Summary
Her presenterer vi en protokoll til posten telemetrisk electroencephalograms (EEGs) fra fritt flytte grisunger direkte i pigpen uten bruk av en beroligende, gjør det mulig å ta opp typiske EEG mønstre under ikke - REM søvn, som vri sprekker.
Abstract
Metoden gjør opptak av høy kvalitet electroencephalograms (EEGs) fra fritt flytte grisunger direkte i pigpen. Vi bruker en én-kanals telemetrisk Elektroencefalogram system i kombinasjon med standard selvklebende hydrogel elektroder. Grisunger er roet seg uten bruk av sedativa. Etter sin utgivelse i pigpen, grisunger fungerer normalt, de drikke og sove i samme syklus som sine søsken. Deres sove faser brukes for EEG opptakene.
Introduction
Grisunger er en voksende modellsystem for nevrovitenskap1. For å styrke translasjonsforskning, oppfant vi en metode for å registrere ikke-invasiv, klinisk EEGs fra hemningsløs grisunger2 (figur 1 og figur 2). To forutsetninger for en translational bruk av EEG innspillinger, om EEG mønstre forbundet med kortikale modning, er en ikke-invasiv metode, sammenlignes med klinisk setting og avholdenhet sedativa eller anestesi. En kanal telemetri systemet3 sammen med selvklebende elektrodene kan bli løst på ca 5 min. etterpå, grisunger vil komme seg raskt fra håndteringsprosedyren og synkronisere sine fôring og sove funksjonalitet som i andre grisunger og utførelseserklæringen.
Selv om det er allerede forsøk på å bruke ikke-invasiv EEG opptak fra bedøvet dyr4, er de fleste Elektroencefalogram studier fra dyr gjennomført med invasive metoder. Disse metodene har bivirkninger om inflammatoriske prosesser rundt implanterte elektroder5,6 , og i de fleste tilfeller, de krever en sosiale atskillelse av dyr på grunn av de eksterne komponentene av implantert EEG. Derfor er oversettelsen av disse dataene skal klinisk sammenheng vanskelig. Behovet for translasjonsforskning tilnærminger blir tydelig av det faktum at det ikke er fortsatt kjent hvordan en "normal" hjernen modning under kortikale utviklingen er representert ved klinisk, ikke-invasiv Elektroencefalogram7. Denne kunnskapen hullet er forårsaket av tekniske utfordringer knyttet EEG opptak fra premature babyer8. I dyremodell systemer er kortikale utviklingen bedre tilgjengelig, siden de fleste dyr er født med en "premature brain" i forhold til menneskelig kortikale utvikling9. Foruten bevarte mønstre av kortikale utvikling over arter2, har det nylig vist at EEG opptak fra premature babyer kan også forutsi det enkelte kliniske utfallet i senere liv10,11. Metoden beskrevet her er spesielt nyttig for translasjonsforskning aspekter av utviklingsmessige nevrovitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av den lokale etikk (#23177-07/G10-1-010/G 15-15-011) og fulgte europeiske og tyske nasjonale bestemmelser (europeiske samfunn rådsdirektiv, 86/609/ECC; Tierschutzgesetz).
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med Medical Center på Johannes Gutenberg-universitetet Mainz dyr omsorg komiteens bestemmelser.
1. installasjon
- Før eksperimentet, sjekk for eventuelle støy og finne en tilstrekkelig beliggenhet for oppsettet og antennen. Støy er synlig som en 60 eller 50 Hz sinuskurve.
Merk: Plasseringen av antennen og spesielt avstanden mellom senderen og mottakeren, avhenger av overføring styrken på systemet. Systemet brukes her er justerbar. Det ble justert til en relativt lav makt, med en ca. 3 m overføring rekkevidde. I tillegg kan den metalliske gjerder i pigpen dempe signalet og forårsake forstyrrelser. I dette tilfellet er det nødvendig å plassere antennen inne metallet bur. - Bruk en kabel trommelen for å levere satt opp med linje makt. Koble den bærbare datamaskinen, mottakeren enhet og analog til digital omformer (hvis nødvendig) for bestemte telemetri systemet som brukes.
Merk: Telemetrisystem her sendt digitale data til mottakeren. Dette kan være forskjellig for andre systemer. - Plass elektrodene, lim, Q-tips, og kluter, samt blande blokkene, på en separat tabell.
- Forberede elektrodene med kort kabler. Gjør kuttet elektrodene og loddetinn dem igjen med lengde så kort som mulig, avhengig av dyret. Kablene må være lang nok å forbinde ønsket opptak stillingene på hodet med telemetrisk EEG enheten, overføring av dataene. Kabler som er for lange må rygget og dekket med huden selvklebende silikon-elastomer. Lengre kabler som må være rygget gjøre silikon oppdateringen større og tyngre.
2. piglet
- Ta en piglet ved å flytte den på leggen eller thorax. Hold det og være klar over alle avføring eller vannlating.
- Om nødvendig Merk piglet med et nummer.
- Pakk piglet i et håndkle. Piglet vil roe. Vær oppmerksom på overoppheting av piglet.
- Hold piglet med én hånd på kroppen eller underarmen. Bruke derimot for å holde snuten. Være oppmerksom på overoppheting av piglet og kontroller at det er gratis å puste riktig.
3. elektroder
- Har noen andre fest elektrodene.
- Rengjør huden fra skitt med vann eller etanol. Eventuelt barbere hodet.
- Fjerne alle døde hudceller med en slipende EEG gel og en Q-tip. Fjerne slipende gel etterpå. Alternativt bruke sandpapir.
- Fastsette selvklebende elektrodene på ønsket plassering. Sted på bakken elektroden over lillehjernen (mellom ørene) og referanse elektroden på nesen. Plass elektroden opptak på ønsket plassering.
Merk: I dette tilfellet en Unipolare innspillingen ble utført, fordi referansen ble plassert på en nøytral posisjon (nese). Det finnes ingen standardisert system for grisunger før nå. Her ble en parietal opptak posisjon brukt (mellom øyet og øret) på den høyre hjernehalvdelen halvkulen. - Koble kablene til telemetri enheten. Aktivere enheten. Avhengig av telemetri systemet brukes, kan dette være en magnetic switch eller en radiofrekvens våkne-signal.
- Dekke telemetri enheten og alle kabler så vel som alle elektroder med to-komponent huden selvklebende silikongummi (se Tabell for materiale). Ved å blande like mye begge komponentene, herding tiden vil være i størrelsesorden 1 min. øyne og øyevipper ikke bør være dekket med gummi.
- Vent til silikongummi er fullstendig kurert.
- Sted piglet tilbake i pigpen.
- Observere piglet å se om det viser tegn på ubehag over en lengre periode (flere minutter).
4. mål
- Vent til piglet er gjenopprettet og begynner å synkronisere virkemåten med med sine søsken (fôring, spiller, sove) vanligvis etter 30 s (figur 1).
- Vent til søvn faser, om ønskelig. Tid, avhengig av spesifikke vitenskapelige spørsmål. Her, ble 10 min innspillingen brukt.
- Hvis telemetri enheten er dekket av mer enn 2 andre grisunger, kan signalet være for lav for mottakeren. Skyv grisunger bort hvis de sover på toppen. Være oppmerksom på på sår; den kan reagere aggressivt.
- Starte innspillingen med den oppkjøp programvaren (se Tabell for materiale).
5. Fullfør
- Etter innspillingen (vanligvis flere timer), ta piglet igjen som har blitt beskrevet i trinn 2. Være oppmerksom på på sår; den kan reagere aggressivt.
- Løft silikongummi på en kant. Deretter fjerne hele oppdateringen av silikongummi som inneholder elektrodene og telemetri enheten. Vær forsiktig med piglet's øyne.
- Sted piglet tilbake i pigpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi var kjøpedyktig fortegnelse typisk EEG mønstre forbundet med ikke - REM søvn, som spindel støt eller delta børster, fra fritt flytte grisunger (figur 1 og figur 2). Vi var hovedsakelig interessert i representant mønstre under ikke - REM søvn, men faser av REM-lignende søvn12 med en svært lav amplituden har også vært registrert (Figur 3). Fysiologi og mengden REM søvn variere over arter13. Kort REM fasene i rekken av noen minutter er typisk for griser14. God opptakskvalitet var også tilgjengelig under mating (amming) (Figur 4). Som for å spille oppførsel, fører sterke muskler aktivitet til muskel bruksgjenstander. men er filtre utformet for å trekke ut EEG band. Videre mulig analyseverktøy er beregninger av spectral tetthet eller analytiske verktøy fokuserer på nettverksaktivitet, som for eksempel fase-amplitude kopling. Disse analyseverktøy kan også brukes med én kanal EEG innspillinger.
Figur 1: en sovende piglet med telemetrisk EEG systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: typisk EEG mønstre registrert i søvn fasen av en fritt flyttende piglet, hviler ved sideordnede. Fire evenementer utheves boksene. Fra venstre til høyre viser den første boksen typisk oppskrifter brakt frem av muskelaktivitet. for eksempel korte rykninger under søvn, preget av store mengder rask gamma aktivitet (over 80 Hz) og en burst-aktig utseende. Den andre boksen viser en delta børste som episode, preget av delta aktivitet med lagt aktivitet i området theta og alpha. Tredje og fjerde boksene viser kort episoder av gamma pakker (sove spindel-lignende hendelser), preget av frekvens komponenter i alpha, beta og gamma bandene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: REM faser under søvn. Først og den andre boksen viser langsom-bølge søvn faser. Den tredje boksen angir en lav-amplitude EEG fase av ca 20 s varighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: 10 min EEG opptak spor av en drikking piglet (amming). Gjennom 100 s er kort tap av mellom senderen og mottakeren av EEG opptak systemet. Etterpå er det noen muskler eller bevegelse gjenstander. Muskel gjenstander er preget av svært høy delta bandet amplituder. Derimot er EEG aktivitet preget av en gradvis nedgang amplituden strøm fra langsom å rask bølger (se, for eksempel mellom 200 og 250). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En avgjørende skritt i protokollen er tilstrekkelig hudkontakt med elektrodene, spesielt bakken elektroden, å oppnå stabil opptak med lite støy. Videre siden grisunger er svært fleksibelt, er det viktig å dekke hele systemet med silikongummi å beskytte elektrodene og telemetri enheten. Videre, hvis eksperimenter er gjennomført i en stabil med en lamellbunn gulvet, være forsiktig med små enheter eller kontakter.
Ved en utilstrekkelig grep av selvklebende hydrogel elektrodene, prøve å fjerne slipende krem som mulig. En alternativ måte å fjerne det ytre død hud lag bruker sandpapir. En forbehandling med alkohol er ikke obligatorisk. Skitne huden kan også rengjøres med vann. Ikke bruk gips strimler i stedet for kroppen dobbel silikon for å reparere telemetrisk systemet. Gips strimler kan forårsake hudirritasjon og massiv tegn på ubehag. Grisunger kvitte systemet svært raskt i så fall.
En begrensning av metoden er stabilitet av hydrogel elektroder. De kan tørke etter noen timer, noe som resulterer i et tap for innspilling. Videre, som med alle EEG teknikker, sterk bevegelser er vanligvis forbundet med muskel gjenstander på opptak spor (som vist i Figur 4). Dessuten er en god plassering av antennen viktig å redusere gjenstander som kan skyldes en dårlig mottaker signal. Metall gjerder kan også forårsake høyfrekvente forstyrrelser, som resulterer i tap av data sekvenser. En løsning for dette problemet er å plassere antennen innenfor metall gjerdet i optimal posisjon. Den optimale posisjonen av antennen kan bare evalueres i feltet ved prøving og feiling. Purka og andre grisunger fører ikke til gjenstander, fordi grisunger iført systemet vanligvis ikke tillater andre grisunger å manipulere hodet. Dette kan være forskjellig for andre arter.
Metoden er spesielt viktig for translasjonsforskning tilnærminger i nevrovitenskap. Med denne teknikken er det mulig å bruke ikke-invasiv opptak uten beroligende. Resulterende EEG opptakene er svært lik klinisk setting. Teknikken kan åpne opp nye muligheter som karakteriserer tidlig EEG modning med dyremodell systemer. Utover det, kan mange neuroscientific spørsmål, særlig om kortikale feltet potensialene, også undersøkes ved denne noninvasive teknikken. Derfor har metoden muligheter for å redusere antall og alvorlighetsgrad av dyreforsøk i feltet av nevrovitenskap.
For fremtiden, er det planlagt opptak med flere elektroden. En forutsetning er miniatyrisering av elektrodene. Videre er langsiktig stabilitet elektrodene et problem for fremtidige nytenkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Helmut Scheu for muligheten til å gjennomføre vår forskning i pigpen på Hofgut Neumühle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable adhesive surface silver/silver chloride electrodes |
Spes Medica S.r.l., Genova, Italy |
Self adhesive hydrogel electrode | |
| Abralyt HiCl | Easycap GmbH | Abrasive cream | |
| Body Double fast | Smooth On Inc. | Skin adhesive silicone | |
| Telemetry system | Internal development | ||
| Picolog 1216 | Pico Technology | AD converter | |
| Laptop | Panasonic | Rugged laptop | |
| Receiver | Internal development |
References
- Conrad, M. S., Sutton, B. P., Dilger, R. N., Johnson, R. W. An in vivo three-dimensional magnetic resonance imaging-based averaged brain collection of the neonatal piglet (Sus scrofa). PLoS ONE. 9 (9), e107650 (2014).
- de Camp, N. V., Hense, F., Lecher, B., Scheu, H., Bergeler, J. Models for preterm cortical development using non invasive clinical EEG. Translational Neuroscience. 8, 211-224 (2017).
- Lapray, D., Bergeler, J., Dupont, E., Thews, O., Luhmann, H. J. A novel telemetric system for recording brain activity in small animals. Telemetry: Research, Technology and Applications. Barculo, D., Daniels, J. , Nova Science Publishers. 195-203 (2009).
- Kim, D., Yeon, C., Kim, K. Development and experimental validation of a dry non- invasive multi-channel mouse scalp EEG sensor through visual evoked potential recordings. Sensors. 17, 326 (2017).
- Moshayedi, P., et al. The relationship between glial cell mechanosensitivity and foreign body reactions in the central nervous system. Biomaterials. 35, 3919-3925 (2014).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10, 066014 (2013).
- Hellström-Westas, L., Rosén, I. Electroencephalography and brain damage in preterm infants. Early Human Development. 81, 255-261 (2005).
- Lloyd, R. O., Goulding, R. M., Filan, P. M., Boylan, G. B. Overcoming the practical challenges of electroencephalography for very preterm infants in the neonatal intensive care unit. Acta Paediatrica. , 152-157 (2015).
- Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28, 931-937 (2007).
- Iyer, K. K., et al. Cortical burst dynamics predict clinical outcome early in extremely preterm infants. Brain. 138, 2206-2218 (2015).
- Luhmann, H., de Camp, N., Bergeler, J. Monitoring brain activity in preterms: mathematics helps to predict clinical outcome. Brain. 138, 2114-2125 (2015).
- Dragomir, A., Akay, Y., Curran, A. K., Akay, M. Complexity measures of the central respiratory networks during wakefulness and sleep. Journal of Neural Engineering. 5, 254-261 (2008).
- Peever, J., Fuller, P. M. The biology of REM sleep. Current Biology. 27, R1237-R1248 (2017).
- Robert, S., Dallaire, A. Polygraphic Analysis of the sleep-wake states and the REM Sleep periodicity in domesticated pigs (Sus scrofa). Physiology & Behavior. 37 (2), 289-293 (1986).
