הרחוב שרף רותחים H2O.
  4. חזור על שני השלבים הקודמים כמה פעמים לפי הצורך עד שהדיסק ספיר נופל מחוץ לבלוק שרף.
    התראה: שימוש משקפי מגן וכפפות הקפאה-מגן.
    הערה: אם זה לא עובד, השתמש סכין גילוח כדי להסיר קצת שרף polymerized סביב הדיסקים לפני שתנסה שוב. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה.

8. ממוקד זמירה ואת חלוקתה ודק במיוחד עבור TEM

  1. לזהות את האזור על פני בלוק שרף איפה התאים עניין קיימים על-ידי בדיקת פני בלוק עם התאום של ultramicrotome.
    הערה: החותם שלילי של התבנית קואורדינטות של הדיסקים ספיר בדוגמת נשמר על פני בלוק. דבר זה מאפשר הזיהוי של האזור שבו התאים עניין ממוקמים על זמירה יישוב. הדימויים LM יש בזאת אנכית על מנת להקל על מציאת באותה התנוחה של הפנים בלוק.
  2. לקצץ את טפט תא מוטבע המכילות את התא/התאים לעניין פירמידה שטוח קטן עם הצורה של כיסוי trapezium (~ 200 מיקרומטר × 250 µm גודל ממוצע) עם סכין גילוח נקי.
  3. להשיג סעיפים 70-nm ודק במיוחד של התאים מוטבעים עם סכין יהלום 35°.
  4. במקום הסעיפים על רשתות חריץ EM בעזרת פינצטה ultra-בסדר.
    הערה:: השימוש של רשת רשתות יש להימנע כי הסעיפים יכול להיות רעולי פנים על ידי פסי רשת.
  5. אחסן את הרשתות בתוך קופסה לרשת.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

9. TEM ניתוח סעיפים זגוגית

  1. מניחים את הרשת חריץ האוחז המיקרוסקופ האלקטרוני שידור. לרכוש תמונות הגדלה נמוכה (מבט כולל), שבו מוצגת לפרופיל תא מוחלטת של התא עניין.
    הערה:: התא/התאים של עניין ניתן למצוא באמצעות הפרופילים תא והמיקום התאים אחד לשני גם הפניות, השוואה בין תצוגות DIC שרכשה לפני LM.
  2. לרכוש תמונות בהגדלה של התא/תאים מעניינים, לנסות ולמצוא, ברמת ultrastructural, תכונות התואמים אותות פלואורסצנט שנצפה קודם לכן על ידי LM.
    הערה: ניתן להשיג מצרף תמונות בהגדלה גדולה כדי לקבל מבט ברזולוציה גבוהה של התאים/התאים של ריבית. יתר על כן, יש לעיתים קרובות צורך לרכוש תמונות באותו התא בסעיפים טורי רצופים כדי להיות מסוגל לשחזר את התא ב- 3D לפני השוואת לתמונות זריחה.

Representative Results

באמצעות ההליך המובאת כאן (איור 1), תאים Huh7-Lunet stably להביע את T7-RNA פולימראז היו נזרע וספיר בדוגמת דיסקים, לאחר מכן transfected עם פלסמיד לבטא שתי קבוצות המחשבים של הנגיף הפטיטיס C (בזכות) חלבון nonstructural NS5A, עם התגית GFP (pTM_AH-D1-GFP) (איור 4). למחרת, הדיסקים ספיר בדוגמת, שבה מגדלים את התאים, להוציא את הכלים התרבות תאים, עם תמונה של LM (איור 4, איור 2). תאים אלה לבטא את הא-D1-GFP היו המזוהה על-ידי הנוכחות של זריחה ירוק ב ציטוזול והקליט כדי להציל את העמדות שלהם בתוך התבנית הקואורדינטות דיסקים ספיר (דמויות 5A, 5B). מיד לאחר הבדיקה שלהם LM, הדיסקים ספיר המכילות את התאים עניין היו מורכבים בין אלומיניום שני מנשאים (איור 3), נתון הקפאה-הנייח על ידי HPF. התאים היו לאחר מכן להקפיא שהוחלפו ומוטבעים לאחר מכן שרף אפוקסי.

בעת הסרה של הדיסקים ספיר מ אבני שרף polymerized, החותם של התבנית אלפאנומריים היה גלוי על פני בלוק, אשר אפשרה מאחזר את האזורים איפה שהו התאים עניין. שאר הבלוק שרף תוקן משם כדי ליצור כיסוי trapezium קטן מסתירים את התאים של עניין. טורי מקטעים ודק במיוחד היו המתקבל זה כיסוי trapezium, שנאסף על רשתות חריץ EM, בהמשך נותחו על ידי TEM (איור 5C). שים לב כי קבלת מקטעים רציפים באופן ידני טורי אמנם ריאלי28 אינטנסיבי והם העבודה דורשת כוח אדם מיומן ומיומן. חשוב גם כי התאים יש confluency נמוך כאשר נתון פרוטוקול זה קלם (איור 5א) כדי להבטיח זיהוי מהיר באותו התא זוהו בעבר על ידי LM. אחרת, נתקל confluency תא גבוה יותר עשוי באופן דרמטי להאט את איתור מוצלח של תאים ברמת EM.

ניתוח TEM של כמה מקטעים ודק במיוחד של התא של הריבית (דמויות 5D, 5E), לבטא את הא-D1-GFP, חשף את הנוכחות שלו במרחב תאיים של גדול הצטברויות של שלפוחית של מורפולוגיה משתנה מופרד מן סביב ציטוזול על ידי יחיד ליפידית (איור 5E).

Figure 4
איור 4 : ייצוג סכמטי של זרימת העבודה ולאחר מכן לבצע את הדוגמה קלם מצטיירת איור 5 . תאים Huh7-Lunet stably להביע את T7-RNA פולימראז היו transfected עם פלסמיד ה-DNA קידוד את הסליל amphipathic (AH) לבין קבוצת המחשבים 1 (D1) של חלבון בזכות NS5A, מתויגים במסוף שלה C עם GFP (pTM_AH-D1-GFP). הביטוי של חלק זה של החלבון NS5A נשלטת transcriptionally על ידי יזם T7 (T7 Pm), translationally על ידי גורם IRES (הריבוזום פנימי ערך האתר) וירוס (EMCV) encephalomyocarditis, המצוין על-ידי מבנה משני. עשרים וארבע שעות שלאחר תרביות תאים (24 hpt) תאים שצומחים בדוגמת דיסקים ספיר, לבטא את הא-D1-GFP היו זוהה על ידי LM ונחשפו מיד HPF-FS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : דוגמה של שגרת קלם. (א) Huh7-Lunet תאים stably לבטא את פולימראז T7 נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ להקצות תאים GFP-חיוביות גדל על דיסקים ספיר בדוגמת, 24 שעות לאחר תרביות תאים עם פלסמיד pTM_AH-D1-GFP. (B) גבוהה יותר התמונה ההגדלה של תא בודד שנבחר המלבן הלבן מקווקו כדי להיות מנותח על ידי קלם. (ג) תמונת TEM של מקטע ודק במיוחד לאותו התא, גם לאחר HPF, FS והטבעה שרף. (ד) ייצוג סכמטי של טורי 70-nm מקטעים ודק במיוחד על רשת חריץ EM המכילה את התא של ריבית. (ה) משמאל: סקירה TEM שני מקטעים של התא של ריבית. מימין: בהגדלה תמונות TEM של האזורים תאיים נבחרה במלבנים צהוב בצד השמאל, חשיפת מספר גבוה של שלפוחית מופרד מן ציטוזול דרך קרום יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

המתודולוגיה קלם המובאים כאן לחקור את ההשפעה של ביטוי חלבון נגיפי על קרום התא שימש בהצלחה לפני התירי את בזכות שכפול-הקשורים מבנים, בעיקר קרום כפול שלפוחית (DMVs)21, כמו גם לקבוע אבני הבניין קריטי הנדרש כדי ליצור אלה הנוצרות על-ידי בזכות מבנים23. שימו לב כי בעבודתנו הראשונים באמצעות קלם ללמוד בזכות שכפול21, גירסה קצת שונה של הפרוטוקול המתואר כאן יושם. באותו מחקר, דיסקים ספיר עבה מ מ 0.05 קונבנציונאלי, ללא דפוס אלפא-נומריים, שימשו שבו תבנית הפניה נוצר על ידי פחמן ציפוי אותם עם רשת finder למעלה (ראה טבלה של חומרים). גירסת פרוטוקול הנוכחי יכול להיות בסופו של דבר מיושם, עם יתרון כי המוביל "A" HPF ניתן להשתמש ישירות, ללא צורך כורתים אותו כמו איור 3א. לחלופין, כאמור בפרוטוקול, עבה "A" המוביל יכול להיות מנוצל (ראה טבלה של חומרים) עם דיסקים ספיר בדוגמת, ללא הצורך של חברת "B".

מעניין, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק ללמוד דגימות BSL-1, כגון תאים transfected עם חלבונים ויראלי כפי שמתואר כאן ושם19,23, אלא גם ללמוד תאים הנגועים בנגיף. למרות עבודה עם פתוגנים האנושית היא בדרך כלל מוגבלת למעבדות BSL-2 ו- BSL-3, במדינות מסוימות זה עדיין אפשרי לבצע הקפאה-הנייח בתנאים אלה אבטחה. אלה BSL-2, מעבדות BSL-3 איפה ויטריפיקציה אינה אפשרית, בשל תקנות מקומיות או העדר של מכונת HPF, תאים הנגועים בנגיף ניתן עדיין להכין בשיטה זו אם קיבוע כימי עם aldehydes יבוצע בתיאום מראש. כלומר לפני שעזב את המתקנים BSL-2 או BSL-3. יתר על כן, aldehydes צריך לכלותה מיד לאחר קיבוע לשמור את פלורסצנטיות, בעוד שאר הפרוטוקול היא זהה לזו המתוארת כאן. טכניקה זו יכולה להיחשב מיותר כי התאים קבועים פעמיים, מבחינה כימית, דרך ויטריפיקציה. עם זאת, פרוטוקול קיבוע זוגי זה מוביל אכן הרבה יותר טוב שימור DMVs בזכות-induced בהשוואה DMVs נמצאו תאים נתון קיבוע כימי לבד21.

עוד שינויים ולפתרון הקורא נקרא את הערות במהלך החלק פרוטוקול של כתב היד הזה. הערות אלו מתארים כדי למנוע pitfalls, וכן חלופות להתגבר על הקשיים בשם שעלולות להתעורר בעת ביצוע בשיטה זו.

המתחייב הראשי להחלת טכניקה זו היא מכונת HPF. מתי הקפאה-שיתק התאים באמצעות HPF הוא לא ריאלי (העדר מכונת HPF) או לא נדרש (כאשר שימור ממברנה אינו צריך להיות אופטימלי), תאים יכולים להיות כימי קבוע, לאחר מכן מוכן, נותחו על ידי EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. אפשרות זו אינה דורשת שימוש דיסקים ספיר, אבל התא מנות תרבות עם דפוסים gridded לרילוקיישן תאים או תא אשכולות. היתרון העיקרי של השימוש של הכלים האלה הוא שלהם בקוטר גדול יותר בהשוואה דיסקים ספיר, המאפשר הקרנת הסרט פני שטחים גדולים יותר. לפיכך, היישום של פרוטוקול קלם זה יושם בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של תרכובת אנטי נגד בזכות15 או לדמיין את rearrangements ממברנה שנגזרות החלבונים nonstructural של noroviruses19. על נושא אחר ניתן להגביל את הביצועים של שיטה זו הוא בהעדר מכשיר FS מסחרי. במקרה זה, מערכות בסיסי FS תוצרת בית יכול להיות מנוצל במקום. למרות מכונות ונדינג FS עשויים להפחית את התקלות טיפול, תוצרת בית, משמש בהצלחה למשל-קנט מקדונלדס30 ומעבדות פול. וולטר.

לגבי קיבוע כימי, הפרוטוקול המתואר כאן מבטיח של האופטימלית שימור מבנים תאיים20. לכן, במקרה המכשירים HPF ו- FS הנ ל זמינים, vitrifying את התאים עניין יהיה מועדף.

חלופות עתידי לגישה זו קלם כוללים את האפשרות להשתמש בשיטה זו לא רק לרכוש מידע 2D ברמת ultrastructural, אלא גם כדי לקבל נתוני תלת-ממד על הארכיטקטורה של הממברנה, אברון. שינויים שנגרמו על ידי וירוסים. השיטות 3D-EM, לרבות טומוגרפיה אלקטרון (ET) ואלקטרון יון ממוקד לסריקת קרן (שיקרתי-SEM) (שמתואר בהרחבה29), יכול להיות מיושם גם בתאים שלא הוכנו בעקבות זה הנוכחי פרוטוקול21, 31. בנוסף, 3D היתה אפשרות גם לקבל מידע ברמת LM, כאשר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, המאפשר הרכישה של z-במחסן. למעשה, אפשרות זו מומלצת מאוד כאשר מתאם מדויק בין datasets באימות LM ו- EM הוא הרצוי (ראה לדוגמה17). המידע הכלול z 3D-במחסן מסייע לשיפור הקשר עם תמונות TEM 2D. לפיכך, בתרחיש כזה, הכי מתאים תמונות LM ו- EM יכול להיות שנבחרו ונחשפו ואז לאחד התוכנה המתאם זמינים, כגון ה-ec-קלם plugin של אייסי (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 או תוסף התכתבויות ציון דרך של תמונת J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), וכתוצאה מכך הדור של חופפים תמונות LM-EM.

כאשר מידע זמני יש צורך להבין את קינטיקה של אירוע מסוים, הדמיה בצילום מואץ ניתן לעקוב אחר הדינמיקה של תאים חיים, בשילוב עם EM. במהלך האירוע עניין תאים קבועים באופן מיידי, יצירת "תמונה קפואה" מסוגל לאחר מכן לנתח באמצעות EM, מתן מידע ultrastructural מפורט אודות בדיוק באותו רגע בזמנו של הנייח. על מנת לקבל את "בזק קפוא," לאחר הצפייה בזמן אמת, תאים יכולים להיות כימי קבוע33 או הקפאה. מרותק למיטה6. מאז תהליכים תאיים רבים מתרחשים מהר יותר תהליכי דיפוזיה של קיבוע כימי, במידת האפשר, הקפאה מהירה במיוחד יש לבצעו. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי המכונות HPF נבדלים שלהם ברזולוציה של זמן אפקטיבי34.

יתר על כן, אף על פי פרוטוקול זה תוכנן עבור ההטמעה של תאים שרף אפוקסי, התאים ניתן גם להטביע שרפים צמיגות נמוכה, כגון Lowicryls, LR לבן או זהב LR. בשימוש במדיה ההטבעה אלה מאפשר לשמר את antigenicity35,36, וכן קרינה פלואורסצנטית37,38 ו, לכן, משמשים בעיקר להטבעת פוסט-immunolabeling על סעיף39 , 40 ו---סעיף קלם41,42,43,44, שבו פרוטוקול LM נעשית לאחר ההטמעה. שתי הגישות (חיסונית-EM ו---סעיף קלם) חייב להיות מכריע לניסויים הללו שבה מבנים, מאפיין שאינו ניתן בקלות למצוא דרך TEM ו/או כפקד נגד miscorrelation בין באימות LM ו- EM אותות. באופן דומה, תיוג עם נוגדנים, ניתן לאבחן על ידי שתי שיטות הדמיה (LM ו- EM) יכול להתבצע45 כדי, למשל, לזהות תאים transfected LM (הטבעה מראש הבמה) ולהשיג על לוקליזציה הרבה יותר מדויק של האות ה-GFP ויה שלה תיוג ספציפית על ידי חיסונית-EM (שלב פוסט ההטבעה). יש לקחת בחשבון, עם זאת, permeabilization הזה מבוצע לפני LM כדי לאפשר את הגישה של הנוגדנים למרחב תאיים, אשר עלול לגרום שימור תת אופטימלית של האדריכלות תא ברמת EM. מעניין, פרוטוקול זה מתאימה מאוד גם עבור צבע רב הניסויים אשר יכולה להיות מושגת עם השימוש של תגיות פלורסנט אחרים, מלבד GFP (כפי שמוצג כאן). לסיכום, ישנן אפשרויות רבות בשם של התאמת פרוטוקול זה, הן על פרוטוקול LM ו/או בצדדים EM, תלוי השאלות להיות המטופלות. לקבלת תיאור מקיף של פרוטוקולים אחרים חלופי הקורא נקרא5,46. יחד ללא קשר כיצד שיטות מיקרוסקופ משולבים, התוצאה היא רווח של מידע, אשר מאפשר לנו להבין טוב יותר כיצד וירוסים וחלבונים שלהם אינטראקציה עם מארחיהם בחיים האמיתיים.

השלב הקריטי ביותר בתוך שיטה זו היא האוסף של קטעים טורי מתאי עניין. כפי שמודגש במקטע תוצאות נציג, הדבר דורש צוות מומחה, כמו גם הרבה סבלנות. חשוב לציין, שלב זה חיוני כדי לחפש את התאים חזרה באותה רמת EM משתי סיבות. ראשית, מעין פרוטוקול קלם באמצעות הטבעה מראש LM, נקודות הציון גלויים רק ברמה של LM, על פני בלוק שרף לאחר ההטמעה. עם זאת, הם לא יהיו גלויים על הסעיפים על ידי TEM. לכן, זמירה יישוב על פני בלוק למטה אל מחוזות ריבית (ROIs) חייב להתבצע בזהירות עם סכין גילוח כדי להבטיח כי הסעיפים שמושגות לאחר מכן מכילים התאים לבטא FP נתון. שנית, "סריקה" בכמה סעיפים יש צורך למצוא את הכיסוי הטוב ביותר בין פרוטוקול LM ורכישות EM. בניגוד לשיטות איפה LM מתבצע בשלב שלאחר ההטבעה, במקרה זה הכיסוי LM-EM הוא לא מדויק. דיוק כיסוי נמוך הוא ההבדלים ברזולוציה צירית בין באימות LM ו- EM, הצטמקות במהלך עיבוד הדגימה של EM ודחיסת במהלך חלוקתה42. יחד עם זאת, שיטות מעקב יעיל אחר, כגון השימוש של ציוני דרך, לעזור למצוא את התאים בחזרה. זה כולל את המיקום של תא אחד למשנהו, כמו גם את צורת התאים ואת הגרעין שלהם. בהקשר זה, כפי שהוסבר בפרוטוקול, DIC תמונות לספק מידע "אנטומיה" של התאים הם קריטיים כדי לשפר את המתאם. לחלופין, הגרעינים או אחרים האברונים טוב ניתן לזיהוי (כגון המיטוכונדריה או השומנים טיפות) יכול להיות מוכתם לפני LM ומשמש ציוני דרך.

לבסוף, ראוי לציין כי אף על פי כתב יד זה מתמקדת השימוש בטכניקה זו ללימודי וירולוגיה, היקף עיצוב ניסיוני זה ניתן להרחיב שאלות ביולוגיות כלליות יותר.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

. אנחנו מאוד אסירי תודה לחברי הצוות של מיקרוסקופ אלקטרונים הליבה מתקנים (EMCF) ב EMBL (היידלברג) וב אוניברסיטת היידלברג. גם ברצוננו להודות אולריקה Herian, סטפני Kallis, אנדראה Hellwig (אוניברסיטת היידלברג), כמו גם אברהרט שמידט רנטה קונץ (האוניברסיטה ההיסטורית אולם) לקבלת סיוע טכני מומחה. עבודה לפי R.B. וצוותו (U.H. ו לתעשיה-בי) נתמכה על ידי פתוח, SFB1129, TP11 TRR83, TP13.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UV Crosslinker Stratagene 400072 Stratalinker 1800, 230 Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8 Watts/each.
Patterned sapphire discs Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 627 They have a 0.3 mm diameter and are 0.16 mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Slim and long tweezers Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 72919-SS "Style SS", for handling sapphire discs.
Cell culture medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 41965-062 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 µg streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 mL/each.
L-glutamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 25030-123 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Nonessential amino acids Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11140-068 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140-163 Package containing 20 bottles of 100 mL/each.
Fetal calf serum Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA F7524 Bottle of 50 mL
Inverted microscope Olympus Deutschland, Hamburg, Germany CKX41 It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.
Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory Not available Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent Mirus Bio LLC, Madison, USA MIR 2304 Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 mL
Inverted widefield fluorescence microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany Zeiss Observer.Z1 Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.
1-hexadecene Merck, Darmstadt, Germany 8220640100 Bottle of 100 mL
"A" aluminium holders for high pressure frezing (HPF) Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 241 This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2 mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"B" aluminium holders for HPF Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 242 This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3 mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
"A" aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs) Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 737 This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a "B" holder or the edition of the "A" holder. It is 0.84 mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Sapphire discs Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland 405 These sapphires discs are the "conventional" one, with a 0.3 mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.
Finder grids Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA LF135-Cu These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on "conventional" sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.
HPF machine ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland HPM 010 This HPF machine has been used for this protocol.
HPF machine Leica Microsystems, Vienna, Austria EMPACT 2 "EMPACT 2", as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).
Cryo-tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Z763667-500EA For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.
Liquid nitrogen dewar Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany GZ-05094-60 For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.
Automatic freeze substitution (AFS) machine Leica Microsystems, Vienna, Austria EM AFS2 This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.
Osmium tetroxide (OsO4) Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 19150 4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 mL ampules.
Uranyl-Acetate (UA) Serva, Heidelberg, Germany 77879.01 Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.
Sonicator Bandelin Electronic, Berlin, Germany 329 "Sonorex Super RK 31" is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.
Glass-distilled acetone Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 10015 Bottle of 100 mL
Stereomicroscope Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica M80 Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 14120 Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.
Flow through rings Leica Microsystems, Vienna, Austria 16707157 Package containing 100 pieces.
Reagent baths Leica Microsystems, Vienna, Austria 16707154 Package containing 100 pieces.
Ultramicrotome Leica Microsystems, Vienna, Austria Leica EM UC7 Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.
Ultra 35 ° diamond knife Diatome Ltd., Nidau
Switzerland		 AGG339-735 This knife have an edge length of 3 mm.
Ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA E78318 "Style 3X", for handling EM grids.
EM slot grids Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA G2010-Cu 100 grids/vial.
EM grid storage box Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 71155 It has capacity for 100 grids.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morgan, C., Godman, G. C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. I. Electron microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 373-382 (1960).
  2. Godman, G. C., Morgan, C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. II. Light microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 383-402 (1960).
  3. Caplan, J., Niethammer, M., Taylor, R. M., Czymmek, K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. Current Opinion in Structural Biology. 21, 686-693 (2011).
  4. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nature Methods. 12, 503-513 (2015).
  5. Müller-Reichert, T., Verkade, P. Correlative light and electron microscopy III, First edition. , Elsevier/Academic Press. Cambridge, MA. (2017).
  6. Brown, E., Mantell, J., Carter, D., Tilly, G., Verkade, P. Studying intracellular transport using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20, 910-919 (2009).
  7. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Letters. , (2016).
  8. Spuul, P., et al. Assembly of alphavirus replication complexes from RNA and protein components in a novel trans-replication system in mammalian cells. Journal of Virology. 85, 4739-4751 (2011).
  9. Nagel, C. H., Dohner, K., Binz, A., Bauerfeind, R., Sodeik, B. Improper tagging of the non-essential small capsid protein VP26 impairs nuclear capsid egress of herpes simplex virus. PLoS One. 7, 44177 (2012).
  10. Sharma, M., Kamil, J. P., Coughlin, M., Reim, N. I., Coen, D. M. Human cytomegalovirus UL50 and UL53 recruit viral protein kinase UL97, not protein kinase C, for disruption of nuclear lamina and nuclear egress in infected cells. Journal of Virology. 88, 249-262 (2014).
  11. Kallio, K., et al. Template RNA length determines the size of replication complex spherules for Semliki Forest virus. Journal of Virology. 87, 9125-9134 (2013).
  12. Martinez, M. G., Snapp, E. L., Perumal, G. S., Macaluso, F. P., Kielian, M. Imaging the alphavirus exit pathway. Journal of Virology. 88, 6922-6933 (2014).
  13. Lebrun, M., et al. Varicella-zoster virus induces the formation of dynamic nuclear capsid aggregates. Virology. 454-455, 311-327 (2014).
  14. Madela, K., et al. A simple procedure to analyze positions of interest in infectious cell cultures by correlative light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 124, 93-110 (2014).
  15. Berger, C., et al. Daclatasvir-like inhibitors of NS5A block early biogenesis of hepatitis C virus-induced membranous replication factories, independent of RNA replication. Gastroenterology. 147, 1094-1105 (2014).
  16. van der Schaar, H. M., et al. Illuminating the Sites of Enterovirus Replication in Living Cells by Using a Split-GFP-Tagged Viral Protein. mSphere. 1, (2016).
  17. Vale-Costa, S., et al. Influenza A virus ribonucleoproteins modulate host recycling by competing with Rab11 effectors. Journal of Cell Science. 129, 1697-1710 (2016).
  18. Wang, L., et al. Visualization of HIV T Cell Virological Synapses and Virus-Containing Compartments by Three-Dimensional Correlative Light and Electron Microscopy. Journal of Virology. 91, (2017).
  19. Doerflinger, S. Y., et al. Membrane alterations induced by nonstructural proteins of human norovirus. PLOS Pathogens. 13, 1006705 (2017).
  20. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  21. Romero-Brey, I., et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLOS Pathogens. 8, 1003056 (2012).
  22. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  23. Romero-Brey, I., et al. NS5A Domain 1 and Polyprotein Cleavage Kinetics Are Critical for Induction of Double-Membrane Vesicles Associated with Hepatitis C Virus Replication. MBio. 6, 00759 (2015).
  24. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36, 280-290 (2003).
  25. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1011, 45-56 (2004).
  26. McDonald, K. L., Morphew, M., Verkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: equipment- and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  27. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208, 3-10 (2002).
  28. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1-340 (1986).
  29. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral Infection at High Magnification: 3D Electron Microscopy Methods to Analyze the Architecture of Infected Cells. Viruses. 7, 6316-6345 (2015).
  30. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  31. Villinger, C., Neusser, G., Kranz, C., Walther, P., Mertens, T. 3D Analysis of HCMV Induced-Nuclear Membrane Structures by FIB/SEM Tomography: Insight into an Unprecedented Membrane Morphology. Viruses. 7, 5686-5704 (2015).
  32. Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14, 102-103 (2017).
  33. Polishchuk, R. S., Mironov, A. A. Correlative video light/electron microscopy. Current Protocols in Cell Biology Supplement. , Chapter 4, Unit 4 8 (2001).
  34. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of Microscopy. 235, 273-281 (2009).
  35. Newman, G. R., Jasani, B., Williams, E. D. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. The Histochemical Journal. 15, 543-555 (1983).
  36. Schwarz, H., Humbel, B. M. Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microscopy. 3, Supplement. Discussion 63-54 57-63 (1989).
  37. Luby-Phelps, K., Ning, G., Fogerty, J., Besharse, J. C. Visualization of identified GFP-expressing cells by light and electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 51, 271-274 (2003).
  38. Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
  39. McDonald, K. L. Rapid embedding methods into epoxy and LR White resins for morphological and immunological analysis of cryofixed biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  40. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods in Cell Biology. 88, 45-58 (2008).
  41. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. Journal of Cell Biology. 192, 111-119 (2011).
  42. Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
  43. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled Nuclear Pores Insert into the Nuclear Envelope during Early Development. Cell. 166, 664-678 (2016).
  44. Lemercier, N., et al. Microtome-integrated microscope system for high sensitivity tracking of in-resin fluorescence in blocks and ultrathin sections for correlative microscopy. Scientific Reports. 7, 13583 (2017).
  45. Takizawa, T., Powell, R. D., Hainfeld, J. F., Robinson, J. M. FluoroNanogold: an important probe for correlative microscopy. Journal of Biological Chemistry. 8, 129-142 (2015).
  46. Romero-Brey, I. 3D electron microscopy (EM) and correlative light electron microscopy (CLEM) methods to study virus-host interactions. Methods in Molecular Biology: Influenza Virus Methods & Protocols. Yamauchi, Y. , Springer. (2018).

Tags

בלחץ גבוה בביו-הנדסה גיליון 139 קפוא להקפיא החלפת ויטריפיקציה זמירה יישוב במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים דיסקים ספיר תרבית תאים וירוסים זיהום אינטראקציות וירוס-מארח ultrastructure הנוצרות על-ידי וירוס שינויים הסלולר.
Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santarella-Mellwig, R., Haselmann,… More

Santarella-Mellwig, R., Haselmann, U., Schieber, N. L., Walther, P., Schwab, Y., Antony, C., Bartenschlager, R., Romero-Brey, I. Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells. J. Vis. Exp. (139), e58154, doi:10.3791/58154 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter